兩種經(jīng)濟(jì)貝類和刺參微衛(wèi)星-著絲粒作圖及遺傳圖譜的整合.pdf

1、我國(guó)是海水養(yǎng)殖大國(guó)，海洋貝類的養(yǎng)殖在我國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)中占有非常重要的地位。櫛孔扇貝(Chlamys farreri)和皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的兩種重要海洋貝類。近幾年來(lái)，我們?cè)趪?guó)際合作和基金項(xiàng)目的支持下，對(duì)櫛孔扇貝和皺紋盤鮑等海洋貝類的雌核發(fā)育進(jìn)行了系統(tǒng)研究，探明了雌核發(fā)育機(jī)理以及雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，確立了皺紋盤鮑和櫛孔扇貝雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)的有效程序，查清了雌核發(fā)育二倍體的

2、生長(zhǎng)和存活特點(diǎn)。本研究以這兩種貝類為研究材料，開發(fā)了櫛孔扇貝和皺紋盤鮑的多重PCR擴(kuò)增體系，用大量的微衛(wèi)星和AFLP等分子標(biāo)記研究了這兩種貝類雌核發(fā)育二倍體的遺傳學(xué)特性，查清了貝類雌核發(fā)育的近交程度，利用雌核發(fā)育二倍體家系和兩個(gè)微衛(wèi)星連鎖圖譜上的大部分標(biāo)記及新篩選標(biāo)記的半四分體分析，構(gòu)建了這兩種貝類較高密度微衛(wèi)星-著絲粒圖譜，并與遺傳圖譜進(jìn)行整合，定位了個(gè)連鎖群中著絲粒的位置。此外，我們還分析了重要的海水養(yǎng)殖種類刺參的雌核發(fā)育二倍體遺傳

3、學(xué)特性，完成了刺參遺傳連鎖圖譜部分連鎖群著絲粒的定位。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.櫛孔扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記多重PCR的開發(fā)
　　 通過單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增，6％聚丙酰胺變性凝膠電泳檢測(cè)微衛(wèi)星的特異性擴(kuò)增條帶，查清各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的最佳PCR擴(kuò)增條件。挑選引物序列間互不干擾、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度不重疊、退火溫度接近的2-3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行多元PCR組合的篩選。本實(shí)驗(yàn)開發(fā)了4組櫛孔扇貝高多態(tài)性微衛(wèi)星多重PCR擴(kuò)增體系，提高了基因分型效率。

4、利用CERVUS3.0軟件對(duì)12個(gè)櫛孔扇貝全同胞家系360個(gè)子代進(jìn)行家系鑒定，驗(yàn)證了這4組微衛(wèi)星多重PCR家系鑒定效率。結(jié)果表明，144個(gè)基因型數(shù)據(jù)中4.9％的微衛(wèi)星位點(diǎn)出現(xiàn)偏分離，無(wú)效等位基因出現(xiàn)的頻率為14.8％，平均多態(tài)信息含量為0.872。家系鑒定分析顯示，一組微衛(wèi)星多重PCR鑒定成功率為75％，兩組鑒定成功率達(dá)到100％。
　　 2.櫛孔扇貝雌核發(fā)育二倍體遺傳學(xué)特性研究
　　 通過紫外線照射精子并用細(xì)胞松弛素B

5、(CB)抑制減數(shù)分裂第二極體釋放誘導(dǎo)了3個(gè)櫛孔扇貝雌核發(fā)育二倍體家系，研究了27個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在3個(gè)雌核發(fā)育家系中的分離，進(jìn)行了微衛(wèi)星-著絲點(diǎn)重組率分析，通過雜合后代的比例計(jì)算出重組率y的范圍是0.05到0.78，平均值為0.41，發(fā)現(xiàn)在櫛孔扇貝的某些染色體上存在交叉干涉現(xiàn)象。假設(shè)完全干涉的條件下，計(jì)算出微衛(wèi)星-著絲點(diǎn)距離范圍是3 cM-39 cM。估算出櫛孔扇貝雌核發(fā)育子一代的近交系數(shù)為0.59。在3個(gè)對(duì)照組家系中這27個(gè)位點(diǎn)全部符合孟

