川西高寒森林土壤有機層c、n、p庫研究

1、<p>　　玉米秸稈和白菜廢棄物在不同貯存條件下的微生物群落分析</p><p>　　任海偉1, 2, 3 劉菲菲2 李夢玉2 李金平1, 3李志忠2** 李東4黃娟娟1, 3孫文斌2 </p><p>　　1蘭州理工大學西部能源與環(huán)境研究中心 蘭州 730050</p><p>　　2蘭州理工大學生命科學與工程學院 蘭州 730050</p

2、><p>　　3甘肅省生物質能與太陽能互補供能系統重點實驗室 蘭州 730050 </p><p>　　4中國科學院環(huán)境與應用微生物重點實驗室（成都生物研究所） 成都 610041</p><p>　　摘 要 采用Illumina Miseq高通量技術分析不同溫度和貯存方式下玉米秸桿（IO）和白菜廢棄物（IA）貯存30 d時的微生物群落。設置低溫（O）、中溫（

3、R）和高溫（H）3種溫度。每種溫度條件均設有秸桿單貯（O）、白菜單貯（A）和二者混貯（X）3個處理組。結果表明，IO原料附著細菌主要有變形菌門（Proteobacteria，65.26%）和厚壁菌門（Firmicutes，33.78%），IA主要包括Proteobacteria（80.23%）和擬桿菌門（Bacteroidetes）（18.57%）。貯存30d后在屬水平上，IO主要包括腸桿菌（Enterobacter）（47.11%）、

4、肉食桿菌（Carnobacterium）（27.71%）和泛菌（Pantoea）（10.14%）等；IA主要包括假單孢菌（Pseudomonas）（48.40%）、Pantoea（17.10%）和黃桿菌（Flavobacterium）（16.26%）等，IA中幾乎不含乳酸菌，IO中乳酸菌豐度約28.71%。IO組低、高溫單貯時主要包括Enterobacter（21.76%和35.87%）、Ca</p><p>　

5、　關鍵詞 高通量測序；玉米秸稈；白菜廢棄物；貯存條件；微生物群落結構</p><p>　　CLC Q938.1</p><p>　　Microbial Community Analysis of Maize Straw and Cabbage Waste under Different Storage Condition</p><p>　　Ren Haiwei1

6、23, Liu Feifei2, Li Mengyu2, Li Jinping13, Li ZhiZhong2**, Li Dong4, Huang Juanjuan13 & Sun Wenbin2</p><p>　　1 China Western Energy & Environment Research Center, Lanzhou University of Technology, La

7、nzhou 730050, China </p><p>　　2 School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China</p><p>　　3 Key Laboratory of Complementary Energy System of Biomas

8、s and Solar Energy, Lanzhou 730050, China</p><p>　　4 Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology & Environmental Microbiology Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu Institute of Biology

9、, Chinese Academy of Sciences, Chengdu, 610041, China</p><p>　　Abstract The microbial community of maize straw (IO) and cabbage waste (IA) under different storage temperature and storage pattern in 30 days w

10、ere analyzed by Illumina Miseq high-throughput sequencing technologies. Each temperature, such as low temperature (O), medium temperature (R) and high temperature (H) condition were set up with three groups of sole-stora

11、ge of maize straw (O), sole-storage of cabbage waste (A) and mixed storage of IO and IA (X). The results showed that the dominant bacter</p><p>　　Keywords Illumina Miseq; maize straw; cabbage waste; storage

12、 conditions; microbial community.</p><p>　　隨著我國糧食和蔬菜產量的提高，作物秸稈和尾菜等農業(yè)廢棄物資源量逐年增加，這些廢棄物的季節(jié)性“爆炸”產出給生態(tài)環(huán)境帶來了嚴重危害，迫切需要對其進行資源化利用。利用青貯原理將干秸稈與尾菜混合貯存能調制獲得高品質的秸稈動物飼料和生物能源原料，從而實現秸稈和尾菜的資源化處理利用[1-2]。但另一方面，由于一年四季均有蔬菜種植，需要根據

13、季節(jié)氣候不同來選擇適宜的尾菜和秸稈處理方式。因此，在不同季節(jié)溫度條件下開展干秸稈和尾菜的貯存過程研究顯得尤為重要，既能解決農業(yè)廢棄物資源化利用過程中的原料供應問題，又能無害化消除尾菜污染，一舉多得。</p><p>　　青貯是由多種微生物菌群（乳酸菌等有益菌和霉菌、梭菌等有害菌）共同作用，并依賴于外部因素進行自我調控的復雜生化過程。在密閉厭氧環(huán)境中乳酸菌等有益微生物生長繁殖并逐漸占據優(yōu)勢，使霉菌等有害微生物的生長

