小葉錦雞兒SSR引物開發(fā)及遺傳多樣性研究.pdf

1、小葉錦雞兒(Caragana microphylla Lam.)為豆科錦雞兒屬多年生飼用灌木，多分布于中國(guó)東北及內(nèi)蒙古、河北、山西，陜西，山東等地；蒙古、西伯利亞也有分布。因其耐干旱、低溫、能抗風(fēng)沙，再生力強(qiáng)，耐瘠薄等特性而成為我國(guó)東北、西北地區(qū)良好的飼用灌木和生態(tài)保護(hù)先鋒植物，具有極大的開發(fā)利用潛力。
　　 本研究所用材料為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所種質(zhì)資源研究室提供的10個(gè)內(nèi)蒙古中東部野生小葉錦雞兒居群。利用ISSR-

2、PCR技術(shù)開發(fā)小葉錦雞兒SSR多態(tài)性引物，并利用所篩選引物進(jìn)行小葉錦雞兒遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)研究。主要結(jié)果如下：
　　 1.選用四種ISSR引物(S1：(AG)10、S2：(AC)10、S3：(GA)10、S4：(CA)10)分別開發(fā)小葉錦雞兒SSR引物，分別得到引物30對(duì)、0對(duì)、9對(duì)、4對(duì)，其產(chǎn)率相應(yīng)為13.16％；0.00％；11.11％；9.09％，總產(chǎn)率為11.17％。從所開發(fā)結(jié)果看，小葉錦雞兒基因組中含有大量的(AG)

3、n片段，而(AC)n片段則相對(duì)很少；本次開發(fā)引物效率較傳統(tǒng)方法高，但成本較大，需經(jīng)兩次測(cè)序和三次引物合成。
　　 2.為建立適宜小葉錦雞兒SSR-PCR的反應(yīng)體系，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16(45)，對(duì)模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶的濃度進(jìn)行五因素四水平優(yōu)化篩選，確立了最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。即在25μL反應(yīng)體系中包括：40ng模板DNA，3 mmol/LMg2+，300μmol/LdNTP，0.6μmo

4、l/L引物，1U Taq DNA聚合酶，1×Buffer。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃10 min；94℃45s，65℃1min，72℃1 min，10個(gè)循環(huán)，每循環(huán)的復(fù)性溫度遞減1℃;94℃45 s，55℃1 min，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。
　　 3.應(yīng)用上述優(yōu)化體系對(duì)自行開發(fā)的SSR引物進(jìn)行PCR篩選，共得到有效擴(kuò)增引物37對(duì)，占總開發(fā)引物的86.05％，其中多態(tài)性引物21對(duì)，占有效擴(kuò)增引物的56

5、.76％，占總開發(fā)引物的48.84％。其余引物有5對(duì)(11.63％)得到擴(kuò)增，但沒有一致性，也與目的片段相差很大，最后有1對(duì)(2.32％)沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，其原因可能為設(shè)計(jì)引物時(shí)所選用的序列為基因突變的片段。
　　 4.從21對(duì)多態(tài)性引物中選了10對(duì)進(jìn)行小葉錦雞兒遺傳多樣性研究，共檢測(cè)到等位基因175個(gè)，He值在0.602-0.859之間，具有高多態(tài)性；10個(gè)居群的Nei基因多樣性指數(shù)(H)變幅為0.683-0.830，平均為0.7