畢業(yè)論文--谷胱甘肽響應(yīng)的可激活磁共振成像納米探針的制備研究

1、<p><b>　　本科生畢業(yè)論文</b></p><p>　　谷胱甘肽響應(yīng)的可激活磁共振成像 納米探針的制備研究 </p><p>　　姓 名： 楊 娜 學(xué) 號(hào)： 1110371042 </p><p>　　學(xué) 院： 醫(yī)學(xué)影像學(xué)院

2、 </p><p>　　專 業(yè)： 生物醫(yī)學(xué)工程 </p><p>　　年 級(jí)： 　2011級(jí) </p><p>　　指導(dǎo)教師： 李菁菁 職 稱： 助理研究員 </p>&

3、lt;p>　　2015年6月 徐州</p><p>　　徐州醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)本科畢業(yè)設(shè)計(jì)任務(wù)書</p><p>　　學(xué)院 醫(yī)學(xué)影像學(xué)院 專業(yè)年級(jí) 2011級(jí)生物醫(yī)學(xué)工程 學(xué)生姓名 楊娜 </p><p>　　任務(wù)下達(dá)日期： 年 月 日</p><p>　　畢業(yè)設(shè)計(jì)日期： 年 月 日至

4、 年 月 日</p><p><b>　　畢業(yè)設(shè)計(jì)題目：</b></p><p>　　谷胱甘肽響應(yīng)的可激活磁共振成像納米探針的制備研究</p><p>　　畢業(yè)設(shè)計(jì)主要內(nèi)容和要求：</p><p>　　1．完成四氧化三鐵納米粒子（Fe3O4）、氧化釓（PEG-Gd2O3）及胱胺的制備，并對(duì)其性能進(jìn)行表征，

5、研究其特性。</p><p>　　2. 谷胱甘肽響應(yīng)的可激活磁共振成像納米探針的組裝，即在偶聯(lián)劑存在下，將Fe3O4與PEG-Gd2O3通過(guò)胱胺結(jié)合形成Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針，并通過(guò)控制單一變量的方法對(duì)納米探針中的Fe3O4和PEG-Gd2O3濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳信噪比的用量。</p><p>　　3. 通過(guò)納米探針對(duì)786-0腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用評(píng)估其生物相容性。<

6、;/p><p>　　院長(zhǎng)簽字： 指導(dǎo)教師簽字：</p><p>　　徐州醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)本科畢業(yè)論文指導(dǎo)教師評(píng)閱書</p><p>　　指導(dǎo)教師評(píng)語(yǔ)（①基礎(chǔ)理論及基本技能的掌握；②獨(dú)立解決實(shí)際問(wèn)題的能力；③研究?jī)?nèi)容的理論依據(jù)和技術(shù)方法；④取得的主要成果及創(chuàng)新點(diǎn)；⑤工作態(tài)度及工作量；⑥總體評(píng)價(jià)及建議成績(jī)；⑦存在問(wèn)題；⑧是否同意答辯

7、等）：</p><p>　　成 績(jī)： 指導(dǎo)教師簽字：</p><p>　　年 月 日</p><p>　　徐州醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)本科畢業(yè)論文評(píng)閱教師評(píng)閱書</p><p>　　評(píng)閱教師評(píng)語(yǔ)（①選題的意義；②基礎(chǔ)理論及基本技能的掌握；③綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)解決實(shí)際問(wèn)題的能力；④工

8、作量的大?。虎萑〉玫闹饕晒皠?chuàng)新點(diǎn)；⑥寫作的規(guī)范程度；⑦總體評(píng)價(jià)及建議成績(jī)；⑧存在問(wèn)題；⑨是否同意答辯等）：</p><p>　　成 績(jī)： 評(píng)閱教師簽字：</p><p>　　年 月 日</p><p>　　徐州醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)本科畢業(yè)論文答辯及綜合成績(jī)</p><p>

9、;<b>　　摘 要</b></p><p>　　目前，惡性腫瘤是威脅人類健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。MRI在神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉骨骼、心血管和腫瘤等疾病的診斷中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，然而如何設(shè)計(jì)制備新型可激活磁共振成像（MRI）分子探針用于腫瘤成像仍然研究較少，這對(duì)于提高腫瘤診斷的特異性具有十分重要的意義。</p><p>　　研究表明，腫瘤組織較正常組織中谷胱甘肽（GSH）高表達(dá)

10、。因此，本文設(shè)計(jì)了谷胱甘肽響應(yīng)可用于腫瘤細(xì)胞的特異性成像的可激活磁共振分子成像探針。討論了將陽(yáng)性對(duì)比劑(PEG-Gd2O3)及陰性對(duì)比劑（SPIO: Superparamagnetic Iron Oxide）通過(guò)胱胺相連接制備成GSH響應(yīng)的可激活磁共振對(duì)比劑（Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針）的制備方法及其優(yōu)化。當(dāng)沒(méi)有谷胱甘肽存在時(shí)，SPIO產(chǎn)生的強(qiáng)磁場(chǎng)對(duì)PEG-Gd2O3的MR信號(hào)有淬滅作用，MR T1信號(hào)變?nèi)?，?dāng)有谷胱甘肽存在時(shí)

11、，納米探針的雙硫鍵被打開(kāi)，MR T1信號(hào)變強(qiáng)。與目前臨床最常使用的Gd-DTPA相比，納米對(duì)比劑具有弛豫率高、敏感性強(qiáng)、特異性高等優(yōu)點(diǎn)。</p><p>　　本文也通過(guò)MTT測(cè)試證明Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針具有良好的生物相容性。將不同濃度Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針與腎癌細(xì)胞786-0作用，當(dāng)[Gd3+]濃度低于0.2mM時(shí)，細(xì)胞形態(tài)良好未發(fā)生明顯改變；MTT測(cè)試表明，當(dāng)[Gd3+]濃度低于0

12、.1mM時(shí)，細(xì)胞的存活率均在90%以上，當(dāng)[Gd3+]濃度高于0.15mM時(shí)，細(xì)胞存活率明顯降低。</p><p>　　關(guān)鍵詞：谷胱甘肽； 可激活磁共振成像； 納米對(duì)比劑； 磁共振成像分子探針</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　Currently, cancer is a common and multi

13、ple disease which is a threat to human health. Magnetic resonance imaging (MRI) has unique advantages in diagnosis of diseases such as the nervous system, musculoskeletal, cardiovascular and tumor. However, the researche

14、s on how to design activatable MRI molecular probe which can be used for the specific tumor imaging is still scarce. The development of this kind of probes would improve the sensitivity of MRI for its role in the field o

15、f diagnosis of tumor </p><p>　　Studies have shown that glutathione(GSH)’s content in tumor tissue is significantly higher compared with normal tissue. Therefore, in this thesis, GSH-response activatable MRI

16、molecular probe was desgined for the specific MRI of tumor cells. The preparation and optimization of activated MRI probe (Fe3O4-SS-Gd2O3 nanoprobe), which was formed by the combination of PEG-Gd2O3 and Fe3O4 with cystea

17、mine as linker were discussed. In the absentance of GSH, the magnetic field generated by SPIO perturbs t</p><p>　　Furthermore, with the MTT test, Fe3O4-SS-Gd2O3 nanoprobes displayed good biocompatibility. Re