14、受到抑制，實現原料的保質貯存[3]。貯存溫度及體系中乳酸菌種類、數量和活性是影響混貯品質優(yōu)劣的重要因素，只有加快乳酸菌發(fā)酵，使混貯體系pH迅速降低，才能有效抑制有害菌生長繁殖[4]。乳酸菌的生長溫度范圍一般為5 ℃~55 ℃，最適生長溫度為30 ℃~40 ℃，溫度過高或過低都會影響其生長和發(fā)酵品質[5-6]。劉秦華等[7]認為高溫環(huán)境會同時抑制乳酸菌、好氧細菌和酵母菌繁殖，促進乙酸發(fā)酵，同時由于多數梭菌屬嗜中溫細菌，30 ℃時會大量繁殖

15、，從而影響發(fā)酵品質[8]。低溫貯存（5 ℃~15 ℃）時則乳酸菌發(fā)酵和pH值下降均比較緩慢，需要較長時間才能抑制有害微生物的生長繁殖。Zhang等[9]發(fā)現牧草飼料的貯存品質隨溫度（10 ℃~40 ℃）升高而降低。溫度對貯存品質的影響本質上是微生物菌群對溫度變化的差異化響應，探明秸稈和尾菜在不同季節(jié)條件下貯存過程中的微生物菌群變化很有必要，但尚未見相關文獻報道。</p><p>　　目前，微生態(tài)環(huán)境中微生物菌群多

16、樣性的研究主要包括平板純培養(yǎng)法、變性梯度凝膠電泳（DGGE）和16s rRNA基因末端限制性片段分析技術（T-RFLP）等分子生物學方法[10-11]。傳統的檢測方法不能反映出樣品中所有菌群的信息，因而只能定性的對微生物群體進行分析[12]。高通量和宏基因組測序等新技術為快速尋找適宜人工培養(yǎng)條件、規(guī)避傳統方法的長周期弊端提供了可能[13]。近年來，高通量測序研究微生物多樣性愈發(fā)受到人們關注，其中Illumina Miseq平臺已被廣泛用

17、于厭氧發(fā)酵[14] 和腸道[15]等微生物菌群分析，不僅能實現一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，還能從分類學的各個水平上對菌群的構成和豐度進行測定，并且可以鑒定到很多低豐度的菌群。但有關Illumina Miseq高通量測序用于青貯發(fā)酵過程的文獻報道還很少。Li等[16]通過Miseq高通量測序發(fā)現加入微藻會影響五節(jié)芒青貯過程中的微生物菌群，五節(jié)芒單獨青貯3 d時的優(yōu)勢菌群為腸球菌屬（Enterococcus），3 d后

18、乳桿菌屬（Lactobacillus）變?yōu)閮?yōu)勢菌，加入微藻混貯后Lactobacillus</p><p>　　為了研究不同季節(jié)溫度和貯存方式對秸稈和尾菜貯存過程中微生物菌群影響，本文參照蘭州地區(qū)不同季節(jié)溫度和氣候條件設置了低溫（-9 ℃～3 ℃，代表冬季）、17 ℃中溫（代表初春深秋季）和32 ℃高溫（代表夏秋高溫季節(jié)）3種條件，研究了不同溫度下玉米秸稈單獨貯存、白菜單獨貯存及二者混合貯存30 d時的細菌群落構

19、成，探討了溫度和貯存方式對秸稈和白菜貯存過程中微生物菌群變化的影響規(guī)律。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　實驗材料</b></p><p>　　摘穗后的干玉米秸稈（IO）取自蘭州市榆中縣，采集時間為2015年11月，收集后粉碎至1~2 cm備用；白菜廢棄物（IA）收集自學校

20、家屬區(qū)菜市場，切成2 cm×2 cm備用。試驗時間為當年11月24日～12月23日，該時間段內蘭州市區(qū)的日均最低溫度-9 ℃，最高溫度3 ℃。干玉米秸稈和白菜廢棄物的理化指標如表1所示。</p><p>　　表1 干玉米秸稈和白菜廢棄物的理化指標（%）</p><p>　　Table 1 Physicochemical indexes of dry maize straw a

