家養(yǎng)牛STR分型技術(shù)及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、隨著法庭科學(xué)、動(dòng)物遺傳學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，對(duì)家養(yǎng)牛進(jìn)行DNA分析的需求逐漸增加。短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats，STR)具有雜合度高，多態(tài)性好，易于檢測(cè)，利于實(shí)現(xiàn)分型標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，成為家養(yǎng)牛DNA分析最常用的工具。但由于牛STR分析技術(shù)出現(xiàn)時(shí)間短，在遺傳標(biāo)記選擇和實(shí)驗(yàn)方法等方面均尚存在一些缺陷，未能滿足司法鑒定實(shí)踐的需要。 為建立能有效進(jìn)行家養(yǎng)牛個(gè)體識(shí)別和親子鑒定的DNA遺傳標(biāo)記體系，本實(shí)驗(yàn)擬在

2、家養(yǎng)牛常染色體基因組范圍內(nèi)篩選四核苷酸STR基因座，并對(duì)其進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析。 首先在文獻(xiàn)和公共數(shù)據(jù)庫(kù)中查找牛四核苷酸STR基因座，同時(shí)應(yīng)用Tandem repeats finder(TRF)軟件在牛29條常染色體基因組DNA序列中搜索重復(fù)單位長(zhǎng)度為4bp，完整重復(fù)次數(shù)在8個(gè)或以上且不含插入缺失的STR，結(jié)果共查找到187個(gè)牛四核苷酸STR基因座。應(yīng)用PrimerPremier5.0軟件為查找到的基因座設(shè)計(jì)引物，參數(shù)設(shè)置為：產(chǎn)物

3、長(zhǎng)度<450bp，引物長(zhǎng)度15-27個(gè)堿基，不含二級(jí)結(jié)構(gòu)和發(fā)卡結(jié)構(gòu)，引物之間無(wú)互補(bǔ)序列存在。共有30個(gè)基因座的鄰近序列滿足引物設(shè)計(jì)要求。利用40份無(wú)關(guān)家養(yǎng)牛樣本對(duì)這30個(gè)基因座進(jìn)行篩選，剔除擴(kuò)增效率低、有明顯陰影帶或遺傳多態(tài)性低的基因座后，最終得到7個(gè)分型清晰的四核苷酸STR基因座。 對(duì)100份無(wú)關(guān)家養(yǎng)牛樣本進(jìn)行這7個(gè)STR基因座的電泳分型檢測(cè)，明確它們的等位基因并進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)ISFG的命名規(guī)則為各個(gè)等位基因命名。在GenBa

4、nk和BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中，搜索這7個(gè)STR基因座的序列，除基因座G18833外，確定其余6個(gè)STR基因座未經(jīng)報(bào)道過(guò)。將基因座的信息提交給GenBank，獲得這6個(gè)基因座的收錄號(hào)并以此對(duì)其分別進(jìn)行命名為FJ232022、FJ232028、FJ232023、FJ232024、FJ232026和FJ23205。分別制備7個(gè)基因座的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物(Ladder)，通過(guò)與Ladder比對(duì)獲得100份家養(yǎng)牛樣本的基因型資料。利用GENEPOP程

5、序進(jìn)行Hardy—Weinberg平衡檢驗(yàn)和連鎖不平衡(linkagedisequilibrium，LD)檢驗(yàn)。7個(gè)基因座的等位基因頻率、個(gè)體識(shí)別能力(discriminationpower，DP)、多態(tài)性信息含量(polymorphisminformationcontent，PIC)和雜合度觀察值(observedheterozygosity，Ho)通過(guò)Modified—Powerstates軟件計(jì)算得到。應(yīng)用PowerMaker軟件

6、統(tǒng)計(jì)各基因座的基因型頻率。按文獻(xiàn)報(bào)道的公式計(jì)算雜合度期望值(expectedheterozygosity，He)、非父排除概率(probabilityofexclusion，PE)、累積個(gè)體識(shí)別能力(TDP)和累積非父排除概率(CPE)。7個(gè)STR基因座在100份無(wú)關(guān)家養(yǎng)牛群體樣本中分別檢出4～12種等位基因和6～27種基因型。7個(gè)基因座的基因型數(shù)據(jù)均通過(guò)了Hardy—Weinberg平衡檢驗(yàn)(P>0.05)。獨(dú)立性檢驗(yàn)證實(shí)7個(gè)基因座之

7、間均無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，處于連鎖平衡狀態(tài)。 為評(píng)估7個(gè)牛四核苷酸STR基因座在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)它們的檢測(cè)靈敏度、種屬特異性、重復(fù)性和實(shí)際檢案應(yīng)用等進(jìn)行了研究。應(yīng)用銀染法檢測(cè)7個(gè)STR基因座的最小DNA模板量為2ng～10ng。用7對(duì)引物對(duì)牛、人、豬、羊、狗、貓、兔、小鼠和雞的DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，僅牛在特異性片段范圍內(nèi)檢見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)肯定親緣關(guān)系的10例家系樣本進(jìn)行檢測(cè)，7個(gè)STR基因座的分型結(jié)果均符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。采集后放置一天

8、與放置一年的同一份血痕的檢測(cè)結(jié)果一致。來(lái)自同一個(gè)體的血痕和口腔拭子樣本的分型結(jié)果一致。對(duì)實(shí)際案件的檢驗(yàn)證實(shí)，該分型系統(tǒng)可用于家養(yǎng)牛法醫(yī)DNA分析。 為建立7個(gè)牛四核苷酸STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，將7個(gè)基因座分為3組，每組在正向引物的5’端標(biāo)記相同顏色的熒光。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系的組成和熱循環(huán)參數(shù)，并根據(jù)毛細(xì)管凝膠電泳的結(jié)果調(diào)整復(fù)合擴(kuò)增體系中各基因座的引物濃度，以盡可能保持各基因座擴(kuò)增效率的平衡。由于基因座FJ2320

9、26和FJ232025的引物加入復(fù)合擴(kuò)增體系后，無(wú)法得到較好的電泳效果，故予以剔除，最后初步建立了家養(yǎng)?；蜃鵊18833、FJ232022、FJ232028、FJ232023和FJ232024的五重STR復(fù)合擴(kuò)增體系。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)在牛基因組序列中篩選出7個(gè)四核苷酸重復(fù)STR基因座：G18833、FJ232022、FJ232023、FJ232024、FJ232025、FJ232026、FJ232028，其中除G18833外為本