家蠶耐高溫相關(guān)熱激蛋白的研究.pdf

1、家蠶可謂是二十世紀(jì)最為重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲,也是目前繼果蠅以后最為重要的生物學(xué)研究模型昆蟲之一。家蠶由于經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的室內(nèi)飼養(yǎng)與經(jīng)濟(jì)性狀的改良,逐漸的失去野性,變得對(duì)環(huán)境條件尤其是溫度非常敏感。因此,研究家蠶的耐高溫特性以及在分子水平上研究對(duì)高溫沖擊的反應(yīng)如熱激蛋白的合成等不僅具有重要的理論意義而且有很好的實(shí)踐指導(dǎo)意義。特別是對(duì)于選育適應(yīng)在熱帶和干旱地區(qū)及中國(guó)的夏秋蠶季節(jié)飼養(yǎng)的蠶品種,探明家蠶品種的耐熱性能及機(jī)理尤為重要。自20世紀(jì)中葉第一次發(fā)現(xiàn)

2、熱激能誘導(dǎo)果蠅合成熱激蛋白,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)從細(xì)菌到人類都具有合成熱激蛋白的能力,因而認(rèn)識(shí)到熱激反應(yīng)是一個(gè)普遍的生物學(xué)現(xiàn)象,熱激蛋白研究也成為當(dāng)前分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。本項(xiàng)目應(yīng)用雙向電泳技術(shù),結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等分子生物學(xué)先進(jìn)手段,選擇遺傳背景差異很大,耐高溫性狀差異特別明顯的不同家蠶(Bombyx mori)品種為材料,在分子水平研究家蠶對(duì)熱激反應(yīng)特別是熱激蛋的合成種類、品種間的差異及與耐高溫性的關(guān)系。
　　 本

3、試驗(yàn)選取了四個(gè)不同家蠶品種分別為:菁松,中國(guó)系統(tǒng)二化多絲量品種,對(duì)高溫比較敏感；皓月,日本系統(tǒng)二化多絲量品種,對(duì)高溫很敏感；Nistari,熱帶無(wú)滯育多化性少絲量品種,對(duì)高溫耐性好；P50,有滯育多化性少絲量品種,對(duì)高溫耐性中等。家蠶各品種在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)技術(shù)與條件下飼養(yǎng)至五齡第4天,分別用45℃熱激30分鐘或41℃熱激1小時(shí)。然后在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)溫度(24℃)中恢復(fù)2小時(shí)或4小時(shí),取樣分別解剖血液、脂肪體、絲腺體、卵巢、睪丸等器官進(jìn)行試驗(yàn),得到如

4、下研究結(jié)果。1.雙向電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,本試驗(yàn)所用的所有品種經(jīng)熱激處理與對(duì)照比較,都有明顯可見(jiàn)的熱激蛋白產(chǎn)生。經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn),都得到了重復(fù)性很好的試驗(yàn)結(jié)果,在4個(gè)不同品種、不同熱激溫度處理、雌雄性別及2次重復(fù)試驗(yàn)中都檢測(cè)到了25個(gè)差異表達(dá)的熱激蛋白,其中9個(gè)為普遍反應(yīng)表達(dá)蛋白,這16個(gè)共有熱激蛋白中,5個(gè)在凝膠的低分子區(qū)域,分別編號(hào)1、2、3、4、9號(hào),4個(gè)在高分子區(qū)域,分別編號(hào)為5、6、7、和8號(hào)。2.實(shí)驗(yàn)還在凝膠的低分子區(qū)域檢測(cè)到了

5、16個(gè)品種特異反應(yīng)的熱激蛋白表達(dá),其中Nistari有9個(gè),菁松有4個(gè),皓月有3個(gè),而P50一個(gè)也沒(méi)有。因此不同家蠶品種有多個(gè)共有熱激蛋白的合成,但特異反應(yīng)則品種間有顯著差異。3.用MALDITOF/TOF質(zhì)譜儀檢測(cè)分析,熱激處理后檢測(cè)到的25個(gè)差異表達(dá)蛋白,有10個(gè)被鑒定為熱激蛋白(HSPs),其中6個(gè)sHSP,4個(gè)為HSP70。這10個(gè)被鑒定為HSPs當(dāng)中的8個(gè)為共有反應(yīng)熱激蛋白(4個(gè)sHSP,4個(gè)HSP70),2個(gè)為特異反應(yīng)熱激蛋