6、德爾遺傳規(guī)律，其中9個(gè)位點(diǎn)存在無(wú)效等位基因。而在3個(gè)雌核發(fā)育組中，在CF01，CF02，CF17和CFMSP009這4個(gè)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)兩類純合子的比例偏離1:1。分析的所有雌核發(fā)育后代都只有母本的等位基因，沒有發(fā)現(xiàn)父本特異等位基因，說明本實(shí)驗(yàn)用的雌核發(fā)育子代100％為雌核發(fā)育個(gè)體。
　　 3.櫛孔扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記-著絲粒作圖及與遺傳圖譜的整合
　　 著絲粒作圖是進(jìn)一步完善連鎖圖譜，研究染色體的交叉以及查明減數(shù)分裂過程中交叉干涉情

7、況的重要工具。從已發(fā)表的櫛孔扇貝遺傳連鎖圖譜所有19個(gè)連鎖群中挑選了137個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，利用對(duì)照組篩選出90個(gè)母本雜合的微衛(wèi)星標(biāo)記，研究了這90個(gè)微衛(wèi)星在3個(gè)雌核發(fā)育二倍體家系中的分離，每個(gè)家系60個(gè)雌核發(fā)育子代，通過半四分體分析，完成了19個(gè)連鎖群的微衛(wèi)星-著絲粒作圖及與遺傳圖譜的整合。對(duì)照組分析結(jié)果顯示，90個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)全部符合孟德爾遺傳，而雌核發(fā)育組中有4.4％的標(biāo)記偏離兩類純合子1:1分離比。第二次分裂分離比y值范圍是0.033

8、至0.778，平均值是0.332，證實(shí)了櫛孔扇貝某些染色體中存在交叉干涉現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)在至少兩個(gè)家系有分離的42個(gè)標(biāo)記中有1個(gè)在不同家系間有差異，表明個(gè)別位點(diǎn)在不同家系間的基因-著絲粒重組率有所差異。著絲粒定位結(jié)果基本符合櫛孔扇貝染色體核型，但在連鎖圖譜和著絲粒圖譜中發(fā)現(xiàn)一些位點(diǎn)順序有所不同。本研究使櫛孔扇貝遺傳連鎖圖譜上的信息更加完善，可作為基因組研究富有信息的工具，并為將來(lái)扇貝著絲粒結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 4.皺紋盤鮑

9、微衛(wèi)星標(biāo)記多重PCR的開發(fā)
　　 通過對(duì)單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增，6％聚丙酰胺變性凝膠電泳檢測(cè)微衛(wèi)星的特異性擴(kuò)增條帶，查清了各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的最佳PCR擴(kuò)增條件。對(duì)篩選出的具有清晰擴(kuò)增產(chǎn)物，特異性好的位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)的組合擴(kuò)增，通過優(yōu)化退火溫度、反應(yīng)體系、引物濃度等條件摸索出最佳擴(kuò)增條件。根據(jù)不同微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶亮度，調(diào)整引物添加量，最終達(dá)到較一致的擴(kuò)增效率。本實(shí)驗(yàn)開發(fā)了4組皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai

10、)微衛(wèi)星多重PCR擴(kuò)增體系，提高了基因分型效率。運(yùn)用CERVUS3.0軟件對(duì)12個(gè)皺紋盤鮑全同胞家系的372個(gè)子代進(jìn)行家系鑒定，驗(yàn)證了這4組微衛(wèi)星多重PCR在家系鑒定中的效率，發(fā)現(xiàn)有4.9％的微衛(wèi)星出現(xiàn)偏分離，無(wú)效等位基因頻率為10.6％，平均多態(tài)信息含量為0.82。僅用1組微衛(wèi)星多重PCR模擬和家系鑒定的成功率分別為86％和90％，兩組則達(dá)到100％。結(jié)果表明，微衛(wèi)星多重PCR技術(shù)能準(zhǔn)確地把任意子代鑒定到各個(gè)家系，可以滿足大批量家系材