21、nd cabbage waste (%)</p><p>　　IA：原料白菜廢棄物；IO：原料干玉米秸稈。DM：干物質；WSC：可溶性碳水化合物；CP：粗蛋白；NDF：中性洗滌纖維；ADF：酸性洗滌纖維；ADL：中性洗滌木質素。</p><p>　　IA: cabbage waste; IO: dried maize straw. DM: dry matter; WSC: water-so

22、luble carbohydrates; CP: crude protein; NDF: neutral detergent fiber; ADF: acid detergent fiber; ADL: acid detergent lignin.</p><p>　　1.2 貯存試驗設計</p><p>　　模擬蘭州地區(qū)氣候條件，設置了3種溫度梯度，分別為低溫（-9 ℃～3 ℃，冬季，代

23、號O）、中溫17 ℃（初春深秋季節(jié)平均溫度，代號R）和高溫32 ℃（夏秋高溫季節(jié)平均溫度，代號H）。每種溫度條件均設有白菜單貯組（代號A）、秸稈單貯組（代號O）和秸稈/白菜混貯組（代號X）3個對照組。9個處理組分別命名為OA（低溫白菜單貯組）、OO（低溫干秸稈單貯組）、OX（低溫混貯組）、RA（中溫白菜單貯組）、RO（中溫干秸稈單貯組）、RX（中溫混貯組）、HA（高溫白菜單貯組）、HO（高溫干秸稈單貯組）和HX（高溫混貯組）。其中，秸稈

24、單貯組為3 kg IO，白菜單貯組為3 kg IA，混貯組為0.79 kg IO和2.21 kg IA的混合物，混貯組中初始水分含量為73.01%。每個處理組均設置三個平行，軟體發(fā)酵裝置中厭氧密閉貯存30 d。</p><p>　　1.3 貯存料的DNA提取</p><p>　　無菌環(huán)境下準確稱取60 g貯存樣品，分成三份后分別加入200 mL無菌生理鹽水，37 ℃恒溫振蕩2 h后提取細

25、菌基因組DNA，方法參照Water DNA Isolation Kit說明書。</p><p>　　1.4 PCR 擴增</p><p>　　以上述微生物基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增區(qū)域為16S rDNA V4-V5區(qū)，選擇的引物為帶有barcode的515F(5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3)和907R(5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3)。采用PCR儀

26、（ABI GeneAmp® 9700型）對細菌16s rRNA基因進行PCR擴增。每個樣本3個重復，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產物[18]。</p><p><b>　　1.5 熒光定量</b></p><p>　　參照1.4中瓊脂糖凝膠電泳初步定量結果，將

27、PCR產物用QuantiFluor? -ST藍色熒光定量系統（Promega公司）進行檢測定量[18]。</p><p>　　1.6 Illumina 文庫構建 </p><p>　　Illumina文庫構建：連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴增進行文庫模板的富集，利用氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段[19]。</p><p>

28、;　　1.7 Illumina 平臺測序</p><p>　　DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上；另一端隨機與附近另外一個引物互補，也被固定，形成“橋”；PCR擴增，產生DNA簇；DNA擴增子線性化成為單鏈；加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個堿基；用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3&

29、#39;端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸；統計每輪收集到的熒光信號結果，獲知模板DNA片段的序列[19]。</p><p>　　1.8 生物信息學分析</p><p>　　使用CLUSTALW軟件分析，序列相似性大于97%時定義為相同的操作分類單元（operational taxonomic units, OTUs）。測序得到的原始數據存在一定比例的干擾數據，為使信息分析結果更準確可靠，首先

30、對原始數據進行過濾處理，得到優(yōu)化序列[17]。然后在去除嵌合體序列后進行OTU聚類分析，對OTU的代表序列做分類學分析?；贠TU聚類分析結果，可對OTU進行豐度、Alpha多樣性及物種在各分類水平上的群落結果統計分析，得到細菌群落組成；基于分類學信息，在各個分類學水平上進行群落結構的統計分析；基于系統發(fā)育進行unifrac等分析[20]。</p><p><b>　　2 結果與分析</b>

31、;</p><p>　　2.1 OTU分布統計</p><p>　　OTU是在系統發(fā)生學或群體遺傳學研究中，為了便于進行分析，人為給某一分類單元（品系、屬、種、分組等）設置的統一標志。通過歸類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個小組就是一個OTU[21]。利用Usearch軟件對優(yōu)化序列提取非重復序列，去除沒有重復的單序列，按照97%相似性對非重復序列進行OTU聚類，在聚類過

