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文檔簡介
1、目的:
一、合成歸巢肽CREKA并驗證其對腫瘤間質纖維蛋白的靶向性,為進一步的探針制備和腫瘤靶向成像奠定基礎。
二、制備聚乳酸包被的超順磁性氧化鐵納米粒SPIO-PLA和靶向性分子探針SPIO-PLA-CREKA,通過理化性質的表征及體外纖維蛋白凝塊的磁共振成像實驗,探討SPIO-PLA-CREKA作為磁共振靶向對比劑的可行性。
三、通過小鼠腫瘤模型的體內磁共振成像實驗,評價靶向性分子探針SPI
2、O-PLA-CREKA對腫瘤的診斷價值。
方法:
一、歸巢肽CREKA的合成和靶向性驗證
1、歸巢肽CREKA的合成
以Wang樹脂為載體,配合Fmoc氨基保護策略,固相合成五肽CREKA。第一個氨基酸與樹脂的連接采用對稱酸酐法,反應結束后用適量的吡啶和乙酸酐封閉樹脂上剩余的活性位點。后續(xù)氨基酸以HOBt/HBTU/DIEA為縮合劑依次連接。反應完成后,以三氟乙酸為主切割試劑將目的
3、肽段從樹脂上裂解下來。合成產物經高效液相色譜分離、純化、分析,質譜分析鑒定。
2、異硫氰酸熒光素( FITC)標記CREKA
在合成五肽CREKA的終末,即最后一位氨基酸半胱氨酸縮合反應完成后,用同樣的方法將一個手臂氨基酸6-氨基己酸(Ahx)連接到樹脂肽的氨基端。通過FITC與Ahx上的氨基反應,將FITC標記在五肽CREKA的氨基端,生成終產物FITC-Ahx-CREKA。反應完成后,以三氟乙酸為主切割試
4、劑將目的肽段從樹脂上裂解下來。合成產物經高效液相色譜分離、純化,質譜分析鑒定。
3、FITC-Ahx-CREKA與血漿纖維蛋白凝塊體外結合實驗
取人鮮血約10ml,用0.4%枸櫞酸鈉抗凝;2500rpm離心10min,除去血細胞,收集血漿再次離心除去剩余的血細胞,收集血漿置—80℃冰凍片刻。向血漿內加入氯化鈣(CaCl2)溶液至Ca2+濃度為20mmol/L。混勻后放置于37℃恒溫水浴,直到凝塊形成。制備的血
5、漿蛋白凝塊用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復清洗、離心,除去表面殘留的各種血清蛋白。將血漿纖維蛋白凝塊6等分,隨機平分為兩組,一組浸于FITC-Ahx-CREKA的PBS溶液,另一組浸于PBS中,放37℃恒溫水浴30min。取出凝塊,并用PBS反復清洗,離心,除去未結合的FITC-Ahx-CREKA。紫外燈照射35秒后,熒光顯微鏡下觀察并照相。
4、FITC-Ahx-CREKA與腫瘤組織切片體外結合實驗
取福爾馬林
6、固定的裸鼠卵巢癌移植瘤( SKOV-3)組織一塊,用OTC包埋后作3μm厚的冰凍切片,附貼于潔凈的載玻片上,固定。固定好的SKOV-3組織冰凍切片,去離子水沖洗。用FITC-Ahx-CREKA溶液孵育組織片30min,去離子水清洗3次,去除未結合的FITC-Ahx-CREKA。用紫外燈照射35秒后,熒光顯微鏡下觀察并照相。然后將SKOV-3組織冰凍切片做HE染色。
5、小鼠腎癌Renca細胞的培養(yǎng)和動物模型的建立
7、 小鼠腎癌Renca細胞復蘇后,以DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)箱。在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48h后,用胰蛋白酶消化,臺盼藍染色并計數(shù),細胞存活率在98%以上。無菌選取對數(shù)生長期瘤細胞,消化離心后棄去上清,加生理鹽水洗滌,800rpm離心5min,棄上清,重復洗滌一次;生理鹽水調整細胞濃度至106/ml。Balb/c小鼠左側后背部皮膚常規(guī)消毒后,將細胞懸液接種至小鼠左側后背部皮下,每只小鼠接種0.1ml。常規(guī)飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)
8、。
6、FITC-Ahx-CREKA與腫瘤組織體內結合實驗