11、料的分析，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。
　　 5.皺紋盤鮑雌核發(fā)育二倍體遺傳學(xué)特性研究
　　 利用全基因組擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)皺紋盤鮑雌核發(fā)育二倍體面盤幼蟲的DNA進(jìn)行了基因組擴(kuò)增，分析了654個(gè)AFLP標(biāo)記的遺傳特性，比較了AFLP和微衛(wèi)星標(biāo)記在染色體上的分布情況。利用AFLP標(biāo)記在全基因組水平評(píng)價(jià)了雌核發(fā)育的近交效率以及交叉干涉的頻率和強(qiáng)度。所用654個(gè)AFLP標(biāo)記全部符合3:1孟德爾分離比，第二次分裂分離頻率y的范圍是0.00到0

12、.96，其中23.9％的y值大于0.67，證明皺紋盤鮑中存在交叉干涉現(xiàn)象。654個(gè)AFLP標(biāo)記平均重組率y為0.45，固定指數(shù)為0.55，說明減數(shù)分裂雌核發(fā)育是加快皺紋盤鮑基因純合程度的有效手段。在完全干涉條件下，AFLP標(biāo)記-著絲粒遺傳距離范圍是0.0-47.8 cM。AFLP標(biāo)記-著絲粒重組率y從0到1均勻分布，且沒有發(fā)現(xiàn)明顯的成簇分布。僅有少量標(biāo)記(4.4％)重組率y大于0.9，說明皺紋盤鮑的交叉干涉程度較低或?yàn)橹械人?。本?shí)驗(yàn)首

13、次利用海洋貝類幼蟲的全基因組擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)了貝類幼蟲的AFLP標(biāo)記半四分體分析，研究結(jié)果為今后皺紋盤鮑的遺傳改良和選擇育種計(jì)劃提供了重要參考。
　　 6.皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記-著絲粒作圖及與遺傳圖譜的整合
　　 利用紫外線照射精子并用細(xì)胞松弛素B(CB)抑制第二極體排放構(gòu)建了2個(gè)皺紋盤鮑第二極體抑制型雌核發(fā)育二倍體家系，從皺紋盤鮑微衛(wèi)星連鎖圖譜上挑選了115個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行引物合成，利用2個(gè)家系篩選出母本雜合的微衛(wèi)星位點(diǎn)97

14、個(gè)，僅用符合孟德爾分離規(guī)律的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行微衛(wèi)星-著絲粒作圖，通過半四分體分析，定位了18個(gè)連鎖群著絲粒的位置，實(shí)現(xiàn)了著絲粒圖譜與遺傳圖譜的完全整合，并發(fā)現(xiàn)了皺紋盤鮑中存在復(fù)雜的交叉現(xiàn)象。微衛(wèi)星一著絲粒重組率范圍是0.037至0.950，平均值是0.399，說明存在交叉干涉現(xiàn)象。計(jì)算出固定指數(shù)為0.6，是一代全同胞交配近交程度的2.4倍，說明雌核發(fā)育是加快皺紋盤鮑純合程度的有效方法。對(duì)照組分析結(jié)果顯示，97個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)都符合孟德爾遺傳，

15、而雌核發(fā)育組中有5.2％的標(biāo)記偏離兩類純合子1:1分離比。發(fā)現(xiàn)了不同連鎖群交叉分布不一致現(xiàn)象。著絲粒位置大部分與核型一致，但在連鎖圖譜和著絲粒圖譜中發(fā)現(xiàn)個(gè)別位點(diǎn)的位置明顯不同。通過對(duì)LG2連鎖群上的4個(gè)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，進(jìn)行了皺紋盤鮑染色體的交叉分布研究和連鎖分析。雌核發(fā)育A家系中共54個(gè)個(gè)體4個(gè)位點(diǎn)的基因型沒有缺失，共108條染色體，其中44個(gè)無(wú)交叉(40.7％)，23個(gè)單交叉(21.3％)，37個(gè)雙交叉(34.3％)和4個(gè)三

