青藏高原特有植物墊狀點地梅的種群遺傳結(jié)構(gòu)——基于微衛(wèi)星和葉綠體單倍型分析.pdf

1、青藏書原獨特的地理特征和氣候變化與該地區(qū)植物物種遺傳多樣性的空間分布格局的形成過程具有不可分割的聯(lián)系。對該地區(qū)植物物種的遺傳結(jié)構(gòu)、空間分布格局及其成因的研究能夠增進我們對植物的進化和生態(tài)過程,以及該地區(qū)過去地質(zhì)氣候變化過程的理解。以墊狀點地梅(AndrosacetapeteMaxim)為例,它是報春花科點地梅屬的一種多年生草本植物,分布于高寒草原和高原草甸之上,是地球上海拔分布最高的被子植物之一,同是也是青藏書原上特有的分布最廣,數(shù)量最

2、大的一類墊狀植物,是我們研究物種遺傳多樣性和青臧高原的高寒生態(tài)系統(tǒng)、地質(zhì)和氣候環(huán)境變化歷史事件的理想材料。
　　本文利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記和葉綠體非編碼區(qū)基因序列來分析墊狀點地梅的遺傳結(jié)構(gòu)和進化潛力,評估墊狀點地梅對氣候變暖的響應(yīng)能力,探討影響或造成墊狀點地梅空間遺傳結(jié)構(gòu)的生物學(xué)、地質(zhì)事件和氣候環(huán)境變化歷史過程。旨在通過對墊狀點地梅的遺傳多樣性和空間遺傳結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)研究,為更好的保護和修復(fù)青藏高原高寒的生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能完整性提供有價

3、值的基礎(chǔ)數(shù)據(jù);結(jié)合青藏高原第四紀(jì)氣候變遷歷史,推測墊狀點地梅第四冰期的可能避難所以及種群的擴散路線,通過模擬數(shù)據(jù)和墊狀點地梅數(shù)據(jù)分析不同抽樣策略(抽樣大小和抽樣方法)對研究精細(xì)尺度的空間遺傳結(jié)構(gòu)的影響,為研究墊狀點地梅的繁殖和擴散行為提供可靠的方法。主要結(jié)果如下:
　　(1)通過磁珠富集法篩選墊狀點地梅的微衛(wèi)星分子標(biāo)記基因組DNA后,用Rsal限制性內(nèi)切酶酶切并連接接頭,再用接頭引物進行PCR擴增,得到的擴增產(chǎn)物與生物素標(biāo)記的(A

4、C)15,(AT)15,(CT)12,(ATC)10和(CCA)10探針雜交,雜交復(fù)合物用鏈親和素包裹磁珠進行吸附,得到微衛(wèi)星單鏈目標(biāo)DNA片段,經(jīng)PCR擴增,連接PMD19-T載體,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌,得到微衛(wèi)星富集小插入片段DNA文庫。經(jīng)陽性克隆和測序分析得到16個有效的微衛(wèi)星序列,重復(fù)堿基數(shù)以雙核苷重復(fù)最為常見,其中又以(GA)n/(CT)n重復(fù)最多,還觀察到ATG、TCT重復(fù)單位。完美型(重復(fù)次數(shù)8～17次)的微衛(wèi)星有9個,占

5、56.25％;非完美型的微衛(wèi)星有5個,占31.25％;混合型的微衛(wèi)星有2個,占12.5％。這些序列在GenBank上的登錄號分別是:FJ824648～FJ824656、GQ121408～GQ121415。16個有效的微衛(wèi)星位點成功設(shè)計了16對引物,經(jīng)用48個受試樣本進行初步篩選,16對均表現(xiàn)出多態(tài)性,其中8個微衛(wèi)星位點符合Hardy-Weinberg平衡。
　　(2)應(yīng)用6對微衛(wèi)星引物研究了唐古拉山兩側(cè)的墊狀點地梅種群的遺傳多樣性

6、、遺傳結(jié)構(gòu)和有效種群歷史動態(tài)過程。在8個采樣種群中,共檢測到31.8個等位基因,觀察等位基因數(shù)為3～9.87個,等位基因豐富度為4.484～5.577,平均期望雜合度(HE)為0.579～0.659,平均觀察雜合度(HO)為0.335～0.547,墊狀點地梅總體表現(xiàn)為顯著的雜合子缺失,近交系數(shù)為0.313;在4個種群中檢測到連鎖不平衡現(xiàn)象;墊狀點地梅種群間的遺傳分化程度很低,遺傳分化系數(shù)Fst=0.028和Rst=0.026,而且AMO