皮下荷Renca腎癌移植瘤Balb/c小鼠,腫瘤直徑約1.0cm時,尾靜脈注射FITC-Ahx-CREKA200μg/0.1ml生理鹽水。6小時后處死小鼠,取腫瘤組織,一半液氮冷凍,做冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察并照相;另一半福爾馬林固定,石蠟包埋切片,HE染色。
二、SPIO-PLA-CREKA的制備、表征和體外成像
1、
9、SPIO-PLA-CREKA納米粒的制備和表征
(1) SPIO-PLA的制備
將0.39g FeCl2·4H2O和1.08g FeCl3·6H2O溶于20ml去離子水中,配成Fe2+和Fe3+摩爾比1:2的反應溶液。向反應體系加入適量的左旋聚乳酸(PLA),磁力攪拌器劇烈攪拌下,緩慢滴加氫氧化鈉(NaOH)溶液至pH值為10;密閉反應容器,室溫下劇烈攪拌過夜。反應溶液依次用轉速為1000、5000、1000
10、0、15000rpm梯度離心,收集上層懸液。懸液用截留分子量10000的透析袋透析,透析液為標準PBS,每24h更換透析液一次,在4℃條件下共透析3天,除去多余的PLA。透析后獲得的SPIO-PLA經0.22μm微孔濾膜過濾除菌,濾過液分裝,密封后放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> (2) SPIO-PLA-CREKA的制備
稱取1.20mg EDC-HCl,用100μl碳酸鹽緩沖液(pH值8.3)溶解后,在磁力攪拌器攪
11、拌下滴加到1ml的SPIO-PLA懸液中;再取1.27mg sulf-NHS,用100μl碳酸鹽緩沖液(pH值8.3)溶解后,滴加到反應體系;持續(xù)攪拌反應10min。將5.0mg CREKA用500μl碳酸鹽緩沖液(pH值8.3)溶解后,滴加到反應體系,攪拌反應2h。反應液經分子篩柱層析(Sepharose4 Fast Flow,GE)分離、純化。純化后的SPIO-PLA-CREKA經0.22μm微孔濾膜過濾除菌,濾過液分裝,密封后存放
12、于4℃保存?zhèn)溆谩?br> (3) SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA的表征
H-600型透射電鏡觀察SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA的形態(tài)和大小。用HYL-1080型激光粒度分布儀V2.0測定SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA的粒徑及分布。紅外光譜儀檢測干燥后的SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA,對比分析二者的紅外吸收光譜。
(4) MR成像實驗和T2弛
13、豫時間測定
配制6管鐵濃度分別為的0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mmol/L的SPIO-PLA-CREKA和SPIO-PLA懸液。Philips Achieva1.5T磁共振掃描儀獲得SE序列T2WI圖像,評價負性強化效果。并測定各管的T2弛豫時間。T2WI掃描條件:TR:527.3,TE:50ms,F(xiàn)OV:230×230mm,matrix:256×205,層厚:5mm。T2時間測定:TR:2000ms;
14、 TE:30~960ms,32回波,F(xiàn)OV:230×230mm,matrix:256×205,層厚:2mm,帶寬:40;激發(fā)次數(shù)為3次。
2、血漿纖維蛋白凝塊的體外MR成像實驗
制備13個血漿纖維蛋白凝塊,方法:取13個試管,每管內10ml抗凝后血漿;然后再向每管內加CaCl2溶液至濃度為20mmol/L,混勻后置37℃水浴4h;待凝塊形成后用3500rpm離心10min,棄去上清;PBS反復清洗、離心,去除
15、表面殘留的各種血清蛋白。
將血漿纖維蛋白凝塊隨機分為SPIO-PLA組和SPIO-PLA-CREKA組,每組6管,剩余一個為空白對照管。SPIO-PLA組再隨機分為SPIO-PLA1h和SPIO-PLA6h兩亞組,各3個管;SPIO-PLA-CREKA組也隨機分為SPIO-PLA-CREKA1h組和SPIO-PLA-CREKA6h兩亞組,各3個管。