32、程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列[20]。 </p><p>　　由表2可知，RX1組和HX1組的OTU數量明顯高于相同溫度時的秸稈單貯組（RO1和HO1）和白菜單貯組（RA1和HA1）中OTU數量，且高于IO和IA本底OTU數量；相反，OX1的OTU數量明顯低于OA1和OO1組OTU數量，也遠低于原料本底OTU數量。另一方面，中、高溫條件IO和IA混合貯存時的OTU數量較高，IA低、中溫單獨貯存時的OTU數

33、量較高，IO低溫單獨貯存時的OTU數量高于RO1和HO1；而且低溫和高溫時IO單貯組OTU數量均高于IA單貯組OTU數量?？梢?，原料種類、貯存溫度和方式對細菌群落多樣性有很大影響。</p><p>　　表2 原料和不同處理組的OTU數</p><p>　　Table 2 OTU in the raw material and different treatment groups<

34、/p><p>　　OA1：低溫單貯IA；OO1：低溫單貯IO；OX1：低溫IO和IA混貯；RA1：中溫單貯IA；RO1：中溫單貯IO；RX1：中溫IO和IA混貯；HA1：高溫單貯IA；HO1：高溫單貯IO；HX1：高溫IO和IA混貯。下同。</p><p>　　OA1: IA stored at low temperature; OO1: IO stored at low temperatur

35、e; OX1: IO stored with IA at low temperature; RA1: IA stored at medium temperature; RO1: IO stored at medium temperature; RX1: IO stored with IA at medium temperature; HA1: IA stored at high temperature; HO1: IO stored a

36、t high temperature; HX1: IO stored with cabbage waste at high temperature. The same below. </p><p>　　2.2 Venn圖</p><p>　　根據處理組貯存前后OTU的相似性和差異性得到圖1所示的維恩圖，如圖所示，IA、OA1、RA1和HA1中共有的OTU為35個，IO、OO1、RO1

37、和HO1中共有的OTU數為59個，OX1、RX1和HX1中共有的OTU數位68個。不同溫度下貯存樣品的物種多樣性存在明顯差異，且3種溫度時的混貯組樣品OTU共有數量最多，它們之間的微生物群落相似性最高。</p><p>　　圖1 原料和不同處理組的OTU維恩圖</p><p>　　Fig. 1 Venn diagram of operational taxnonmic unit in

38、the raw material and different treatment groups </p><p>　　2.3 物種豐度分析</p><p>　　2.3.1 稀釋性曲線</p><p>　　從樣本中隨機抽取一定數量的個體，統計這些個體所代表的物種數目，并以個體數與物種數來構建曲線，這種曲線叫做稀釋性曲線。它可以用來比較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度

39、，也可以用來說明樣本的測序數據量是否合理[22]。如圖2，橫坐標代表樣本量，縱坐標代表抽樣后OTU的數目。隨著樣本量的加大，曲線越來越平緩，說明測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的OTU[23]。在相同序列數時，RX1和OX1的OTU數量較高，說明中、低溫混貯時的微生物群落多樣性較高。</p><p>　　圖2 原料和不同處理組的稀釋性曲線</p><p>　　Fig. 2 R

40、arefaction in the raw material and different treatment groups</p><p>　　2.3.2 Rank-Abundance曲線</p><p>　　樣品的物種豐度和物種均勻度可以用Rank-Abundance曲線可以用來解釋。物種的豐度由曲線的寬度來反映，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的形狀反映了樣本中物種的均度，

41、曲線越平緩，物種分布越均勻[24]。由圖3可知，RX1在橫軸上范圍最廣，其次是OX1，說明RX1和OX1的物種豐度較高。隨著OTU等級數的增加，所有曲線均變得較為平緩，說明各組中的物種分布比較均勻。</p><p>　　圖3 原料和不同處理組的Rank-Abundance曲線</p><p>　　Fig. 3 Rank-Abundance curve in the raw materi

42、al and different treatment groups</p><p>　　2.4 Alpha多樣性分析</p><p>　　Alpha多樣性分析是指對一個特定區(qū)域或生態(tài)系統內的多樣性分析，其反應了兩個綜合指標，即群落豐富度指數，包括Chao指數和Ace指數；群落多樣性指數包括Shannon指數和Simpson指數[21]。其中Chao指數或Ace指數越大，意味著群落豐富度越高

43、；Shannon指數越大，意味著群落多樣性越高[25]；Simpson指數越大，意味著群落多樣性越低。由表3可以看出，混貯組的ace指數和chao指數均高于IO單貯組，說明其群落豐富度較高，且RX1組中指數最大，群落豐富度最高。RX1和OX1的shannon指數也較大，表明它們的群落多樣性也較高。所有處理組的coverage數值都較大，說明本次測序的結果可以代表樣本中微生物群落的真實情況。</p><p>　　表