16、交叉(3.7％)。然而，對(duì)LG6上的4個(gè)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行同樣分析得到了較低的交叉重組率，其中111個(gè)無(wú)交叉(61.7％)，54個(gè)單交叉(30％)，12個(gè)雙交叉(6.7％)和3個(gè)三交叉(1.6％)。結(jié)果表明，皺紋盤鮑不同連鎖群的交叉頻率和交叉分布都有所不同，皺紋盤鮑中存在交叉干涉現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中微衛(wèi)星標(biāo)記與著絲粒之間相對(duì)距離的信息對(duì)遺傳連鎖圖譜著絲粒的整合有重要意義。
　　 7.刺參雌核發(fā)育二倍體人工誘導(dǎo)
　　 紫外線照射

17、使精子遺傳物質(zhì)失活，用細(xì)胞松弛素B(CB)處理受精卵抑制第二極體釋放，誘導(dǎo)刺參雌核發(fā)育二倍體。用強(qiáng)度為2561μw/(cm2·s)的紫外線(254 nm)照射不同時(shí)間的精子與正常卵子受精。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨照射時(shí)間的增加，卵裂率、早期胚胎存活率和小耳幼蟲發(fā)生率逐漸減低，照射30 s時(shí)小耳幼蟲發(fā)生率降為0。受精后35 min，顯微鏡下觀察到有20～30％受精卵排出第1極體時(shí)，用濃度0.5μg/ml的CB持續(xù)處理受精卵20 min，誘導(dǎo)出刺參第二極

18、體抑制型雌核發(fā)育二倍體，雌核發(fā)育二倍體發(fā)育速度低于正常二倍體。微衛(wèi)星分析表明，雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)率為93.3％。
　　 8.刺參雌核發(fā)育二倍體遺傳學(xué)特性研究
　　 通過紫外線照射使精子遺傳物質(zhì)失活，用細(xì)胞松弛素B(CB)處理受精卵抑制第二極體釋放，成功誘導(dǎo)出2個(gè)刺參雌核發(fā)育二倍體家系。選用了43個(gè)刺參微衛(wèi)星標(biāo)記，通過半四分體分析，利用2個(gè)刺參雌核發(fā)育二倍體家系進(jìn)行了微衛(wèi)星-著絲粒作圖。對(duì)照組分析結(jié)果顯示，只有1個(gè)微衛(wèi)星位

19、點(diǎn)(2.3％)偏離孟德爾遺傳規(guī)律，而在雌核發(fā)育組中，有2個(gè)位點(diǎn)(AH058和AH130)偏離兩類純合子1:1分離比。微衛(wèi)星-著絲粒重組率范圍在0.00至0.80，平均值是0.21，固定指數(shù)為0.79。微衛(wèi)星分析結(jié)果表明，刺參中存在較弱的交叉干涉現(xiàn)象。固定指數(shù)0.79是一代全同胞交配近交程度(0.25)的3.2倍，說明減數(shù)分裂雌核發(fā)育可能是刺參快速建立純系的有效途徑。假設(shè)完全干涉的條件下，計(jì)算出微衛(wèi)星-著絲點(diǎn)之間的遺傳距離范圍是0-40

20、cM。通過半四分體分析，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與著絲粒緊密連鎖的標(biāo)記，分別是AH028和AH112。本研究定位了2個(gè)雄性連鎖群LG3和LG20中著絲粒的位置，實(shí)現(xiàn)了刺參遺傳連鎖圖譜部分連鎖群著絲粒位置的整合。
　　 綜上，本研究構(gòu)建了櫛孔扇貝和皺紋盤鮑中高密度微衛(wèi)星-著絲粒圖譜，并將微衛(wèi)星-著絲粒圖譜與微衛(wèi)星連鎖圖譜進(jìn)行整合，確定了連鎖群中著絲粒位置。本研究進(jìn)一步改善了現(xiàn)有遺傳連鎖圖譜，為今后開展與物理圖譜的整合奠定了重要基礎(chǔ)。通過雌核發(fā)育