SPIO-PLA1h組3個管分別加入濃度為1.6、0.8、0
16、.4mmol/L的SPIO-PLA懸液0.5ml,置37℃水浴1h; SPIO-PLA6h組3個管分別加入濃度為1.6、0.8、0.4mmol/L的SPIO-PLA懸液0.5ml,置37℃水浴6h; SPIO-PLA-CREKA1h組分別加入濃度為1.6、0.8、0.4mmol/L的SPIO-PLA-CREKA懸液0.5ml,置37℃水浴1h; SPIO-PLA-CREKA6h組分別加入濃度為1.6、0.8、0.4mmol/L的SPIO
17、-PLA-CREKA懸液0.Sml,置37℃水浴6h??瞻讓φ展懿蛔鲗Ρ葎┨幚?。孵育后,所有凝塊經PBS反復清洗、離心,除去未結合的對比劑。
Philips Achieva1.5T磁共振掃描儀,TSE序列采集T2WI圖像,TR:4015.3ms,TE:110ms, FOV:230×230mm, matrix:256×205,層厚:2mm。
3、抑制實驗
新鮮血漿制備9個血漿纖維蛋白凝塊,方法同上
18、,分別放入9個小的離心管內,隨機分為A、B、C組,每組3管。先取5mg CREKA肽,用1.5ml PBS溶解,加到A組的3個管內,每管0.5ml。B組和C組各管均加0.5ml PBS。然后分別向A、B組各管加入鐵濃度為1.6mmol/L的SPIO-PLA-CREKA,各0.5ml;C組各加0.5ml鐵濃度為1.6mmol/L的SPIO-PLA。三組凝塊均置37℃水浴1h。取出血漿纖維蛋白凝塊,用PBS反復清洗。Philips Achi
19、eva1.5T磁共振掃描儀,TSE序列采集T2WI圖像,具體掃描參數(shù)同上。
三、腫瘤間質靶向磁共振分子成像
1、小鼠腎癌Renca細胞培養(yǎng)和動物模型的建立
小鼠腎癌Renca細胞培養(yǎng)于適量DMEM完全培養(yǎng)基,37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48h后,用胰蛋白酶消化,臺盼藍染色并計數(shù),細胞存活率在98%以上。無菌選取對數(shù)生長期瘤細胞,消化離心后棄去上清,加生理鹽水沖洗,800rpm離心5min,
20、重復洗滌一次;生理鹽水調整細胞濃度至106/ml。常規(guī)消毒皮膚后,將細胞懸液接種至Balb/c小鼠左側后背部皮下,每只小鼠接種0.1ml。常規(guī)飼養(yǎng)14-18天,待皮下腫瘤結節(jié)形成并長大至直徑1.5cm左右時成像。
2、小鼠腎癌模型的MR成像
將皮下荷Renca腎癌移植瘤Balb/c小鼠隨機分為實驗組和對照組。用戊巴比妥鈉(30mg/kg)按體重腹腔注射麻醉小鼠。將麻醉后小鼠固定于自制泡沫鼠床上,平掃獲得T2W
21、I圖像。增強掃描:實驗組小鼠尾靜脈注射SPIO-PLA-CREKA,劑量為5mg Fe/kg體重;對照組小鼠尾靜脈注射SPIO-PLA,劑量為5mg Fe/kg體重。分別采集對比劑注射后60min、120min、180min各時間點兩組小鼠增強數(shù)據(jù),觀察各時間點腫瘤增強情況。Philips Achieva1.5T磁共振掃描儀,膝關節(jié)線圈,TSE序列T2WI橫斷面掃描:TR:3047ms,TE:100ms,F(xiàn)OV:230×230mm,層厚
22、:5mm, matrix:256×205。
圖像分析:測量感興趣區(qū)(Region of interest,ROI)內信號強度(signalintensity,SI),計算腫瘤在對比劑注射前和注射后各時間點的信噪比(signal tonoise ratio,SNR)。方法:在腫瘤內勾畫盡可能大的ROI,測量ROI內信號強度,每個腫瘤測量3次,取平均值,記為SIt;在與腫瘤同層面背景區(qū)域選取較大的ROI,測量背景噪聲SIn。計
23、算兩組腫瘤組織的信噪比SNR=SIt/SIn。
3、統(tǒng)計學分析