44、3 原料和不同處理組的Alpha多樣性指數</p><p>　　Table 3 Alpha diversity in the raw material and different treatment groups </p><p>　　Chao：是用chao算法估計樣品中所含OTU數目的指數。Ace：用來估計群落中OTU數目的指數。Simpson：用來估算樣品中微生物多樣性指數之一。

45、Shannon：用來估算樣品中微生物多樣性指數之一。Coverage：反映本次測序結果是否代表了樣本中微生物的真實情況。</p><p>　　Chao: It is used to estimate the number of OTUs contained in the sample using the Chao algorithm. Ace: It is used to estimate the number

46、of OTUs in a community. Simpson: It is used to estimate one of the microbial diversity indices in the sample. Shannon: It is used to estimate one of the microbial diversity indices in the sample. Coverage: It reflects wh

47、ether the results of this sequencing represent the real situation of microbes in the sample.</p><p>　　2.5 溫度和貯存方式對微生物群落結構的影響</p><p>　　2.5.1各處理組的門分類群落組成</p><p>　　由圖4可知，原料IA中的優(yōu)勢菌門為變形菌

48、門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），豐度分別為80.23% 和18.57%；低溫貯存后優(yōu)勢菌門為Proteobacteria和厚壁菌門（Firmicutes），與原料相比Proteobacteria豐度降低而Firmicutes豐度上升；中溫貯存后Firmicutes的豐度上升為87.27%，Proteobacteria的豐度下降為12.07%；高溫時Firmicutes的菌群豐度為82.39%。

49、原料IO中Proteobacteria門豐度最高達65.26%，而Firmicutes豐度較低，僅有33.78%，低溫單貯后Firmicutes豐度增加至44.23%，中、高溫貯存時Firmicutes豐度降至8.14%和29.38%。原料IA和IO高溫混合貯存30 d時Proteobacteria豐度最高（85.16%），Firmicutes豐度最低（13.74%）；低、中溫混貯時Firmicutes為優(yōu)勢菌門，還有少量Proteob

50、acteria、放線菌門（Actinobacteria）和Bacteroidet</p><p>　　圖4 原料和不同處理組的門水平分類細菌群落</p><p>　　Fig. 4 The community composition in the raw material and different treatment groups at the level of Phylum</

51、p><p>　　2.5.2各處理組的屬水平群落組成</p><p>　　各處理組中屬水平群落組成如圖5所示，由圖可知，原料IO附著的細菌群落包括腸桿菌屬（Enterobacter）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）、泛菌屬（Pantoea）和假單孢菌屬（Pseudomonas）等，其中Enterobacter豐度最高為47.11%；原料IA附著的細菌群落包括Pseudomonas、P

52、antoea、黃桿菌屬（Flavobacterium）和Enterobacter等，其中優(yōu)勢菌群Pseudomonas豐度最高為48.40%。</p><p>　　IA低溫單獨貯存時細菌種群最為豐富，乳桿菌屬（Lactobacillus）豐度為28.43%，耶爾森氏鼠疫桿菌（Yersnia）和Enterobacter豐度次之，分別為19.50%和17.13%，還含有少量明串珠菌屬（Leuconostoc）（11.

53、02%）、Pantoea（8.62%）和乳球菌屬（Lactococcus）（5.73%）等。中、高溫單貯時乳桿菌屬（Lactobacillus）均為優(yōu)勢菌，豐度分別高達80.07%和74.63%。RA1中Enterobacter相對豐度為8.62%，明串珠菌屬（Leuconostoc）相對豐度為6.19%，Pantoea、Pseudomonas和Flavobacterium等細菌豐度均低于1%，HA1中Enterobacter、Leuc

54、onostoc和Yersnia豐度分別為11.24%、5.98%和4.37%。綜合分析，IA低溫單貯時乳酸菌屬豐度之和僅為48.93%，Enterobacter和Yersnia等腐敗菌豐度較高，低溫貯存可能導致Enterobacter等有害微生物大量繁殖，影響發(fā)酵品質[18]；中、高溫單貯時Lactobac</p><p>　　IO單獨貯存后，中溫RO1組中的Enterobacter豐度升至66.72%，Carn