18、nal carcinoma 786-0 cell were incubated with different concentrations of Fe3O4-SS-Gd2O3 nanoprobes. When the concentration of [Gd3+] was below 0.2 mM, cell morphology were good. The results of MTT showed that when the co

19、ncentration of [Gd3+] was lower than 0.1 mM, cell viabilities were more than 90%, and when the concentration of [Gd3+] was higher than 0.15mM, cell viabilities were decreased.</p><p>　　Key words: Glutathione

20、; Activatable MRI; nanoparticle-based contrast agent; MRI molecular probe</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 緒論1</b></p><p><b>　　1.1研究背景1</b>

21、</p><p>　　1.2課題的提出4</p><p>　　1.3論文結(jié)構(gòu)和各章節(jié)安排4</p><p><b>　　2 材料合成5</b></p><p>　　2.1四氧化三鐵（Fe3O4）納米粒子合成5</p><p><b>　　2.1.1引言5</b>&l

22、t;/p><p>　　2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及器材5</p><p>　　2.1.3實(shí)驗(yàn)步驟6</p><p>　　2.1.4透射電子顯微鏡（TEM：Transmission electron microscope）掃描6</p><p>　　2.1.5 ICP-MS制樣7</p><p>　　2.1.6 MR掃描7

23、</p><p>　　2.1.7傅里葉變換紅外光譜分析8</p><p>　　2.2 PEG-Gd2O3合成9</p><p><b>　　2.2.1引言9</b></p><p>　　2.2.2實(shí)驗(yàn)試劑及器材9</p><p>　　2.2.3透析袋前處理10</p>&l

24、t;p>　　2.2.4實(shí)驗(yàn)步驟10</p><p>　　2.2.5 MR掃描11</p><p>　　2.2.6傅里葉變換紅外光譜分析12</p><p>　　2.3 胱胺合成13</p><p>　　2.3.1引言13</p><p>　　2.3.2實(shí)驗(yàn)試劑及器材13</p><

25、p>　　2.3.3實(shí)驗(yàn)步驟14</p><p><b>　　2.4討論14</b></p><p>　　3 可激活MRI納米探針Fe3O4-SS-Gd2O3的制備15</p><p>　　3.1 Fe3O4-SS-Gd2O3的傅里葉變換紅外光譜分析15</p><p>　　3.2不同濃度四氧化三鐵（Fe3O

26、4）納米粒子對(duì)MRI信號(hào)的影響15</p><p>　　3.3不同濃度氧化釓（PEG-Gd2O3）對(duì)MRI信號(hào)的影響16</p><p>　　3.4谷胱甘肽（GSH）對(duì)T1弛豫率的影響17</p><p>　　3.5不同濃度谷胱甘肽（GSH）的MRI信號(hào)響應(yīng)18</p><p><b>　　3.6 討論19</b&g

27、t;</p><p>　　4 可激活MRI納米探針Fe3O4-SS-Gd2O3的MTT測(cè)試20</p><p>　　4.1 實(shí)驗(yàn)試劑及器材20</p><p>　　4.2 NIH 3T3小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)21</p><p>　　4.2.1 NIH 3T3小鼠成纖維細(xì)胞復(fù)蘇21</p><p>　　4.2.2

28、NIH 3T3小鼠成纖維細(xì)胞傳代22</p><p>　　4.2.3 NIH 3T3小鼠成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)22</p><p>　　4.2.4 NIH 3T3小鼠成纖維細(xì)胞凍存22</p><p>　　4.3 786-0腎癌細(xì)胞培養(yǎng)22</p><p>　　4.3.1 786-0腎癌細(xì)胞復(fù)蘇23</p><p>

29、　　4.3.2 786-0腎癌細(xì)胞傳代23</p><p>　　4.3.3 786-0腎癌細(xì)胞計(jì)數(shù)23</p><p>　　4.3.4 786-0腎癌細(xì)胞凍存24</p><p>　　4.4 NIH 3T3小鼠成纖維細(xì)胞、786-0腎癌細(xì)胞種板24</p><p>　　4.5 MTT測(cè)試25</p><p>

30、　　4.5.1 786-0腎癌細(xì)胞形態(tài)表征26</p><p>　　4.5.2 786-0腎癌細(xì)胞存活率測(cè)定26</p><p><b>　　4.6 討論27</b></p><p>　　5 總結(jié)與展望28</p><p><b>　　5.1總結(jié)28</b></p><

31、p><b>　　5.2展望28</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)30</b></p><p><b>　　翻譯33</b></p><p><b>　　英文原文33</b></p><p><b>　　中文譯文40&l

32、t;/b></p><p><b>　　致 謝45</b></p><p><b>　　1 緒論</b></p><p><b>　　1.1研究背景</b></p><p>　　近年來(lái)，腫瘤的發(fā)生越來(lái)越多，且發(fā)病年齡越來(lái)越年輕化。然而，腫瘤很難在早期得到及時(shí)診斷和治療

33、，因此，惡性腫瘤是一類嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病，多發(fā)病，早期特異性診斷可提高患者生存率，改善生活質(zhì)量[1]。由于傳統(tǒng)影像診斷方法主要針對(duì)實(shí)質(zhì)性腫瘤，此時(shí)患者已經(jīng)處于臨床中晚期，故治療效果差，預(yù)后較差。所以，惡性腫瘤仍然是威脅人類健康與壽命的一大關(guān)鍵因素。因此，在臨床上找到一種有效的腫瘤檢查方式與診斷方法并進(jìn)行良惡性判定具有十分重要的意義。既往有大量的研究專注于尋找特異性的腫瘤血清標(biāo)志物，應(yīng)用于腫瘤的早期診斷[2]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中谷

34、胱甘肽（GSH）含量明顯高于腫瘤旁組織，在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中，谷胱甘肽的濃度為（6.29士0.67）nmol/106。吳琛珩等對(duì)人消化道腫瘤組織的檢測(cè)結(jié)果也揭示，腫瘤組織內(nèi)還原性谷胱甘肽和輔酶Ⅰ（GSH、NADPH）的含量顯著高于相應(yīng)的癌旁組織，提示腫瘤細(xì)胞中確有GSH的高表達(dá)[3]。</p><p>　　隨著分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)影像學(xué)的飛速發(fā)展，近年來(lái)產(chǎn)生了一門新興的交叉學(xué)科--分子影像學(xué)。分子影像學(xué)是指運(yùn)用

35、影像學(xué)的手段，在組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞水平顯示活體狀態(tài)下某些特定分子的變化，對(duì)生物學(xué)行為進(jìn)行定性和定量的研究，為疾病過(guò)程在體監(jiān)測(cè)、基因治療、在體示蹤、藥物在體療效評(píng)測(cè)和功能分子在體活動(dòng)規(guī)律研究提供新技術(shù)。分子影像學(xué)在疾病早期診斷、提供疾病發(fā)展重要信息和評(píng)價(jià)治療效果方面具有誘人的潛能，具有無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)、在體、特異、精細(xì)顯像等優(yōu)點(diǎn)[4-6]。所以，分子影像技術(shù)可望為疾病的研究和臨床“早早期”診斷、治療提供基因分子水平信息，而在分子影像學(xué)成像技術(shù)中