采用SPSS13.0統(tǒng)計處理軟件。SPIO-PLA-CREKA和SPIO-PLA增強前后不同時間點腫瘤SNR的比較采用重復測量方差分析。組內增強前后各時間點腫瘤SNR的多重比較采用Bonfferoni法。增強前和增強后各時間點兩組間SNR的比較采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
4、組織病理學檢查
24、 磁共振掃描結束后處死小鼠,切取腫癌組織,用福爾馬林固定,石蠟包埋。將石蠟包埋組織塊置切片機組織支承器上,做3μm厚的組織切片,置于潔凈的載玻片上,37℃干燥過夜。分別做HE染色,普魯士藍染色和伊紅復染。
結果:
一、歸巢肽CREKA的合成和靶向性驗證
1、歸巢肽CREKA的合成
固相合成的歸巢肽CREKA為白色粉末。經質譜分析鑒定,主峰分子量(m/z:[M+H]+)為606
25、.0,與CREKA的理論分子量604.71相符,證明合成正確。經HPLC純化、分析,合成的CREKA純度為99.65%。
2、FITC-Ahx-CREKA的合成
FITC通過Ahx連接到五肽CREKA的氨基端,形成熒光肽FITC-Ahx-CREKA。合成產物為淡黃色粉末,經質譜分析鑒定,主峰分子量為(m/z:[M+H]+)1108.5,與FITC-Ahx-CREKA的理論分子量1107.61相符,證明合成正確
26、。經HPLC純化分析,合成的FITC-Ahx-CREKA的純度為98.13%。
3、FITC-Ahx-CREKA與血漿纖維蛋白凝塊體外結合實驗
經FITC-Ahx-CREKA溶液孵育的血漿纖維蛋白凝塊,經PBS清洗除去未結合的FITC-Ahx-CREKA后,在熒光顯微鏡下可見綠色熒光,空白對照血漿蛋白凝塊無綠色熒光,證明FITC-Ahx-CREKA可以與血漿纖維蛋白凝塊特異性結合。
4、FITC
27、-Ahx-CREKA與腫癌組織體外結合實驗
SKOV-3組織冰凍切片經FITC-Ahx-CREKA孵育后,PBS清洗去除非特異性結合的FITC-Ahx-CREKA,熒光顯微鏡下腫瘤組織切片內見環(huán)狀綠色熒光。HE染色證實FITC-Ahx-CREKA的綠色熒光出現(xiàn)的部位為腫瘤血管壁和血管周圍間質。
5、小鼠Renca腎癌模型的建立
6只Balb/c小鼠皮下接種小鼠Renca細胞,飼養(yǎng)14天后,有4只
28、小鼠左側后背部皮下可觸及瘤結節(jié),1只未見腫瘤生長,1只腫瘤沿皮膚生長,皮膚表面破潰,未形成瘤結節(jié)。
6、FITC-Ahx-CREKA與腫瘤組織體內結合實驗
熒光顯微鏡下見冰凍切片腫瘤組織內見大量綠色熒光,呈彌漫性分布,而正常組織內未見綠色熒光。石蠟切片HE染色,腫瘤細胞有明顯異型性,核大深染,有明顯核仁,可見較多病理性分裂像。證實靶向分子探針FITC-Ahx-CREKA在活體內可以與腫瘤組織特異性結合。
29、> 二、SPIO-PLA-CREKA的制備、表征和體外成像
1、SPIO-PLA-CREKA納米粒的制備和表征
所制備的SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA均為棕黑色懸液,原子吸收分光光度法測定鐵含量分別為182.8mmol/L和167.4mmol/L。透射電子顯微鏡下見制備的SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA納米顆粒呈球形殼核結構,即氧化鐵顆粒核心包裹在較厚聚乳酸內,大小均勻。紅
30、外光譜分析證實SPIO-PLA成功標記CREKA。粒度分析儀測定SPIO-PLA納米粒中位粒徑124nm,體積平均粒徑為133nm,面積平均徑85nm,均勻性0.461。SPIO-PLA-CREKA中位粒徑136nm,體積平均粒徑為150nm,面積平均徑88nm,均勻性0.507。
不同濃度SPIO-PLA-CREKA和SPIO-PLA懸液經MR掃描SE序列T2WI圖像顯示:SPIO-PLA及SPIO-PLA-CREKA懸
31、液的T2信號均隨濃度的增加而減低。同濃度條件下SPIO-PLA-CREKA靶向對比劑的T2信號強度低于SPIO-PLA。T2時間測量結果顯示:隨著對比劑濃度的增高,T2時間逐漸縮短。同濃度條件下SPIO-PLA-CREKA靶向對比劑的T2值小于SPIO-PLA。說明本實驗制備的SPIO-PLA對比劑及SPIO-PLA-CREKA靶向對比劑均具有負性造影效果,并存在一定的濃度效應關系,即在一定濃度范圍內,濃度越高,T2WI負性強化作用越明