55、obacterium豐度降至1.69%，Pantoea和Pseudomonas豐度變化不大；低、高溫貯存時Enterobacter和Carnobacterium仍為優(yōu)勢菌屬，Pseudomonas豐度也分別升至18.00%和26.99%，Pantoea豐度分別降至4.66%和3.92%?？梢姼山斩拞钨A時無論溫度高低腐敗菌均占主導優(yōu)勢。二者混貯后，高溫HX1組中Enterobacter豐度高達70.57%，Carnobacterium等乳

56、酸菌豐度僅有4.90%，Pantoea和Pseudomonas的相對豐度分別為5.43%和6.16%；低、中溫時腐敗菌Enterobacter豐度明顯下降，乳酸菌屬豐度分別高達82.21%和77.80%，其中Lactobacillus仍為優(yōu)勢菌屬，豐度分別為52.03%和53.53%，Leuconostoc的豐度分別為13.07%和5.94%?？梢?，中、低溫IO/IA混合貯存有利于乳酸菌生長繁殖進而變?yōu)閮?yōu)勢菌群，有效抑制Enteroba

57、cter等腐敗菌，而高溫環(huán)境貯存時</p><p>　　圖5 原料和不同處理組的屬水平分類細菌群落</p><p>　　Fig. 5 The community composition in the raw material and different treatment groups at the level of Genus</p><p>　　2.5.3

58、屬水平各處理組的乳酸菌多樣性</p><p>　　由圖6可知，原料IA中主要包括乳桿菌屬（Lactobacillus），肉食桿菌屬（Carrobacterium），明串珠菌屬（Leuconostoc），腸球菌屬（Enterococcus），乳球菌屬（Lactococcus）和鏈球菌屬（Streptococcaceae）等乳酸菌。IA單獨貯存后，低、中、高溫時各處理組中Lactobacillus占乳酸菌比重均較原料

59、有所提高，且中溫時比重最高為40%；Carrobacterium和Enterococcus所占比重有所減少，低溫時僅有4.35%；Lactococcus和Streptococcaceae比重也有所降低，中、高溫時僅有10%；Leuconostoc、片球菌屬（Pediococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）所占比重均有不同程度的提高。</p><p>　　原料IO主要包括Carrobacterium、Ma

60、rinilactibacillus、Enterococcus、Vagococcus、德瑟茲氏菌屬（Desemzia）和乳球菌屬（Lactococcus）。IO原料中未發(fā)現乳桿菌屬（Lactobacillus），但貯存后Lactobacillus比重顯著增加，低溫時比重約占41.68%，中、高溫時Lactobacillus比重分別為37.50%和30.76%；另一方面，原料IO中Carrobacterium比重較高（37.51%），但貯存

61、后比重有所下降，低、中、高溫時分別下降為25.01%、12.50%和23.07%； IO中Enterococcus和Vagococcus比重均為12.50%且不含有Leuconostoc，低、高溫時Enterococcus和Vagococcus比重分別降至8.34%和7.69%，Leuconostoc比重分別增至8.34%和15.38%；并且三種溫度下貯存后均未發(fā)現Lactococcus。</p><p>　　混

62、貯組中，低溫時Lactobacillus所占比重最大為30%，高溫時Carrobacterium和Lactobacillus所占比重最大，均為25.01%，Desemzia、Marinilactibacillus、Enterococcus和Lactococcus的比重均為12.5%。中溫時Lactobacillus比重最大為25%，Leuconostoc比重為16.67%，Carrobacterium比重為12.50%，Weissell

63、a和Leuconostoc比重為8.33%，其余乳酸菌數均在5%以下。 </p><p>　　總之，原料IA中Lactobacillus比重較高，且在3種溫度貯存后不同處理組種Lactobacillus比重均有所增加。原料IO中不含Lactobacillus，但在3種溫度貯存后Lactobacillus所占比重均在30%以上?；熨A組Lactobacillus比重均在25%以上。原料IA、IO及所有處理組均含有C

64、arrobacterium和Enterococcus。IO及其單貯組中不含Pediococcus、Weissella和Streptococcaceae，混貯低、中溫組Pediococcus比重分別為5%和4.17%，Weissella比重分別為10%和8.33%；中溫組Streptococcaceae比重為4.17%。</p><p>　　圖6 原料和不同處理組的乳酸菌多樣性分析</p><

65、p>　　Fig. 6 Composition of Lactic Acid Bacteria in the raw material and different treatment groups at the level of Genus</p><p>　　2.5.4 基于PCA的群落結構分析</p><p>　　為進一步分析樣品間的差別，對每一個樣品的OTU信息構建了未加權的U

