二倍體D組棉種染色體特異BAC克隆的篩選及其應用.pdf

1、棉花是世界上最重要的纖維經(jīng)濟作物。目前，棉花的全基因組測序工作已進入日程，而棉花高分辨率細胞遺傳學圖的構建是基因組研究中重要而基礎的工作。以遺傳圖譜不同染色體上的分子標記為媒介，在BAC文庫中篩選并獲得染色體特異的BAC克隆，以它們?yōu)樘结樳M行熒光原位雜交完全識別染色體進而對遺傳圖與細胞學圖進行整合的策略在其它作物中得到了廣泛應用。
　　 為加快棉花高分辨率的細胞遺傳學圖的成功構建，本研究對染色體特異BAC克隆的篩選、鑒定等工作進

2、行了一定的嘗試，并且經(jīng)過實驗論證得到了一套可以識別二倍體D組染色體的特異BAC探針。在獲得兩種rDNA BAC克隆的基礎上，對7個二倍體組棉種的rDNA位點分布進行了探討。應用45S rDNA、5S rDNA及D組著絲粒區(qū)域BAC探針，在瑟伯氏棉粗線期染色體上構建了高分辨的棉花細胞學圖，這為D組染色體的特異BAC探針在粗線期上的最終應用及構建D組棉花高分辨率的細胞遺傳學圖，奠定了工作基礎。
　　 研究結果如下：
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3、利用來自于遺傳連鎖圖譜（Han et al.2006）上的染色體特異SSR.標記NAU2440（Chr.3）、NAU2353（Chr.10）、BNL3103（Chr.25）從Pima90 BAC文庫中分別篩選到的425-D-2、429-J-7、189-I-4 BAC克隆，經(jīng)FISH鑒定上述BAC克隆可以產(chǎn)生染色體特異的雜交信號。因此，BAC克隆425-D-2、429-J-7、189-I-4可以做為識別棉花Chr.3、Chr.10、Chr

4、.25的染色體特異BAC探針。
　　 ●在得到一套棉花染色體特異BAC克隆的基礎上，利用雙色FISH技術，以本實驗室篩到的D組著絲粒區(qū)域探針（BAC150D24）區(qū)分染色體長短臂，成功地將13個Dt組染色體特異BAC克隆分別定位在二倍體D組瑟伯氏棉中期染色體臂上，F(xiàn)ISH雜交結果顯示：Dt組的13個BAC探針在對應的D組染色體上都能產(chǎn)生染色體特異的熒光信號。并通過Dt組與D組染色體的同源轉(zhuǎn)化關系確定了D組染色體的命名。
　

5、　 ●物理圖譜與遺傳圖譜的比較作圖分析13個Dt組染色體特異克隆中，盡管部分標記位于連鎖群的中部，但相應克隆的原位雜交定位顯示，其位于染色體的末端或近末端處，這暗示了棉花基因組中染色體的遠端往往是重組活躍區(qū)段；也有位于遺傳連鎖圖末端或近末端處的分子標記被定位在染色體中部的情況，這可能是連鎖群的覆蓋度較低造成的。13個探針在Dt與D組染色體上物理分布有較好的一致性，證明了Dt與D組染色體間確實存在大片段的染色體同源區(qū)段。
　　

6、●鑒于rDNA自身為高度重復序列，可做為識別染色體的FISH標記。本實驗利用45S和5S rDNA引物，從Pima90 BAC庫中篩選得到4個45S rDNA BAC克隆：181－C－3、181－J－11、183－C－22、183－G－12；2個5S rDNA BAC克?。?82-F-9、188－H－17，并通過FISH對其進行了驗證。對得到的45S rDNA BAC克隆進行BAC末端測序，從中得到了一段533bp的DNA片段，在NCB

7、I數(shù)據(jù)庫中與已知序列進行BLAST比對，結果與茶樹、木棉樹、玉蘭、蓮屬以及一些動物的28S序列同源達到98％。
　　 ●在獲得棉花rDNA BAC克隆的基礎上，選取了A、B、C、D、E、F、G，7個組二倍體棉種的各自代表種為研究對象，探討其rDNA位點及7個組的45S與5S線性關系情況。發(fā)現(xiàn)所用7個組的二倍體棉種45S信號多為3－4對，但信號強度大小不盡相同；5S信號除E組的灰白棉為2對外其它均為1對。45S與5S線性關系：A、

8、C、D、F、G組的45S與5S均為共線性形式存在，而B組的兩個棉種及E組的索馬里棉、亞雷西棉，其45S與5S是非共線性的；E組的灰白棉5S位點為2對，其中一對單獨存在，而另一對與45S位點共線性。發(fā)現(xiàn)的特殊rDNA位點染色體組-B、E、F組，在棉屬分類工作中可以起到重要的作用?？偨Y四種rDNA位點分布模式，就rDNA的演化過程推測：二倍體棉種中，非共線分布--B組棉種及與其相近的E組棉索馬里棉、亞雷西棉為最接近棉屬祖先的原始種群，它朝著