36、，靶向性和高親和性分子探針的制備起著關(guān)鍵作用[7-8]。</p><p>　　磁共振成像是利用生物體不同組織在磁共振過(guò)程中產(chǎn)生的具有不同特征的電磁波信號(hào)成像技術(shù)，是上世紀(jì)80年代以來(lái)醫(yī)學(xué)影像學(xué)發(fā)展的最新成就之—[9-10]。磁共振成像技術(shù)也因?yàn)槠錈o(wú)創(chuàng)傷性、無(wú)輻射損傷、非侵入性、并具有多序列、多參數(shù)（不同組織與磁共振有關(guān)的特征參數(shù)如質(zhì)子密度、縱向弛豫時(shí)間、橫向弛豫時(shí)間、彌散系數(shù)等都可以作為成像參數(shù)）、任意平面成像、

37、較高的密度分辨率等優(yōu)點(diǎn)[11]廣泛的應(yīng)用于臨床，已經(jīng)成為臨床診斷中最常用的影像檢查手段之一[12]。但是隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的飛速的發(fā)展和人們生活水平的日益提高，常規(guī)的磁共振檢查已經(jīng)不能滿足臨床診斷的要求，人們對(duì)磁共振成像的特異性、精確性、敏感性提出了更高的要求。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)微小病變及隱匿病變的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，學(xué)者紛紛投入到提高疾病診斷準(zhǔn)確性的成像方法的研究。雖然單一的磁共振成像設(shè)備已經(jīng)對(duì)脂肪、軟組織等低密度組織具有的成像效果，但它仍然不

38、可以實(shí)現(xiàn)對(duì)全身任意組織的掃描成像并提供有診斷價(jià)值的圖像。通過(guò)磁共振和其他成像設(shè)備的結(jié)合（例如磁共振和PET的結(jié)合形成PETMRI）[13-14]，多通道探測(cè)器可視化的開(kāi)發(fā)，不僅可以從解剖水平觀察病變，而且可以從分子代謝水平</p><p>　　磁共振造影劑是能夠縮短組織在外磁場(chǎng)作用下的共振時(shí)間、增大對(duì)比信號(hào)的差異、提高成像對(duì)比度和清晰度的一類診斷試劑[16]。磁共振對(duì)比增強(qiáng)的基本原理是通過(guò)改變內(nèi)、外界弛豫效應(yīng)和磁

39、化率效應(yīng)間接地改變組織的信號(hào)強(qiáng)度，從而達(dá)到提高不同組織間信號(hào)差異的目的。磁共振對(duì)比劑的應(yīng)用，可以增強(qiáng)正常組織與病變組織之間的信號(hào)對(duì)比，使微小病變更加突出，使得微小病變與隱匿病變的早發(fā)現(xiàn)、早診斷成為可能。它能有效改變生物體內(nèi)組織中局部的水質(zhì)子弛豫速率，縮短水分子中質(zhì)子的弛豫時(shí)間，準(zhǔn)確地檢測(cè)出正常組織與患病部位之間的差異，從而最終顯示生物體內(nèi)各器官或組織的功能狀態(tài)。磁共振對(duì)比劑要應(yīng)用于人體，除了要滿足藥物的基本要求，具有生物適應(yīng)性、水溶性好

40、和良好的穩(wěn)定性外，還應(yīng)具有以下特性：（1）靶向性：即對(duì)比劑進(jìn)入人體后能選擇性聚集，在靶組織富集并停留一段時(shí)間，使靶區(qū)域被觀測(cè)核的弛豫速率比其他正常組織部位有更大的增強(qiáng)，以達(dá)到增加正常組織與病變組織的對(duì)比度。（2）細(xì)胞毒性小：對(duì)比劑中游離的稀土金屬離子和配體毒性較強(qiáng)，而其配合物毒性較低。稀土金屬離子的置換效應(yīng)是毒副作用的主要影響因素，所以MRI對(duì)比劑在體內(nèi)的有效期中應(yīng)為穩(wěn)定配合物。（3）</p><p>　　陽(yáng)性對(duì)

41、比劑一般是指可以增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度的順磁性物質(zhì)，例如軋劑、氧化錳等。陽(yáng)性對(duì)比劑以縮短T1弛豫時(shí)間為主（在T1加權(quán)成像中增加信號(hào)的強(qiáng)度），表現(xiàn)在圖像上增強(qiáng)區(qū)顯示信號(hào)增強(qiáng)。在T1加權(quán)像中，由公式I=KN(H)(1-e-TR/T1)可知，如果組織器官的T1短，則MR信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)，圖像變亮；如果組織器官T1長(zhǎng)，則MR信號(hào)強(qiáng)度弱，圖像變暗。目前應(yīng)用最廣泛的磁共振陽(yáng)性對(duì)比劑即Gd-DTPA，中文名為二乙三胺五醋酸釓或釓噴酸葡甲胺鹽，商品名為馬根維顯（Mag

42、nevist）[17-18]。Gd-DTPA是一種順磁性物質(zhì)，它的增強(qiáng)原理為：Gd3+具有7個(gè)不成對(duì)電子，其不成對(duì)電子與質(zhì)子一樣為偶極子，具有磁距。電子質(zhì)量很輕，但其磁距約為質(zhì)子的657倍。在無(wú)順磁性物質(zhì)的情況下，組織的T1弛豫是由質(zhì)子之間的偶極子-偶極子相互作用，形成局部磁場(chǎng)波動(dòng)所引起的。在有不成對(duì)電子的順磁性物質(zhì)存在時(shí)，由于電子的磁化率約為質(zhì)子的657倍，從而產(chǎn)生局部巨大磁場(chǎng)波動(dòng)。此時(shí)，大部分電子的運(yùn)動(dòng)頻率與Larmor頻率相近，而

43、使鄰近質(zhì)子的T1弛豫時(shí)間縮短，即形成所謂質(zhì)子偶極子-電子偶極子之間的偶極子-偶極子相互作用，引起所謂質(zhì)子磁豫增強(qiáng)，</p><p>　　陰性對(duì)比劑通常是超順磁性的納米粒子（例如氧化鐵）及高濃度的順磁性物質(zhì)。陰性對(duì)比劑以縮短T2弛豫時(shí)間為主（在T2加權(quán)成像中降低信號(hào)強(qiáng)度），呈暗或黑色低信號(hào)。在T2加權(quán)像中，由公式I=KN(H)e-TE/T2可知，如果組織器官T2長(zhǎng)，則MR信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)，圖像變亮；如果組織器官T2短，則

44、MR信號(hào)強(qiáng)度弱，圖像變暗。超順磁性氧化鐵（SPIO：Superparamagnetic Iron Oxide）是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種納米材料[27]，由于其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在較弱的外磁場(chǎng)中就可產(chǎn)生巨大的磁性，而外磁場(chǎng)撤銷后無(wú)剩磁。它的作用原理為：SPIO顆粒直徑40~400m，表面用葡聚糖包裹。由于血液中直徑在30~5000nm的顆粒主要經(jīng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，因而靜脈注射后該類對(duì)比劑進(jìn)入肝臟及脾臟的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞(RES：Reticuloe