66、nfirac歐氏距離矩陣（unweighted Unifrac distanc matrix），基于這一矩陣進行了主坐標分析，即PCA分析。它是基于每個樣品中所含有的全部OTU完成的，以百分數的形式體現主成分的主要影響程度[26]。樣本間的組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。通過在PCA圖中的樣本間的分散和聚集分布反映樣本間細菌群落的相似程度[27]。</p><p>　　如圖7所示，每個點代表了一個處理組，

67、主成分分析共提取了三個主成分，其中第一主成分PC1和第二主成分PC2貢獻率分別為48.8%和21.24%，累計貢獻率達到了70.04%，可以解釋變量的絕大部分信息。OO1組與HO1組距離較近，RA1組與HA1組距離較近，RX1組與OX1組的距離較近，說明它們兩兩之間的相似性較高。并且IA組與IO組和其余樣品的距離都比較遠，說明貯存前后樣品的微生物群落有較明顯的變化。由此可見，貯存原料的種類和溫度是影響微生物群落組成的主要影響因素。<

68、;/p><p>　　圖7 原料和不同處理組的PCR分析</p><p>　　Fig.7 Principal Component Analysis in the raw material and different treatment groups</p><p>　　2.6 基于Unifrac的聚類的比較分析</p><p>　　2.6.1

69、多樣本相似度樹狀圖</p><p>　　利用樹枝結構描述和比較多個樣本間的相似性和差異關系。首先使用描述群落組成關系和結構的算法計算樣本間的距離，即根據beta多樣性距離矩陣進行層次聚類（Hierarchical cluatering）分析，使用非加權組平均法UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean）算法構建樹狀結構，得到樹狀關系形式用于可視化

70、分析[28]。</p><p>　　通過braycurtis算法使用Qiime計算beta多樣性距離矩陣，算法如下：</p><p>　　SA,i = 表示A樣本中第i個OTU所含的序列數；</p><p>　　SB,i = 表示B樣本中第i個OTU所含的序列數[27]。</p><p>　　由圖8可以看出，11個處理組可以分為兩大

71、類，其中IO、RO1、HO1、OO1與HX1聚為一大類，且IO、OO1與HO1在同一分支上，HX1與RO1在同一分支上，說明它們的細菌群落組成相似性較高；IA單獨為一個分支，說明它與其余試驗組的群落組成差異性較大；RX1、OX1、RA1、OA1與HA1均在第二分支上，說明其趨同性較高，；OX1與RX1在同一分支，它們的群落組成相似性最高。這與上述PCA分析得到的結果是一致的。</p><p>　　圖8 原料和不

72、同處理組的多樣本相似度樹狀圖</p><p>　　Fig. 8 Multi-sample similarity tree in the raw material and different treatment groups</p><p>　　2.6.2 Heatmap熱圖分析</p><p>　　將數據進行物種或樣本間豐度相似性聚類，將聚類后數據表示在heatm

73、ap圖上，可將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度反映多個樣本在各分類水平上群落組成的相似性和差異性[29]。如圖9所示，RA1與HA1，RX1與OX1，HO1與OO1的相似性較高，而IA與RA1、HA1、OA1以及IO與RO1、HO1、OO1的差異性較大，說明IA和IO經不同溫度或方式進行貯存后微生物群落組成發(fā)生了很大變化。</p><p>　　圖9 原料和不同處理組的多樣性熱圖</p&

74、gt;<p>　　Fig. 9 Diversity heatmap in the raw material and different treatment groups </p><p><b>　　3 討論與結論</b></p><p>　　生物質原料貯存過程中的細菌群落變化一定程度上能反映貯存品質變化的本質原因，尤其乳酸菌是貯存過程中發(fā)揮主要作用

75、的菌群，其數量及種類變化與貯存品質之間有著密切聯系。本文基于Miseq Illumina高通量測序平臺分析了溫度和貯存方式對IO和IA貯存過程中微生物菌群的影響。OTU聚類顯示，不同溫度下混貯組中的OTU數量高于單貯組，且室溫混貯RX1組的OTU最大，但高溫時OTU數量有所下降，說明溫度過高會降低混貯存過程中的微生物多樣性。因為溫度升高使乳酸菌等有益菌活性減弱，且易導致丁酸發(fā)酵，使處理組中的微生物群落豐富度降低[30]。物種豐度分析和A

