太行山紅豆衫細(xì)胞系建立及培養(yǎng)因子優(yōu)化研究.pdf

1、上世紀(jì)80年代以來，人們一直在研究利用紅豆杉細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法生產(chǎn)紫杉醇，并認(rèn)為是解決天然紅豆杉被保護后紫杉醇藥源問題的最有希望的途徑之一。用于工廠化生產(chǎn)的細(xì)胞系，其生長性能有兩個基本要求，一是細(xì)胞或愈傷組織生產(chǎn)率高，二是紫杉醇產(chǎn)率高，即“雙產(chǎn)率”高；技術(shù)上也有兩個基本要求，一是細(xì)胞系易建立，二是易更新。課題從“雙產(chǎn)率”視角，以太行紅豆杉為材料，通過篩選基本培養(yǎng)基、激素種類、激素濃度、光溫條件、補加前體等培養(yǎng)因子，以及優(yōu)化培養(yǎng)模式，探討

2、建立和更新細(xì)胞系的新方法和提高紫杉醇含量的新途徑。主要結(jié)果如下： 1.優(yōu)化的主要培養(yǎng)因子的結(jié)果為：外植體以當(dāng)年嫩枝最好，基本培養(yǎng)基B5最優(yōu)，激素組合以2，4-D、NAA、6-BA配合最佳。B5基本培養(yǎng)基，附加1.0 mg/L的2，4-D，1.0mg/L的NAA和0.5～1.0 mg/L的6-BA可高頻率誘導(dǎo)愈傷組織；B5基本培養(yǎng)基，附加1.0mg/L的NAA，0.5mg/L的6-BA，和2.0mg/L的2，4-D可高產(chǎn)率繼代細(xì)胞

3、系。細(xì)胞系在25℃～28℃，黑暗或<500Lx散射光下培養(yǎng)生長速度快，質(zhì)量好。 2.優(yōu)化的培養(yǎng)模式為：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)和紙橋培養(yǎng)恰當(dāng)結(jié)合，是快速建立細(xì)胞系的良好模式。外植體在固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，在紫杉醇含量的監(jiān)測下，對愈傷組織做液體培養(yǎng)，使細(xì)胞分散和同步化，再做平板看護培養(yǎng)或紙橋繼代，可快速繁殖細(xì)胞系，生長率達0.30 g·g-1·d-1(鮮重)。 3.提出了細(xì)胞系復(fù)壯和更新的技術(shù)環(huán)節(jié)：2～3次繼代后適當(dāng)調(diào)整激素

4、水平，可保持細(xì)胞系活力；通過原始外植體重建、半固體平板繼代中挑選、液體培養(yǎng)下的細(xì)胞系紙橋平板培養(yǎng)并選擇等，可快速更新細(xì)胞系。 4.培養(yǎng)基中添加氨基酸前體對愈傷組織的生長和紫杉醇合成有積極影響，發(fā)現(xiàn)D-苯丙氨酸不僅能使紫杉醇含量得到大幅度提高，也能顯著提高細(xì)胞生長量，“雙產(chǎn)率”提高3～5倍。 5.優(yōu)化了紫杉醇提取和檢測的常規(guī)方法：乙酸乙酯-丙酮法超聲提取，一次浸膏三氯甲烷溶解，三氯甲烷和碳酸鉀溶液脫脂(SPE純化褪色，可選

5、項)，樣品純度高，HPLC檢測重復(fù)性好，回收率89％以上。 6.發(fā)現(xiàn)了太行紅豆杉及細(xì)胞系的一些基本特性：天然1～2年生紅豆杉枝葉紫杉醇含量在0.01～0.02％之間，25℃時建立的細(xì)胞系繼代周期為45 d左右，生長周期呈“S”曲線，生長速率0.24～0.30 g·g-1·d-1(鮮重)，紫杉醇含量最高可達0.0224％。 7.建立的細(xì)胞系和培養(yǎng)技術(shù)，預(yù)計經(jīng)濟效益指標(biāo)可達細(xì)胞產(chǎn)物12.495 kg/m2/年，理論上可獲得紫