電融合與紫外誘導(dǎo)技術(shù)在紅景天、蘆薈和草酸青霉菌種質(zhì)改良上的應(yīng)用研究.pdf

1、細(xì)胞電融合和紫外誘變技術(shù)是發(fā)展迅速的細(xì)胞工程技術(shù),不僅為核質(zhì)相互關(guān)系、基因調(diào)控等領(lǐng)域的研究提供了有力的手段,而且已成為雜交育種、種質(zhì)創(chuàng)新的關(guān)鍵技術(shù)。本論文主要研究原生質(zhì)體電融合技術(shù)與紫外誘變技術(shù)在藥用種質(zhì)如紅景天、蘆薈和草酸青霉菌改良上的應(yīng)用。
　　 我們開(kāi)展了蘆薈與紅景天原生質(zhì)體分離、蘆薈原生質(zhì)體自體融合及兩物種間原生質(zhì)體融合的初步探討,優(yōu)化了與原生質(zhì)體分離和電融合相關(guān)的參數(shù),為蘆薈與紅景天的品種改良、優(yōu)化和良種選育提供理論支

2、持與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),同時(shí)為中藥現(xiàn)代化提供一種新途徑。首先我們優(yōu)化了原生質(zhì)體酶解條件,蘆薈在2.0％纖維素酶,0.5％果膠酶,0.5％牛白蛋白,0.1％2-氮嗎啉乙磺酸,CPW溶液(含0.6 mol/L甘露醇),pH值為5.6,25±1℃,酶解處理3 h能得到7.03×105個(gè)/mL原生質(zhì)體。而紅景天原生質(zhì)體的獲得是以黑暗條件下培養(yǎng)10 d的愈傷組織為材料,經(jīng)2.0％纖維素酶,1.0％果膠酶,0.3％離析酶,0.5％牛白蛋白,0.1％MES,C

3、PW溶液(含0.7 mol/L甘露醇),pH值為5.6的酶解液處理3 h,可得到質(zhì)量較高的原生質(zhì)體,產(chǎn)量可達(dá)2.2×105個(gè)/mL。其次對(duì)電融合條件進(jìn)行探討,在交流頻率1 MHz,交流電場(chǎng)強(qiáng)度160V/cm,交流電場(chǎng)作用時(shí)間20 s,直流脈沖強(qiáng)度0.9 kV/cm,脈沖次數(shù)為1,幅寬30μs時(shí)蘆薈原生質(zhì)體間的融合較好。利用蘆薈原生質(zhì)體初步確定融合參數(shù)后,再進(jìn)一步研究蘆薈與紅景天原生質(zhì)體間的融合,發(fā)現(xiàn)融合參數(shù)略有不同,交流頻率1 MHz,

4、交流電場(chǎng)強(qiáng)度180 V/cm,交流電場(chǎng)作用時(shí)間30 s,直流脈沖強(qiáng)度0.9 kV/cm,脈沖次數(shù)為1,脈沖寬幅30μs時(shí),融合率可達(dá)17.9％。
　　 我們以本實(shí)驗(yàn)室從銀杏葉中分離的銀杏內(nèi)生真菌草酸青霉為初始菌株,應(yīng)用紫外誘變的方法,通過(guò)初篩與復(fù)篩,得到一株高產(chǎn)纖維素酶的草酸青霉菌突變株P(guān)O1M。經(jīng)多次繼代測(cè)定酶活,證實(shí)該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性,并在生長(zhǎng)形態(tài)、產(chǎn)酶能力及DNA分子水平對(duì)初始菌株與突變株進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)兩者具有明顯

5、差異。利用RAPD標(biāo)記,選取10個(gè)隨機(jī)引物對(duì)初始菌株及突變株的DNA樣品分析,發(fā)現(xiàn)引物G02能獲得穩(wěn)定多態(tài)、條數(shù)較多且清晰的條帶,突變株P(guān)O1M與初始菌株的條帶具有明顯差異,說(shuō)明突變株在DNA分子水平上發(fā)生變異。該部分還通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn),優(yōu)化了該突變株產(chǎn)酶的最佳液體發(fā)酵條件,最終確定培養(yǎng)基組分為馬鈴薯20.0％,結(jié)晶纖維2.0％,蛋白胨0.5％,KH2PO40.3％,MgSO40.15％,維生素B10.001％,自然pH；最佳發(fā)酵條件為溫