7、VA結(jié)果表明超過95％以上遺傳變異發(fā)生在種群內(nèi);雖然8個種群內(nèi)都發(fā)生了近交繁殖(Fis為0.233～0.430),但墊狀點地梅種群間的基因交流仍很頻繁(Nm＞1),主坐標(biāo)分析、距離法(NJ)和貝斯法(MCMC)的聚類分析結(jié)果顯示墊狀點地梅個體間混合程度較高,唐古拉山兩側(cè)的墊狀點地梅種群間的基因交流并沒有受到地理阻礙;用Mantel檢驗表明隨著地理距離與遺傳距離之間是顯著相關(guān)的,即能表現(xiàn)出一定的地理隔離(isolationbydistan

8、ce)特征,但用地理距離來預(yù)測遺傳距離會產(chǎn)生很大的誤差。8個種群中有5個顯著偏離期望漂移一突變平衡,可能近期經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng),位點顯著偏離Hardy-Weinberg平衡,雜合度不足(P＜0.05)以及連鎖不平衡的存在也間接支持這一結(jié)論。但瓶頸效應(yīng)并沒有顯著影響墊狀點地梅的遺傳多樣性。墊狀點地梅種群內(nèi)較高的遺傳多樣性表明這些瓶頸事件發(fā)生的時間不是很長,短期瓶頸對遺傳多樣性影響不大。
　　(3)對墊狀點地梅的52個種群414個體的葉綠

9、體trnL-trnF和rps16基因區(qū)間進行了PCR擴增片段的全序列測定,葉綠體trnL-trnF和rps16分別得到12和21個單倍型,經(jīng)分區(qū)同質(zhì)性檢驗后將兩基因合并分析,得到34種單倍型,特有的單倍型占總的單倍型的比例都很高,都達到58％以上。其中倍型系統(tǒng)發(fā)育樹和Network圖表明52個種群分為主要分為兩大分支和一小分支,其中一大分支的單倍型主要分布那曲地區(qū)南部與山南地區(qū)北部之間和日喀則地區(qū)的吉隆附近,另一大分支單倍型分布除山南地

10、區(qū)外的所有采樣區(qū)域,而一小分支的單倍型分布在青海的稱多種群、西藏的那曲地區(qū)南部和山南地區(qū)北部之間的高原臺面。無論是單個葉綠體單倍型分析還是兩葉綠體聯(lián)合的AMOVA分析結(jié)果都一致支持墊狀點地梅的遺傳變異主要存在種群間,占總遺傳變異64％以上,葉綠體rps16片段和兩基因聯(lián)合得到的NST顯著大于GST(P＜0.05),顯示墊狀點地梅存在顯著的譜系地理結(jié)構(gòu),但SAMOVA對所有的種群進行分組,無論是單個葉綠體基因片段還是兩個葉綠體基因片段聯(lián)合

11、三個結(jié)果都檢測不到有意義的K值,推測因兩兩種群間的分化很大,大部分種群在擁有廣布的單倍型的同時也擁有一個或兩個以上獨特的單倍型,這樣獨特的譜系地理結(jié)構(gòu)導(dǎo)致不能有效根據(jù)地理距離分組。我們在研究中推測墊狀點地梅可能有多個避難所,位于藏南谷地特別是山南地區(qū)和位于青海地區(qū)稱多地區(qū);種群歷史動態(tài)分析表明墊狀點地梅在末次冰期的間冰期或間冰段可能有過一次種群擴張,并產(chǎn)生和留下了豐富的遺傳多樣性較高的單倍型,在隨后的冰期對墊狀點地梅存高原面上的種群可能

12、沒有影響,形成了在青藏高原地區(qū)現(xiàn)存的特有的分布格局。
　　(4)目前高山植物精細(xì)尺度的空間遺傳結(jié)構(gòu)(SGS)的研究越來越得到重視,這種空間遺傳結(jié)構(gòu)可以通過種子和花粉的分散推斷出。然而,對SGS的估計更多的取決于抽樣策略,包括抽樣的大小和空間抽樣方法。在本研究中,我們研究了抽樣大小和三種空間抽樣策略(隨機抽樣策略,樣線抽樣策略和隨機聚簇抽樣策略)對點地梅SGS估計的影響,點地梅是青藏書原特有的高山墊狀植物。使用了真實和模擬的顯性分子