45、ndothelial system)，產(chǎn)生短T2效應(yīng)，在肝臟枯否細(xì)胞可攝取對(duì)比劑顆粒。由于正常肝臟存在枯否細(xì)胞，而腫瘤內(nèi)一般無(wú)或少含無(wú)枯否細(xì)胞，因此對(duì)比劑能增加腫瘤與肝實(shí)質(zhì)間的對(duì)比，從而提高肝臟腫瘤的檢出率，對(duì)鑒別腫瘤是否肝細(xì)胞來(lái)源也有較大價(jià)值。目前有多種網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞性MR對(duì)比劑</p><p><b>　　1.2課題的提出</b></p><p>　　綜上所述，單一

46、模態(tài)的磁共振對(duì)比劑，雖然在常見(jiàn)疾病的診斷上已經(jīng)發(fā)揮出巨大的作用，但是對(duì)于一些微小隱匿病變?nèi)匀粺o(wú)法提供具有高診斷準(zhǔn)確性的MRI圖像。而且單模態(tài)對(duì)比劑毒性大，在體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生非特異性聚集，使非病變組織產(chǎn)生增強(qiáng)的MR信號(hào)，從而導(dǎo)致高的非特異性背景和低目標(biāo)背景比。因此，單模態(tài)的磁共振對(duì)比劑正面臨巨大的挑戰(zhàn)?；诖?，我們提出將陰性超順磁性納米粒子氧化鐵對(duì)比劑和陽(yáng)性PEG-Gd2O3對(duì)比劑相結(jié)合的可激活磁共振對(duì)比劑。可激活對(duì)比劑具有高弛豫率、細(xì)胞毒性小

47、、靶向性好、特異性強(qiáng)、敏感性高等特點(diǎn)。目前，關(guān)于可激活對(duì)比劑的報(bào)道并不多，因此可激活對(duì)比劑成為眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)。SPIO和PEG-Gd2O3表面都含有羧基（CO）,通過(guò)表面含有兩個(gè)氨基（NH）的胱胺相連接，當(dāng)沒(méi)有腫瘤細(xì)胞存在時(shí)，由于SPIO產(chǎn)生的磁場(chǎng)對(duì)PEG-Gd2O3的磁共振信號(hào)有淬滅作用，在磁共振T1圖像上沒(méi)黑色或灰黑色，當(dāng)有腫瘤細(xì)胞存在時(shí)，由于腫瘤細(xì)胞中谷胱甘肽（GSH）含量比正常細(xì)胞高出許多，谷胱甘肽將連接SPIO和PEG-G

48、d2O3的雙硫鍵打開(kāi)，在磁共振T1圖像上表現(xiàn)為明亮或白色信號(hào)。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的靶向作用。提高診斷的準(zhǔn)確信和</p><p>　　1.3論文結(jié)構(gòu)和各章節(jié)安排</p><p>　　論文第一章簡(jiǎn)要介紹了本實(shí)驗(yàn)的研究背景，且闡述了本文研究?jī)?nèi)容的提出。</p><p>　　論文第二章對(duì)陽(yáng)性對(duì)比劑PEG-Gd2O3和陰性對(duì)比劑SPIO以及“連接物”胱胺的合成方法、性質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)

49、的闡述和介紹。</p><p>　　論文第三章討論了可激活對(duì)比劑Fe3O4-SS-Gd2O3的制備過(guò)程及優(yōu)化。</p><p>　　論文第四章進(jìn)行了可激活對(duì)比劑Fe3O4-SS-Gd2O3的細(xì)胞毒性研究，利用MTT法考察其生物相容性。</p><p>　　論文第五章：總結(jié)與展望。</p><p><b>　　2 材料合成</b

50、></p><p>　　2.1四氧化三鐵（Fe3O4）納米粒子合成</p><p><b>　　2.1.1引言</b></p><p>　　氧化鐵( 通常指磁鐵礦 Fe3O4 或者磁赤鐵礦γ－ Fe2O3) 納米粒子，應(yīng)用于磁共振成像已有20多年的歷史了。超順磁性氧化鐵( SPIO，粒徑小于30 nm) 納米粒子網(wǎng)狀內(nèi)皮組織吸收，在肝、脾

51、、骨髓等組織會(huì)器官處富集會(huì)大大縮短T2弛豫時(shí)間，SPIO 作為 T2造影劑的典型代表，已經(jīng)臨床多年，如 Feridex IV Resovist Lumirem 進(jìn)行肝臟造影、追蹤成像等[32-36]。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，四氧化三鐵納米顆粒作為功能材料，在磁記錄材料、特殊催化劑原料、磁流體的基本材料和磁性顏料、藥物等方面顯示出許多特殊功能，有關(guān)納米磁性Fe3O4的制備方法及性質(zhì)的研究也受到廣泛關(guān)注。SPIO納米粒子的合成方法有

52、許多種，常用的有共沉淀法、微乳液法、超聲空氣法等[37-38]。其中，共沉淀法是制備SPIO納米粒子最常規(guī)的方法，也是較為簡(jiǎn)單和技術(shù)成熟的方法，它是將二價(jià)鐵鹽和三價(jià)鐵鹽溶液按一定比例混合，將堿性沉淀劑快速加入至上述混合溶液中，攪拌、反應(yīng)一段時(shí)間經(jīng)洗滌、干燥，可得SPIO粉末。SPIO為符合氧化物，是由相應(yīng)的氫氧化物轉(zhuǎn)化而來(lái)，因此該反應(yīng)的理論摩爾比為Fe2+：</p><p>　　2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及器材</

53、p><p><b>　?。?）所用材料：</b></p><p>　　試劑：二氯化鐵FeCl2（上海山海工學(xué)團(tuán)實(shí)驗(yàn)二廠）；</p><p>　　三氯化鐵FeCl3（滬試，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；</p><p>　　氨水（滬試，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；</p><p>　　檸檬三鈉（滬試，國(guó)藥

54、集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）</p><p><b>　　溴化鉀。</b></p><p>　　材料：EP管、移液器槍頭、一次性吸管（美國(guó)AXYGEN公司）</p><p><b>　?。?）所用器材：</b></p><p>　　智能恒溫定時(shí)磁力攪拌器，型號(hào)：B12-3（上海司樂(lè)儀器有限公司）；<

55、/p><p>　　超純水儀（美國(guó)，Milli-Q Refereme）；</p><p>　　舒美超聲波清洗器，型號(hào)：KQ218（昆山市超聲儀器有限公司）；</p><p>　　電子天平，（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；</p><p>　　10μL、 20 mL、100 mL、1000 mL微量移液器，（德國(guó)Eppendorf公司）；</p&

56、gt;<p>　　電熱恒溫干燥箱，（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）； </p><p>　　精密增力電動(dòng)攪拌器，型號(hào)：JJ-1（常州國(guó)華電器有限公司）；</p><p>　　紅外光譜儀，型號(hào)：NEXUS870 （美國(guó)Nicolet公司）；</p><p>　　透射電子顯微鏡TECNAI G2