6、白(都是sHSP)。被MS/MS鑒定出的蛋白質(zhì)的氨基酸序列覆蓋率為29％82％。本試驗(yàn)在所有品種中檢測(cè)到四種可誘導(dǎo)的HSP70屬于HSP70家屬,具有不同等電點(diǎn)和分子量的共有熱激蛋白；六種sHSP包括19.9、20.1、20.4、20.8、21.4和23.7為家蠶可誘導(dǎo)的sHSP。其中HSP19.9、HSP20.4、HSP20.8和HSP23.7為共有表達(dá)蛋白,HSP20.1只在菁松中特異表達(dá),HSP21.4只在Nistari中特異表達(dá)

7、。4.熱激處理后在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)2號(hào)很明顯是sHSP,但PMF和MS/MS分析都不能與數(shù)據(jù)庫(kù)中的任何sHSP相匹配,多次反復(fù)試驗(yàn)結(jié)果相同,可能是因?yàn)槟壳凹倚Q有限的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)而未能鑒定,有待進(jìn)一步分析研究。5.針對(duì)不同對(duì)熱激反應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)共性和特異性的差異,選擇菁松和Nistari兩個(gè)品種,熱激處理后恢復(fù)2小時(shí)的脂肪體中可誘導(dǎo)HSPs,應(yīng)用2DGE分析進(jìn)行定量研究并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),45℃熱激處理,sHSPs的表達(dá)在

8、多化性品種Nistari中的表達(dá)比二化性品種菁松中的表達(dá)低,但是在41℃熱激處理卻區(qū)則兩者之間并無(wú)顯著差異。也就是說(shuō),在比較溫和的熱激處理后,不同耐熱性的蠶品種在sHSPs表達(dá)量上沒(méi)有顯著差異,而在較高的溫度熱激時(shí),耐高溫好的Nistari在sHSPs表達(dá)量顯著的低(P＜0.01)。相反,HSP70的表達(dá)量在不同品種和不同熱激溫度之間都沒(méi)有顯著差異。6.熱激處理后恢復(fù)時(shí)間經(jīng)過(guò)2小時(shí)和4小時(shí)之間在不同品種和處理的熱激蛋白表達(dá)種類上沒(méi)有差異

9、,但在不同熱激蛋白的表達(dá)量上有顯著差異,特別是耐高溫很強(qiáng)的Nistari品種中sHSP的表達(dá)量顯著增加,這可能暗示了sHSP的表達(dá)與家蠶品種的耐高溫性能有著更加密切的關(guān)系。7.不同性別比較發(fā)現(xiàn),sHSP和HSP70表達(dá)在雌雄之間有些可見(jiàn)的差異,但統(tǒng)計(jì)分析都沒(méi)有達(dá)到極顯著差異水平(P＜0.01)。8.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)上述定量差異進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證,對(duì)兩個(gè)熱激蛋白HSP19.9和HSP70的編碼基因進(jìn)行mRNA表達(dá)水平定量研究,結(jié)果

10、非常一致。RNA轉(zhuǎn)錄水平:品種間耐熱性低的菁松高于耐熱性強(qiáng)的Nistari；處理問(wèn)41℃熱激高于45℃熱激處理；不同熱激蛋白間HSP19.9高于HSP70；雌雄間雄性高于雌性。9.在日系耐熱性差的品種皓月中檢測(cè)到sHSPs之間表達(dá)差異很大:HSP19.9和HSP23.7表達(dá)較低,而HSP20.4表達(dá)很高,未被鑒定出的2號(hào)蛋白點(diǎn)表達(dá)量很低。10.在所有本試驗(yàn)所選的品種中,其卵巢和精巢中可檢測(cè)到三種HSPs兩種sHSPs(HSP19.9、H

11、SP20.4)和HSP70的表達(dá),既有上調(diào)也有下調(diào)。11.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用雙向電泳技術(shù)和MALDI-TOF-TOF光譜分析鑒定,檢測(cè)到了家蠶基因組中所有的sHSP,認(rèn)為所有家蠶品種中至少有7個(gè)小分子熱激蛋白和4個(gè)具有不同PI和分子量的HSP70是熱激可誘導(dǎo)的,并與家蠶幼蟲的耐熱性有關(guān)。12.在本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的9個(gè)特異表達(dá)熱激蛋白中只有兩個(gè)被鑒定為sHSP,說(shuō)明現(xiàn)有的家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的限制,有待進(jìn)一步完善。特異表達(dá)熱激蛋白都落在小分子區(qū)域,并且