楊樹制漿性能改良的分子育種技術(shù)研究.pdf

1、楊樹是世界上中緯度地區(qū)廣泛栽培的重要用材樹種，在造紙方面也有著極其重要的作用。木質(zhì)素是地球上數(shù)量僅次于纖維素的有機(jī)物，在植物生長和發(fā)育中發(fā)揮重要作用，但它卻是形成造紙污染的主要來源。利用基因工程手段，在分子水平調(diào)節(jié)木質(zhì)素的生物合成，降低木質(zhì)素的含量或改變其組分以培育適合造紙的植物原料樹種具有很大的應(yīng)用價(jià)值和環(huán)保效益。本研究以南林95楊葉片為植物材料，利用RNAi技術(shù)，主要圍繞木質(zhì)素合成兩種相關(guān)酶4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、肉桂酰輔

2、酶A還原酶（CCR）的基因，構(gòu)建了4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）干涉表達(dá)載體pBI121+2F，開展了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化，并對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了篩選，同時(shí)對轉(zhuǎn)CCR基因的南林95楊進(jìn)行了分子檢測和木質(zhì)素含量檢測，取得如下進(jìn)展：
　　 1、采用改良的Trizol法提取南林95楊的總RNA，利用RT-PCR技術(shù)克隆得到4CL基因的部分序列（204bp），以pUCCRNAi與pBI121載體作為橋梁載體，通過酶切、純化、連接、轉(zhuǎn)化

3、等一系列基因工程操作方法構(gòu)建了含CaMV35S組成型啟動子和卡那霉素篩選基因的RNA干涉表達(dá)載體pBI121+2F，利用直接導(dǎo)入法將構(gòu)建的干涉載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中。
　　 2、用已建立的葉盤法農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，將pBI121+2F干涉表達(dá)載體導(dǎo)入南林95楊中，獲得了經(jīng)抗Kan篩選的含RNA干涉表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株。
　　 3、將已獲得的移栽到大田半年的含pBI121+CCR干涉表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因楊樹植株進(jìn)行分子

4、檢測，表明目的基因已經(jīng)整合到楊樹基因組DNA上，且轉(zhuǎn)基因植株的形態(tài)和生長發(fā)育未見異常，對轉(zhuǎn)基因植株莖干橫截面進(jìn)行組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量明顯減少，測定Klason木質(zhì)素及綜纖維素含量的結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因植株Klason木質(zhì)素含量與對照相比平均降低了9.7％，綜纖維素含量與對照相比平均增加了3.14％。對轉(zhuǎn)基因植株的纖維形態(tài)進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)纖維長寬比明顯增加。結(jié)果均表明轉(zhuǎn)基因植株更有利于造紙。
　　 綜上所述，本文已成功的構(gòu)建了RNA