萵苣和美麗異木棉的胚囊細胞分離.pdf

1、被子植物具有獨特的雙受精現象，姊妹精細胞中的一個與卵細胞結合發(fā)育成胚，另一個與中央細胞結合發(fā)育成胚乳。受精過程中，精細胞通過花粉萌發(fā)的花粉管進入胚囊，繼而完成雙受精。整個受精過程都是在由體細胞組織形成的花柱、子房和胚珠內完成。因而對于研究受精機理問題形成了障礙。將高等植物的精、卵細胞和其他胚囊細胞分離出來，在體外誘導精、卵融合及對人工合子和其他胚囊細胞的培養(yǎng)再生植株將可克服體細胞組織的障礙，從而進行細胞和分子水平的研究，達到揭示被子植物

2、受精機理的目的。在本實驗中，我們選取了萵苣和美麗異木棉兩種不同的植物作為研究材料，分別成功分離得到了一定數量的具有生活力的卵細胞、助細胞、中央細胞等胚囊細胞，以及合子、二胞原胚、四胞原胚等早期原胚細胞，為開展研究這兩種植物的受精機理掃清了主要障礙。
　　 1．萵苣胚囊細胞及早期原胚的分離：萵苣為一室子房，具有一個倒生胚珠，其胚囊成熟時只剩下4個胚囊細胞，包括一個卵細胞、兩個助細胞和一個中央細胞，反足細胞已完全退化。兩個助細胞極性

3、相同，有時還能觀察到絲狀器結構，而中央細胞體積最大，因而很容易辨別出各個胚囊細胞的身份。根據萵苣的開花規(guī)律，選取了開花前一天，開花當天及開花第二天的花，采用酶解——解剖的方法進行分離。從開花前一天至開花第二天的花中均能分離出一定數目的卵細胞，但是卵細胞狀態(tài)表現出差異：隨著時間的向后延長，卵細胞液泡化程度增加，極性愈強。開花第二天的花中已很少能分離出助細胞，推測已退化。而中央細胞在開花后6h的花中也很難分離出，可能已經發(fā)生受精。從開花后6

4、h的花中分離得到合子，其體積與卵細胞相比明顯縮小，而且活性熒光分布均勻。在此基礎上，我們還進一步分離出萵苣早期原胚細胞，包括二胞原胚，四胞原胚，五胞原胚及多細胞原胚。四胞原胚和五胞原胚的形成說明萵苣原胚階段細胞分裂方式的多樣性。萵苣卵細胞、助細胞、中央細胞、合子、二胞原胚、四胞原胚、五胞原胚和多細胞原胚的分離，為體外研究卵細胞至多細胞原胚的發(fā)育提供了很好的實驗基礎。分離得到的大量生活卵細胞還可為構建萵苣卵細胞cDNA文庫、研究卵細胞發(fā)育

5、的分子生物學特性提供基本材料。
　　 2．美麗異木棉卵細胞和助細胞的分離：美麗異木棉為木本植物，花單生。實驗中，我們采用酶解——解剖的方法成功分離得到大量的卵細胞和助細胞。美麗異木棉的卵細胞呈空泡狀，從胚囊釋放出來后極易飄至液面，而對其進行FDA活性染色可以清楚地觀察到位于細胞周邊的細胞核，可能是受到大液泡的擠壓所致。對開花第一天至第四天花中分離的卵細胞體積進行測量，沒有發(fā)現顯著差異。將分離的卵細胞收集，進行細胞和分子生物學方面