青海省部分地區(qū)冬蟲(chóng)夏草遺傳多樣性RAPD分析.pdf

1、冬蟲(chóng)夏草為傳統(tǒng)名貴中藥材。冬蟲(chóng)夏草資源在青海省的分布區(qū)主要是在青南高原的玉樹(shù)、果洛二州，在青海中部也有分布。本論文采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)青海省不同產(chǎn)地的20份冬蟲(chóng)夏草樣品進(jìn)行了多態(tài)性分析和聚類(lèi)比較，從而為我省冬蟲(chóng)夏草資源在遺傳多樣性保護(hù)，分類(lèi)研究，遺傳圖譜構(gòu)建等方面積累了資料，為其他藥用物種進(jìn)行RAPD實(shí)驗(yàn)提供參考和借鑒。通過(guò)研究，取得了以下進(jìn)展：
　　 1.對(duì)分別用SDS法、改良CTAB法兩種方法提取的冬蟲(chóng)夏草基因組DNA

2、，進(jìn)行電泳檢測(cè)和紫外分光光度的檢測(cè)。結(jié)果表明兩種方法均可獲得完整的冬蟲(chóng)夏草基因組DNA，但是改良CTAB法提取的冬蟲(chóng)夏草DNA質(zhì)量較好，電泳檢測(cè)的譜帶清晰穩(wěn)定，無(wú)降解。同時(shí)采用改良CTAB法提取的DNA的OD260/OD280值相對(duì)較好，間于1.6-2.0之間，說(shuō)明DNA質(zhì)量較好。因此，通過(guò)以上2種方法的對(duì)比可以選擇了改良的CTAB法進(jìn)行冬蟲(chóng)夏草DNA基因組的提取。
　　 2.實(shí)驗(yàn)對(duì)PCR反應(yīng)體系中5個(gè)重要因子進(jìn)行了正交試驗(yàn)，篩

3、選出最優(yōu)的反應(yīng)體系，并在此最優(yōu)體系的基礎(chǔ)上，分別對(duì)退火溫度、擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，得到了RAPD反應(yīng)合理的熱力學(xué)程序，確定了一套優(yōu)化的冬蟲(chóng)夏草RAPD反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增條件。通過(guò)正交試驗(yàn)得到了冬蟲(chóng)夏草RAPD-PCR的最佳擴(kuò)增體系為：20μl總反應(yīng)體系中包含，35 ng模板DNA，2.0 U Taq酶，0.4μmol/L引物，0.2 mmol/LdNTPs，1.5 mmol/L Mg2+。其熱循環(huán)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min之

4、后進(jìn)行40次循環(huán)，94℃變性60 S，37℃退火1 min，72℃延伸2 min。最后72℃延伸5 min，保存于4℃。
　　 3.用40個(gè)隨機(jī)引物對(duì)20份冬蟲(chóng)夏草樣品進(jìn)行了RAPD分析，成功地篩選出了9個(gè)適合于冬蟲(chóng)夏草RAPD分析的隨機(jī)引物，這些引物可以擴(kuò)增出豐富清晰的條帶。這9個(gè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，共檢測(cè)到65個(gè)位點(diǎn)，平均每條引物檢測(cè)到7.2個(gè)位點(diǎn)，其中呈多態(tài)性位點(diǎn)57個(gè)，平均多態(tài)性條帶數(shù)為6.3條，多態(tài)性位點(diǎn)比率P為87

5、.69％，9個(gè)引物的多態(tài)位點(diǎn)比率從75％-100％不等。
　　 4.根據(jù)隨機(jī)引物對(duì)20個(gè)冬蟲(chóng)夏草樣品的擴(kuò)增結(jié)果構(gòu)建0/1矩陣，在NTSYS軟件上計(jì)算出各品種間的相似系數(shù)，品種間的相似系數(shù)決定了品種間的親緣關(guān)系，相似系數(shù)越大，親緣關(guān)系越近。20個(gè)冬蟲(chóng)夏草樣品間的相似系數(shù)介于0.1818-0.9876之間。其中樣品18和20的相似系數(shù)最大為0.9876，表明兩者親緣關(guān)系最近。聚類(lèi)分析結(jié)果表明：五個(gè)樣地的20個(gè)樣品，每個(gè)樣地的樣品均聚