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文檔簡(jiǎn)介
1、毒死蜱是一種廣譜性有機(jī)磷殺蟲劑,被廣泛用于農(nóng)業(yè)和城市衛(wèi)生害蟲的防治。同時(shí)毒死蜱也是一種持久性污染物,其殘留對(duì)環(huán)境和人類健康有很大的危害。尋求高效、安全、經(jīng)濟(jì)的農(nóng)藥殘留生物降解處理新技術(shù),解決病蟲害防治用藥與農(nóng)藥殘留的矛盾,是科研工作者需要迫切解決的科研命題。本實(shí)驗(yàn)對(duì)已分離得到的毒死蜱高效降解菌,玫瑰紅紅球菌(Rhodococcus thodochrous) HW-D3菌株,進(jìn)行降解基因的克隆,為構(gòu)建基因工程菌做好前期研究。
2、 實(shí)驗(yàn)采用SDS-蛋白酶K法提取D3菌基因組DNA,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有明顯的RNA污染,加1μl RNase酶后可有效去除RNA,所提取基因組DNA片段大于15kb。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)基因組DNA的OD260為0.102、OD280為0.055,經(jīng)計(jì)算,濃度為0.5151μg/ul;其OD260/OD280為1.8545,在1.8~2.0之間,沒(méi)有蛋白質(zhì)和RNA的污染。由此可看出本研究制備的基因組的DNA片段完整、純度
3、高、濃度大,可以滿足構(gòu)建基因組文庫(kù)的要求。采用同樣的方法分別提取培養(yǎng)12 h、24 h、36 h的D3菌基因組DNA,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),培養(yǎng)24h所提的基因組條帶最亮。
本研究采用能切割4個(gè)核苷酸序列的內(nèi)切限制酶Sau3AⅠ酶(8U/μl)對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切,研究發(fā)現(xiàn)倍比稀釋內(nèi)切酶的方法比較容易尋找到最佳酶量,結(jié)果表明在第1管中加入1μl Sau3AⅠ酶進(jìn)行倍比稀釋后,37℃酶切30min,基因組DNA大量富集
4、在1~6kb范圍內(nèi),可滿足切割2~4kbDNA片段的要求。計(jì)算得最佳酶切濃度為0.243U/μg、0.121U/μg、0.061 U/μg,按照這三個(gè)最佳濃度放大酶切體系,進(jìn)行大量酶切反應(yīng),回收濃度和效率有較大的提高。
用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收2~4kb的DNA片段,具有方便、快捷、穩(wěn)定的特點(diǎn),不需要酚抽提和乙醇沉淀,回收率在60%左右。
取100μl的轉(zhuǎn)化液涂布于LBS平板上,37℃培養(yǎng)1
5、8h后觀察計(jì)數(shù),白色菌落數(shù)量在70%-80%以上,轉(zhuǎn)化效率達(dá)106 cfu/μg。采用高效感受態(tài)細(xì)胞DH5a常規(guī)轉(zhuǎn)化,得到了近15000個(gè)轉(zhuǎn)化子,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了建庫(kù)理論上需要的轉(zhuǎn)化子。
參照文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道的用于擴(kuò)增毒死蜱降解菌YC-1 mpd基因的引物,以D3菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,可以見(jiàn)到約為1kp的特異性電泳條帶,與預(yù)計(jì)的大小相符,初步證明已成功的擴(kuò)增出所需要的基因片段,將其回收克隆。PC
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