32、顯。
2、血漿纖維蛋白凝塊的體外MR成像
在T2WI圖像上,SPIO-PLA組血漿蛋白凝塊的信號強度與空白對照管無明顯差別。SPIO-PLA-CREKA組血漿蛋白凝塊的信號強度明顯低于空白對照管,且隨著濃度的增高,信號降低越明顯。SPIO-PLA-CREKA組的兩個亞組中,6h組的信號強度明顯低于1h組。
3、抑制實驗
只用SPIO-PLA-CREKA孵育的血漿纖維蛋白凝塊信號強度
33、較SPIO-PLA對照管明顯減低,而游離的CREKA和SPIO-PLA-CREKA共同孵育的血漿纖維蛋白凝塊信號強度較SPIO-PLA輕度減低。
三、腫瘤間質靶向磁共振分子成像
1、小鼠腎癌腫瘤模型的建立
15只Balb/c小鼠左側后背部皮下接種Renca腎癌細胞懸液,飼養(yǎng)14天后,有12只小鼠接種部位可觸及瘤結節(jié),18天后,腫瘤增大至直徑1.5cm左右,用游標卡尺精確測量,移植瘤平均最大徑為1
34、.45±0.43cm。建模成功率80%(12/15)。
2、小鼠腎癌模型的MR成像
TSE序列T2WI掃描結果顯示,平掃腫瘤呈均勻的高信號。增強掃描,實驗組小鼠尾靜脈注射SPIO-PLA-CREKA后,腫瘤信號強度逐漸減低;對照組小鼠尾靜脈注射SPIO-PLA后,腫瘤信號強度無明顯變化。
統(tǒng)計學分析,對比劑注射前后腫瘤SNR有顯著性差異(F時間=88.249,P<0.001)。對比劑和時間之間存
35、在交互效應(F對比劑×時間=59.462,P<0.001)。SPIO-PLA-CREKA組腫瘤的SNR顯著低于SPIO-PLA組(F對比劑=33.097,P<0.001)。
增強前后各時間點兩組間SNR的比較:注射前及注射后60min,SPIO-PLA-CREKA組和SPIO-PLA組間腫瘤SNR均無顯著性差異(30.08±0.66vs.30.13±0.76, t=0.122, P=0.905;29.48±0.82 vs.
36、29.97±0.85, t=1.002,P=0.340);注射對比劑后120min,SPIO-PLA-CREKA組腫瘤SNR顯著低于及SPIO-PLA組(27.37±1.14 vs.29.62±0.68,t=4.159,P=0.002);注射對比劑后180min,SPIO-PLA-CREKA組腫瘤的SNR顯著低于SPIO-PLA組(24.22±0.48vs.29.53±0.56; t=17.652, P<0.001)。
3
37、、組織病理學檢查
顯微鏡下見SPIO-PLA-CREKA組未染色腫癌組織切片血管壁及血管周圍出現(xiàn)大量褐色鐵顆粒沉著,沿血管彌漫性分布,而正常組織內未見鐵顆粒沉著。普魯士藍染色見腫瘤組織內血管壁及血管周圍顆粒藍染,微細血管清晰可見;普魯士藍染色后伊紅復染,腫瘤細胞染為紅色,沿腫瘤微細血管彌漫性分布的藍染顆粒更加清晰。證實SPIO-PLA-CREKA靶向對比劑在活體內可以與腫瘤間質特異性結合,其結合部位為腫瘤組織內血管壁及血管
38、周圍間質。
結論:
1、成功合成了歸巢肽CREKA,純度達到99.65%,可滿足實驗要求;
2、成功制備了FITC-Ahx-CREKA,純度為98.13%,達到體內及體外實驗的要求;
3、FITC-Ahx-CREKA與血漿纖維蛋白凝塊、腫瘤組織體外及體內結合實驗均證明歸巢肽CREKA可特異性靶向腫瘤間質內纖維蛋白;
4、制備了聚乳酸包被的超順磁性氧化鐵納米粒SPIO-
39、PLA,所制備的SPIO-PLA納米顆粒呈球形殼核結構,大小均勻,分散性好,無聚集和重疊。在T2WI上具有負性強化效果;
5、制備的SPIO-PLA-CREKA呈球形殼核結構,大小均勻,分散性好,靜置后無分層。具有明顯縮短T2時間的作用,產生T2WI負性強化效果,可作為T2對比劑;
6、靶向性探針SPIO-PLA-CREKA能與凝結的血漿纖維蛋白特異性結合,證明標記SPIO-PLA后的CREKA仍保持原來的生
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