57、，（美國(guó)FEI公司）；</p><p>　　3.0T signal全身磁共振成像設(shè)備，（美國(guó)GE公司）。</p><p><b>　　2.1.3實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p>　?。?）稱取0.19882g FeCl2溶于10mL蒸餾水，稱取0.54058g FeCl3溶于10mL蒸餾水，并用超聲儀將之混合均勻；</p><

58、;p>　?。?）用一次性吸管將混合均勻的兩溶液加入三口燒瓶中，30度水浴加熱；</p><p>　?。?）在機(jī)械攪拌作用下，用恒壓滴液漏斗慢慢將3.5mL濃氨加入；</p><p>　?。?）氨水加完后，繼續(xù)劇烈攪拌30min，在滴加氨水的過(guò)程中，可以看到溶液的顏色由橘紅色逐漸變黑色；</p><p>　　（5）用磁鐵將Fe3O4納米粒子吸出，用雙蒸水純化，直

59、到PH=7.0；</p><p>　?。?）在60攝氏度下真空干燥24小時(shí)，研磨得到Fe3O4納米粒子。</p><p>　　2.1.4透射電子顯微鏡（TEM：Transmission electron microscope）掃描</p><p>　　將SPIO納米粒子用雙蒸水配制成100 μg/ mL的納米溶液，超聲使其分散均勻，各取1滴置于銅網(wǎng)上，室溫晾干，于透

60、射電子顯微鏡下觀察形態(tài)并拍照。SPIO納米粒子的TEM下的形態(tài)如圖2.2。</p><p>　　圖2.1 Fe3O4被磁鐵吸引 圖2.2 Fe3O4的TEM圖像</p><p>　　從圖2.1，我們可以看出，制備的Fe3O4被磁鐵吸引，具有較強(qiáng)的磁性。從圖2.2可以看出，F(xiàn)e3O4整體呈類圓形分布，大小均勻的灰色顆粒，較分散，有少許團(tuán)聚現(xiàn)象，團(tuán)聚的納米粒

61、子呈黑色。</p><p>　　隨機(jī)選擇20個(gè)納米粒子進(jìn)行測(cè)量，用Nano Measurer軟件，計(jì)算平均粒徑，可得到下圖2.3的粒徑分布。</p><p>　　圖2.3 Fe3O4納米粒子粒徑分布圖</p><p>　　從圖2.3可以看出，隨機(jī)選擇的20個(gè)納米粒子的尺寸最大值為16.96nm，最小值為12.08nm，用Nano Measurer軟件，計(jì)算平均粒徑

62、為14.05nm，在納米材料的粒徑范圍之內(nèi)。</p><p>　　2.1.5 ICP-MS制樣</p><p>　　將500 μL 0.24mg/mL 的Fe3O4溶液，與500 μL的濃硝酸（HNO3）混合，并在80℃環(huán)境下加熱30 min。再取6 mL的濃硝酸與78 mL的水配成84 mL 5%的稀硝酸。在四氧化三鐵和濃硝酸的混合溶液中加入25 mL稀硝酸。所得樣品送到南京大學(xué)分析測(cè)試

63、中心用ICP-MS儀器檢測(cè)0.24mg/mL 的Fe3O4溶液中Fe3+濃度。</p><p>　　2.1.6 MR掃描</p><p>　?。?）不同濃度Fe3O4納米粒子溶液的制備</p><p>　　首先稱取1.92mg制備好的Fe3O4、3.84mg檸檬酸三鈉，將兩者加入8mL的蒸餾水，充分混合均勻，得到0.24mg/mL的Fe3O4NPs。取0μL、1.2

64、5μL、2.5μL、3.75μL、5μL、6.25μL、7.5μL、8.75μL、10μL、11.25μL、12.5μL的0.24mg/mL的Fe3O4NPs分別溶于300 μL、298.75μL、297.5μL、296.25μL、295μL、293.75μL、292.5μL、291.25μL、290μL、288.75μL、287.5μL的蒸餾水中，用超聲混合均勻，得到濃度分別為0mmol/L、0.005 mmol/L、0.01 mmo

65、l/L、0.016 mmol/L、0.021 mmol/L、0.032 mmol/L、0.037 mmol/L、0.043 mmol/L、0.048 mmol/L、0.053 mmol/L的Fe3O4納米粒子溶液。</p><p>　?。?）MR掃描條件設(shè)置</p><p>　　采用頭顱8通道相控線圈，進(jìn)行T1加權(quán)成像（T2-weighted imaging, T2WI）掃描。 MR掃描參

66、數(shù)為：重復(fù)時(shí)間（Repetition time, TR）4500 ms, 回波時(shí)間（Echo time , TE）90.7 ms，矩陣384×224，視野（Field of view, FOV）14 cm×14 cm，層厚2.0 mm，層距0.2 mm。</p><p>　　（3）不同濃度Fe3O4納米粒子的磁共振信號(hào)響應(yīng)</p><p>　　3.0T MRI掃描樣品的

67、T2值如下表2.1。</p><p>　　表2.1 不同濃度Fe3O4納米粒子的磁共振信號(hào)響應(yīng)</p><p>　　根據(jù)表2.1，用Origin軟件做成下圖2.4。</p><p>　　圖2.4 Fe3O4 NPsT2弛豫率測(cè)定</p><p>　　從圖2.4我們看出，制備的Fe3O4納米粒子的弛豫率為164.5，與文獻(xiàn)中描述的相當(dāng)。且制

68、備的Fe3O4納米粒子的T2弛豫率與濃度呈梯度關(guān)系。表明制備的Fe3O4納米粒子具有優(yōu)良的MRI對(duì)比增強(qiáng)能力，可以用作對(duì)比劑使用。</p><p>　　2.1.7傅里葉變換紅外光譜分析</p><p>　　取少量（約10μL）Fe3O4納米粒子和一定量的溴化鉀，置于電熱恒溫干燥箱中60℃干燥10分鐘之后取出，研磨使之混合均勻，壓成一薄片進(jìn)行測(cè)量。波長(zhǎng)范圍為500-4000cm-1。紅外光譜

69、分析的結(jié)果用Origin作圖，可得下圖2.5。</p><p>　　圖2.5 Fe3O4 紅外光譜圖</p><p>　　圖2.5中顯示Fe3O4在3441 cm-1處有一較強(qiáng)的吸收峰，其代表OH的伸縮振動(dòng)峰，而在1591 cm-1處的吸收峰是C=O的伸縮振動(dòng)峰，兩者皆是Fe3O4表面羧基官能團(tuán)的紅外特征吸收峰，說(shuō)明Fe3O4表面存在羧基。</p><p>　　2

70、.2 PEG-Gd2O3合成</p><p><b>　　2.2.1引言</b></p><p>　　MRI是臨床診斷及臨床前研究的領(lǐng)先技術(shù)，它成像無(wú)組織器官深度局限性，無(wú)電離輻射，可多參數(shù)多平面成像。但是，由于缺乏高弛豫率、低毒或無(wú)毒、體內(nèi)循環(huán)時(shí)間最優(yōu)的理想對(duì)比劑，磁共振在診斷具有特定的分子標(biāo)志物的病變方面及監(jiān)測(cè)藥物治療效應(yīng)方面受到了極大的限制。目前臨床使用的MRI