76、lpha多樣性分析表明，混貯組（RX1、HX1,、OX1）的群落豐富度均比單貯組高，且RX1的微生物群落最為豐富。</p><p>　　細菌群落分析表明，IA中優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），不同溫度下IA單獨貯存后Proteobacteria豐度均有降低，而厚壁菌門（Firmicutes）的豐度均有升高，且中、高溫貯存時Firmicutes豐度分別升高

77、至87.27%和82.39%。原料IO中優(yōu)勢菌門為Proteobacteria和Firmicutes，低溫貯存后Firmicutes豐度下降，中、高溫貯存時Firmicutes豐度上升。二者高溫混貯時的Proteobacteria的豐度最高（85.16%），而Firmicutes的豐度最低（13.74%），中、低溫混貯時Firmicutes的豐度最高分別為82.74%和78.64%。Firmicutes是革蘭氏陽性菌，主要為產芽孢、非產

78、芽孢和支原體群體，能降解多種大分子化合物，可能會引起貯存料中的營養(yǎng)物質含量變化。Proteobacteria包括大腸桿菌、沙門氏菌等病原菌，它們會與乳酸菌競爭性利用營養(yǎng)物質并產生生物胺，從而影響青貯發(fā)酵品質。</p><p>　　原料IO附著的細菌群落包括腸桿菌屬（Enterobacter）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）、泛菌屬（Pantoea）和假單孢菌屬（Pseudomonas）等，其中Ente

79、robacter豐度最高為47.11%；原料IA附著的細菌群落包括Pseudomonas、Pantoea、黃桿菌屬（Flavobacterium）和Enterobacter等，其中優(yōu)勢菌群Pseudomonas豐度最高為48.40%。二者混合貯存能為乳酸菌生長繁殖提供必要條件，原料所附著乳酸菌能迅速繁殖產生乳酸降低環(huán)境pH，抑制腐敗菌生長[31]。低溫IA單貯時乳酸菌屬豐度之和僅為48.93%，Enterobacter和Yersnia等

80、腐敗菌豐度較高，低溫貯存可能導致Enterobacter等有害微生物大量繁殖，影響發(fā)酵品質。中、高溫單貯時Lactobacillus為優(yōu)勢菌，乳酸菌屬的豐度之和分別高達87.14%和82.29%，腐敗菌被有效抑制，對白菜青貯發(fā)酵有積極作用。干秸稈單貯時無論溫度高低，腐敗菌均占主導優(yōu)勢，進而影響貯存品質。二者混貯后，高溫HX1組中Enterobacter豐度高達70.57%</p><p>　　從乳酸菌多樣性角度來

81、看，原料IA中Lactobacillus比重較高，且在3種溫度貯存后不同處理組中Lactobacillus比重均有所增加。原料IO中不含Lactobacillus，但在3種溫度貯存后Lactobacillus所占比重均在30%以上?；熨A組Lactobacillus比重均在25%以上。劉晶晶等[34]發(fā)現青貯發(fā)酵時Lactobacillus為優(yōu)勢菌群，這與本研究結果一致。原料經不同溫度貯存后Carrobacterium豐度均有所下降，中、

82、低溫時Lactobacillus比重均有上升，且室溫時比重高達40%，高溫時Lactobacillus豐度有所下降。IO主要包括Carrobacterium、Desemzia、Marinilactibacillus、Enterococcus、漫游球菌屬（Vagococcus）和Lactococcus。低溫單貯后新出現Lactobacillus，比重高達41.68%。IA/IO低溫混貯時Lactobacillus比重最高（30.00%），

83、高溫時Carrobacterium比重最高為25.01%，中、低溫時分別為12.50%和15%。IO</p><p>　　總之，白菜單獨貯存宜選擇中溫或高溫條件，低溫貯存時乳酸菌豐度較低，易發(fā)生腐敗變質；干秸稈單一貯存時無論溫度高低，均含有大量的腐敗細菌，故不宜直接單貯；秸稈/白菜適宜在低、中溫條件混合貯存，該溫度區(qū)間時乳酸菌占主導優(yōu)勢。貯存過程中微生物菌群的變化會引起感官品質、化學組分和發(fā)酵品質等方面的變化，因

84、此還需要進一步深入探索不同原料的適宜貯存方式和溫度條件，并對貯存料的微生物菌群進行正向調控，從而為秸稈、白菜廢棄物的飼料化或能源化利用奠定理論基礎。</p><p>　　參考文獻 [References]</p><p>　　楊道蘭, 汪建旭, 馮煒弘. 花椰菜莖葉與玉米秸稈的混貯品質[J]. 草業(yè)科學, 2014, 31 (3):551-557 [Yang DL, Wang JX, Fe

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