71、對(duì)比劑Gd-DTPA弛豫率低、體內(nèi)毒性強(qiáng)，所以隨著磁共振應(yīng)用范圍的不斷增加，臨床對(duì)特異性的磁共振對(duì)比劑的需求越來(lái)越強(qiáng)烈。近年來(lái)，分子影像學(xué)取得了巨大的發(fā)展，靶向傳遞能夠增加對(duì)比增強(qiáng)的有效性、減少劑量和毒性，是一種能滿足影像診斷需求的良好策略。因此，靶向特異性的磁共振對(duì)比劑的研發(fā)是十分必要的。目前，已有研究證明氧化釓納米顆粒具有比目前廣泛使用的釓螯合劑更高的弛豫效能?；谘趸徏{米顆?？梢杂米鱐1對(duì)比劑，增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，這一研究吸引了眾多學(xué)

72、者的關(guān)注，引起了廣泛的研究興趣。氧化釓納米顆粒不僅可以增強(qiáng)對(duì)比效果，而且提供與修飾物連接的可能。在本文章中，選擇研究較成熟的PEG-Gd2O3作為陽(yáng)性對(duì)比劑，討論了PEG-Gd2O3的制備及對(duì)MRI信號(hào)響應(yīng)做了評(píng)價(jià)[40]。</p><p>　　2.2.2實(shí)驗(yàn)試劑及器材</p><p><b>　?。?）所用材料：</b></p><p>　　

73、試劑：硝酸釓（北京百靈威科技有限公司）；</p><p>　　聚乙二醇二羧酸poly(ethylene glycol)。</p><p>　　材料：EP管、移液器槍頭、一次性吸管（美國(guó)AXYGEN公司）</p><p><b>　?。?）所用器材：</b></p><p>　　超純水儀（美國(guó)，Milli-Q Refere

74、me）；</p><p>　　智能恒溫磁力攪拌器（上海予華儀器有限公司）；</p><p>　　10μL、 20 mL、100 mL、1000 mL微量移液器，（德國(guó)Eppendorf公司）；</p><p>　　智能恒溫定時(shí)磁力攪拌器，型號(hào)：B12-3（上海司樂(lè)儀器有限公司）；</p><p>　　電子天平，（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；&

75、lt;/p><p>　　電熱恒溫干燥箱，（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；</p><p>　　4℃冰箱，（中國(guó)海爾集團(tuán)）；</p><p>　　紅外光譜儀，型號(hào)：NEXUS870 （美國(guó)Nicolet公司）； </p><p>　　3.0T signal全身磁共振成像設(shè)備，（美國(guó)GE

76、公司）。</p><p>　　2.2.3透析袋前處理</p><p>　　透析袋前處理的基本方法：</p><p>　?。?）把透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度（10-20cm）的小段；</p><p>　?。?）在1000mL的燒杯中加入2%（W/V）的碳酸氫鈉和1mmol/L EDTA.2Na（PH=8）（稱取10g碳酸氫鈉和186.6mg EDTA.

77、2Na溶于500mL蒸餾水，混合均勻），加入透析袋煮沸10分鐘；</p><p>　?。?）用蒸餾水徹底清洗透析袋；</p><p>　?。?）在1000mL的燒杯中加入1mmol/L EDTA.2Na（PH=8）（稱取186.6mg EDTA.2Na溶于500mL蒸餾水，混合均勻），在第（3）步中的透析袋加入進(jìn)去，煮沸10分鐘；</p><p>　?。?）冷卻后，

78、置于50%的酒精中，放于4℃冰箱，確保透析袋始終浸沒(méi)在溶液內(nèi)。</p><p><b>　　2.2.4實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p>　?。?）稱取0.4062g硝酸釓加入三口燒瓶中，注意不要沾到燒瓶壁上；</p><p>　　（2）在三口燒瓶中滴加10mL聚乙二醇二羧酸poly(ethylene glycol)，混合均勻；</p>

79、;<p>　?。?）用恒溫磁力攪拌器加熱到90-100℃，得到澄清溶液；</p><p>　?。?）升溫到140℃加熱1小時(shí)；</p><p>　?。?）繼續(xù)升溫到180℃加熱4小時(shí)；</p><p>　　（6）將冷卻的溶液加入到之前準(zhǔn)備好的透析袋中，在2000mL的大燒杯中透析3天，每8小時(shí)換一次水（蒸餾水）；</p><p>

80、;　?。?）將透析好的PEG-Gd2O3裝入50mL的離心管中，放入4℃冰箱備用。</p><p>　　2.2.5 MR掃描</p><p>　　根據(jù)文獻(xiàn)，氧化釓納米材料的弛豫率比目前臨床使用的Gd-DTPA高，為了討論Gd-DTPA和PEG-Gd2O3的弛豫率高低，分別把PEG-Gd2O3和Gd-DTPA配成10個(gè)不同濃度進(jìn)行3.0T MRI掃描。</p><p>

81、;　?。?）不同濃度Gd-DTPA溶液的制備</p><p>　　首先取10個(gè)1.5mL的EP管，分別編號(hào)為1—10。在10個(gè)EP管中,分別加入360μLGd-DTPA、240μL蒸餾水，240μLGd-DTPA、360μL蒸餾水，120μLGd-DTPA、480μL蒸餾水，60μLGd-DTPA、540μL蒸餾水，48μLGd-DTPA、552μL蒸餾水，36μLGd-DTPA、564μL蒸餾水，24μLGd-

82、DTPA、576μL蒸餾水，12μLGd-DTPA、588μL蒸餾水，6μLGd-DTPA、594μL蒸餾水，1.2μLGd-DTPA、598.8μL蒸餾水，總量均為600μL。分別制成濃度為3mmol/L、2 mmol/L、1 mmol/L、0.5 mmol/L、0.4 mmol/L、0.3 mmol/L、0.2 mmol/L、0.1 mmol/L、0.05 mmol/L、0.01 mmol/L的Gd-DTPA溶液。</p>

83、;<p>　?。?）不同濃度PEG-Gd2O3溶液的制備</p><p>　　配制不同濃度PEG-Gd2O3：首先取10個(gè)1.5mL的EP管，分別編號(hào)為1—10。在10個(gè)EP管中,分別加入600μL PEG-Gd2O3，300μL PEG-Gd2O3、300μL蒸餾水，240μL PEG-Gd2O3、360μL蒸餾水，180μL PEG-Gd2O3、420μL蒸餾水，120μL PEG-Gd2O3、

84、480μL蒸餾水，60μL PEG-Gd2O3、540μL蒸餾水，30μL PEG-Gd2O3、570μL蒸餾水，12μL PEG-Gd2O3、588μL蒸餾水，6μL PEG-Gd2O3、594μL蒸餾水，3μL PEG-Gd2O3、597μL蒸餾水，總量均為600μL。分別制成濃度為0.3mmol/L、0.15 mmol/L、0.12 mmol/L、0.09 mmol/L、0.06 mmol/L、0.03 mmol/L、0.015

85、mmol/L、6 μmol/L、3 μmol/L、1.5 μmol/L的PEG-Gd2O3溶液。</p><p>　　將不同濃度的Gd-DTPA和不同濃度的PEG-Gd2O3進(jìn)行MRI掃描，MRI掃描條件設(shè)置同2.1.5。所得的T1弛豫時(shí)間用Origin軟件做成下圖2.6。</p><p>　　圖2.6 不同濃度PEG-Gd2O3及Gd-DTPA的磁共振響應(yīng)</p><

86、;p>　　從圖2.6可以看出兩點(diǎn)：首先不同濃度PEG-Gd2O3的T1弛豫時(shí)間的回歸方程為：y=0.48056+29.00451x，弛豫率為：29.00451。不同濃度Gd-DTPA的T1弛豫時(shí)間的回歸方程為：y=0.4892+4.20993x，弛豫率為4.20993。也就是說(shuō)，PEG-Gd2O3的T1弛豫率是目前使用的Gd-DTPA T1弛豫率的七倍多。弛豫率越高。成像效果越好。為了得到同樣具有診斷價(jià)值的圖像，所需PEG-Gd2

87、O3的濃度僅為Gd-DTPA的七分之一，所需對(duì)比劑的量大大減少，降低了細(xì)胞毒性，減少對(duì)人體的傷害。其次PEG-Gd2O3磁共振信號(hào)按濃度呈現(xiàn)梯度性響應(yīng)并且其弛豫率達(dá)到29.00451，表明制備的PEG-Gd2O3納米粒子具有優(yōu)良的MRI對(duì)比增強(qiáng)能力，可以用作對(duì)比劑使用。</p><p>　　2.2.6傅里葉變換紅外光譜分析</p><p>　　取少量（約10μL）PEG-Gd2O3和一定量

88、的溴化鉀，置于電熱恒溫干燥箱中60℃干燥10分鐘之后取出，研磨使之混合均勻，壓成一薄片進(jìn)行測(cè)量，波長(zhǎng)范圍為500-4000cm-1。紅外光譜分析的結(jié)果用Origin作圖，可得下圖2.7。</p><p>　　圖2.7 PEG-Gd2O3紅外光譜圖</p><p>　　圖2.7顯示PEG-Gd2O3 在1616 cm-1處的吸收峰是C=O的伸縮振動(dòng)峰,PEG鏈上的C-O-C和C-H的伸縮振

89、動(dòng)峰分別出現(xiàn)在1100cm-1和2867cm-1處，1451cm-1、1349cm-1、1250cm-1處的吸收峰是由于CH2的伸縮振動(dòng)導(dǎo)致的。PEG-Gd2O3制備成功。</p><p><b>　　2.3 胱胺合成</b></p><p><b>　　2.3.1引言</b></p><p>　　胱胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)很特殊，其

90、表面含有有個(gè)氨基（NH）和一個(gè)雙硫鍵，四氧化三鐵和氧化釓表面都含有羧基（CO），通過(guò)胱胺表面的兩個(gè)氨基可以把四氧化三鐵和氧化釓連在胱胺的兩邊。中間通過(guò)雙硫鍵連接，由于雙硫鍵的特殊結(jié)構(gòu)，其可以被在腫瘤組織中高表達(dá)的谷胱甘肽及強(qiáng)還原物質(zhì)打開(kāi)，在體內(nèi)只能被谷胱甘肽打開(kāi)，所以可以用于人體用于對(duì)腫瘤的特異性診斷。當(dāng)雙硫鍵沒(méi)有被打開(kāi)時(shí)，由于四氧化三鐵產(chǎn)生的強(qiáng)磁場(chǎng)對(duì)氧化釓的淬滅作用，MRI T1為黑色或灰色，但當(dāng)雙硫鍵被GSH打開(kāi)時(shí)，T1信號(hào)變明亮，

91、則提示腫瘤組織的存在。其作用原理如下圖2.8。</p><p>　　圖2.8 可激活MRI納米探針作用原理圖</p><p>　　2.3.2實(shí)驗(yàn)試劑及器材</p><p><b>　　（1）所用材料：</b></p><p>　　試劑：半胱胺酸（北京百靈威科技有限公司）；</p><p>　　氫

92、氧化鈉（滬試，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；</p><p>　　二氯甲烷（滬試，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。</p><p>　　材料：EP管、移液器槍頭、一次性吸管（美國(guó)AXYGEN公司）</p><p><b>　?。?）所用器材：</b></p><p>　　超純水儀（美國(guó)，Milli-Q Refereme）；&l

93、t;/p><p>　　智能恒溫定時(shí)磁力攪拌器，型號(hào)：B12-3（上海司樂(lè)儀器有限公司）；</p><p>　　10μL、 20 mL、100 mL、1000 mL微量移液器，（德國(guó)Eppendorf公司）； </p><p>　　旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，型號(hào)：RE-52AA，（上海亞榮生化儀器廠）；</p><p>　　SHZ-

94、D（III）循環(huán)水式真空泵，（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；</p><p>　　舒美超聲波清洗器，型號(hào)：KQ218（昆山市超聲儀器有限公司）；</p><p>　　電子天平，（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；</p><p>　　電熱恒溫干燥箱，（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；</p><p>　　4℃冰箱，（中國(guó)海爾集團(tuán)）。

95、 </p><p><b>　　2.3.3實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p>　　（1）稱取1.7g半胱胺酸和0.88g氫氧化鈉，溶于300mL蒸餾水，超聲使之混合均勻；</p><p>　　（2）常溫下磁力攪拌30分鐘得到透明液體；</p><p>　　（3）按照1:1的比例?。?

96、）中制好的液體和二氯甲烷在分液漏斗中進(jìn)行粹取（混勻、放氣連續(xù)三次），粹取完的液體分成兩層（一層水相，一層油相），收集下面的二氯甲烷在30℃的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；</p><p>　?。?）重復(fù)（3）直到所有（2）制好的液體粹取蒸發(fā)完，得到淡黃色透明液體，即胱胺。</p><p><b>　　2.4討論</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)利用化學(xué)沉淀

97、法制備Fe3O4納米粒子，并通過(guò)透射電鏡、MRI響應(yīng)、傅里葉紅外光譜分析對(duì)制備的Fe3O4納米粒子的特性進(jìn)行表征；通過(guò)MRI響應(yīng)、傅里葉紅外光譜分析對(duì)制備的PEG-Gd2O3納米粒子的特性進(jìn)行表征；通過(guò)傅里葉紅外光譜分析對(duì)制備的胱胺進(jìn)行表征。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明Fe3O4納米粒子、PEG-Gd2O3納米粒子以及“連接物”胱胺制備成功，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　3 可激活MRI納米探針Fe3O4-SS-Gd2

98、O3的制備</p><p>　　為了確定可激活對(duì)比劑中四氧化三鐵（Fe3O4）納米粒子和氧化釓（PEG-Gd2O3）的最佳濃度，需要四氧化三鐵和氧化釓的濃度進(jìn)行優(yōu)化處理。用控制單一變量的方法，首先確定一個(gè)氧化釓的量，通過(guò)改變四氧化三鐵的濃度，配制溶液進(jìn)行MRI掃描，得到四氧化三鐵的最佳濃度；然后再同理按照上述方法，確定最佳氧化釓和谷胱甘肽的濃度。</p><p>　　3.1 Fe3O4-S

99、S-Gd2O3的傅里葉變換紅外光譜分析</p><p>　　為了驗(yàn)證Fe3O4表面及PEG-Gd2O3表面的羧基與胱胺上的氨基共價(jià)結(jié)合成Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針，我們將稀釋的Fe3O4-COOH、PEG-Gd2O3、Gd2O3-cystamine和Gd2O3-SS- Fe3O4納米探針進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析。紅外光譜分析的結(jié)果用Origin作圖，可得下圖3.1。</p><p&

100、gt;　　圖3.1 納米探針組裝的紅外光譜圖</p><p>　　圖3.1中顯示PEG-Gd2O3與胱胺反應(yīng)后，出現(xiàn)游離的氨基，在3300-3500cm-1之間出現(xiàn)雙峰，同時(shí)羧基中的C=O向低頻移動(dòng)，為酰氨鍵中的C=O，與Fe3O4-COOH進(jìn)一步結(jié)合后，游離的NH2消失，說(shuō)明與Fe3O4上的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)。說(shuō)明Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針共價(jià)組裝的成功制備。</p><p>

101、　　3.2不同濃度四氧化三鐵（Fe3O4）納米粒子對(duì)MRI信號(hào)的影響</p><p>　　首先準(zhǔn)備PEG-Gd2O3-SS-NH2：取一定量的PEG-Gd2O3和乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC），在37℃電熱恒溫水槽(DK-8D)中孵育15min，之后加入與EDC等量的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和少許胱胺，繼續(xù)孵育2小時(shí)。</p><p>　　取5個(gè)1.5mL的EP管，編號(hào)為

102、1—5，在其中都加入500μL的PEG-Gd2O3-SS-NH2；然后再分別在5個(gè)EP管中加入0.24mg/mL的Fe3O450μL（其中含F(xiàn)e3O40.012mg）、100μL（其中含F(xiàn)e3O4 0.024mg）、150μL（其中含F(xiàn)e3O4 0.036mg）、200μL（其中含F(xiàn)e3O4 0.048mg）、250μL（其中含F(xiàn)e3O4 0.06mg）；在用移液器分別在5個(gè)EP管中加入蒸餾水216.7μL、163.2μL、110μL、

103、56.6μL、3.4μL，配成總量一定的5個(gè)溶液。用高速冷凍離心機(jī)在10000轉(zhuǎn)每分的條件離心10min，倒掉上清液，并分別分散于500μL蒸餾水中，最終制成5個(gè)Fe3O4濃度不同的Fe3O4-SS-Gd2O3溶液。</p><p>　　為了便于對(duì)比分析，每個(gè)樣品分別配2管掃M(jìn)RI，其中一管加250μL Fe3O4-SS-Gd2O3溶液和10μL蒸餾水，另一管加250μL Fe3O4-SS-Gd2O3溶液和與蒸餾

104、水等量的谷胱甘肽（10mM GSH）。制成共10個(gè)樣品掃M(jìn)RI。結(jié)果如圖3.2。</p><p>　　圖3.2 不同濃度Fe3O4下GSH的MRI信號(hào)響應(yīng)</p><p>　　從圖3.2可以看出，當(dāng)有谷胱甘肽存在時(shí)，磁共振信號(hào)比沒(méi)有谷胱甘肽時(shí)的磁共振信號(hào)亮度明顯增強(qiáng)，當(dāng)Fe3O4納米粒子的含量為0.036mg時(shí)，圖像的信噪比最大。所以，最終選擇的Fe3O4最佳濃度為0.24mg/mL 1

105、50μL，也即四氧化三鐵質(zhì)量為0.036mg時(shí)，圖像信噪比最大，圖像質(zhì)量最高。</p><p>　　3.3不同濃度氧化釓（PEG-Gd2O3）對(duì)MRI信號(hào)的影響</p><p>　　首先也是準(zhǔn)備PEG-Gd2O3-SS-NH2：取一定量的PEG-Gd2O3和乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC），在37℃電熱恒溫水槽(DK-8D)中孵育15min，之后加入與EDC等量的N-羥基琥珀酰

106、亞胺（NHS）和少許胱胺，繼續(xù)孵育2小時(shí)。由于本實(shí)驗(yàn)中Fe3O4的量固定不變，所以EDC和NHS的量都不需改變。</p><p>　　由3.2可知，四氧化三鐵的最佳濃度為：0.036mg，所以在討論氧化釓的最佳濃度時(shí)，四氧化三鐵的濃度取最佳濃度。又由于在3.1中對(duì)四氧化三鐵濃度優(yōu)化時(shí)，選擇氧化釓量為500μL，因此本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的氧化釓的濃度改變時(shí)必須包括500μL。</p><p>　　然

107、后取7個(gè)1.5mL的EP管，編號(hào)為1—7，在其中都加入150μL的0.24mg/mL的Fe3O4；然后分別在7個(gè)EP管中加入制備好的PEG-Gd2O3-SS-NH2100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、800μL；再用移液器分別在5個(gè)EP管中加入蒸餾水700μL、600μL、500μL、400μL、300μL、200μL、0μL，配成總量一定的7個(gè)溶液。用高速冷凍離心機(jī)在10000轉(zhuǎn)每分的條件離心10m

108、in，倒掉上清液，并分別分散于500μL蒸餾水中，最終制成7個(gè)PEG-Gd2O3濃度不同的Fe3O4-SS-Gd2O3溶液。</p><p>　　為了便于對(duì)比分析，每個(gè)樣品分別配2管掃M(jìn)RI，其中一管加250μL Fe3O4-SS-Gd2O3溶液和10μL蒸餾水，另一管加250μL Fe3O4-SS-Gd2O3溶液和與蒸餾水等量的谷胱甘肽（10mM GSH）。制成共14個(gè)樣品掃M(jìn)RI。結(jié)果如圖3.3。</p

109、><p>　　圖3.3 不同濃度PEG-Gd2O3下GSH的MRI信號(hào)響應(yīng)</p><p>　　從圖3.3可以看出，當(dāng)有谷胱甘肽存在時(shí)，磁共振信號(hào)比沒(méi)有谷胱甘肽時(shí)的磁共振信號(hào)明顯變明亮許多，當(dāng)PEG-Gd2O3為500μL時(shí)，圖像信噪比最大。所以認(rèn)為PEG-Gd2O3的最佳濃度為500μL，當(dāng)PEG-Gd2O3濃度為500μL時(shí)，圖像信噪比最大，圖像質(zhì)量最高。</p><

110、p>　　3.4谷胱甘肽（GSH）對(duì)T1弛豫率的影響</p><p>　　按照3.1和3.2描述的方法制備Fe3O4-SS-Gd2O310mL，準(zhǔn)備14個(gè)0.5mL的EP管，分別編號(hào)為a1-a7（沒(méi)有谷胱甘肽）、p1-p7（有谷胱甘肽），在a1-a7中分別加入250μL Fe3O4-SS-Gd2O3、10μL蒸餾水，200μL Fe3O4-SS-Gd2O3、60μL蒸餾水，150μL Fe3O4-SS-Gd2