諾卡氏菌細胞壁肽聚糖粗提物對烏鱧免疫活性的影響【開題報告+文獻綜述+畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　水產養(yǎng)殖</b></p><p>　　諾卡氏菌細胞壁肽聚糖粗提物對烏鱧免疫活性的影響</p><p>　　一、選題的背景與意義 </p>

2、;<p>　　烏鱧（Ophicephalus argus），亦稱黑魚，屬鱸形目，攀鱸亞目，鱧科，鱧屬，體呈烏黑色，細長，前部圓筒狀，后部側扁，由背至腹顏色逐漸變淺，圓鱗。烏鱧分布極廣，除西部高原地區(qū)外，從黑龍江至海南的河川、湖泊、水庫、池塘等各種類型的水體皆產此魚，國外產于朝鮮西、南部。烏鱧肉富含蛋白質、脂肪、18種氨基酸等，還含有人體必需的鈣、磷、鐵及多種維生素，營養(yǎng)豐富、肉味甘性溫且骨刺少，有補脾、利水的藥用功能，深受

3、群眾的歡迎。烏鱧是一種適應性強、對不良水溫、水質及缺氧條件有較強耐受力的魚類，在江河湖塘等自然環(huán)境中很少發(fā)病。但隨著烏鱧人工高密度養(yǎng)殖的發(fā)展，烏鱧各種疾病頻頻發(fā)生，特別是水霉病、腐皮病、腹水病、爛鰓病危害嚴重，諾卡氏菌病也在近幾年流行起來，造成了很嚴重的經濟損失。</p><p>　　諾卡氏菌（Nocardia）為革蘭氏陽性菌，好氧，分類上屬細菌域，厚壁菌門，放線菌綱，放線菌目，諾卡氏菌科。菌體呈長或短桿狀, 或

4、細長分枝狀，常斷裂成桿狀至球狀體，基絲發(fā)達，呈分枝狀，氣絲較少。魚類諾卡氏菌病于1963年在全球首次報告，確認于阿根廷熱帶養(yǎng)殖的虹彩脂魚（Hyphessobrycon innesi）（杜佳根 2007）。隨后此病又陸續(xù)發(fā)生在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、黃尾鰤（Seriola lalandi）、烏鱧、大西洋牡蠣（Crassostrea gigas）、大口鱸（Micropterus salmoides）和海鱸（Lateo

5、labrax japonicus）等水產養(yǎng)殖動物中，曾影響日本、美國、澳大利亞、加拿大等地的水產養(yǎng)殖業(yè)，造成很大經濟損失（袁思平 2006）。該病曾是日本水產養(yǎng)殖中最主要的水產動物疾病之一, 也是大西洋牡蠣養(yǎng)殖的主要疾病。而該病近年來對我國臺灣水產養(yǎng)殖業(yè)也產生了較大影響，先后在烏鱧、大口鱸和海鱸等養(yǎng)殖魚類中發(fā)生此病。我國大陸是2006年首次在養(yǎng)殖大黃魚中發(fā)現諾卡氏菌病（王國良 2006）。</p><p>　　肽

6、聚糖( peptidoglycan) 又稱粘肽、胞壁質或粘質復合物，由雙糖單位，四肽尾還有肽橋聚合而成，是N-乙酰葡萄糖胺（NAG）和N-乙酰胞壁酸（NAMA）交替連接的雜多糖與不同組成的肽交叉連接形成的多層網狀大分子結構。其是一種多糖與氨基酸相連的多糖復合物，由于此復合物中氨基酸鏈不像蛋白質中的那樣長，故稱肽聚糖。肽聚糖是許多細菌細胞壁的主要成分，不同的肽聚糖中出現的氨基酸數是有限的，亞肽單位及間肽橋上氨基酸的組成及排列上的不同，決定

7、了肽聚糖種類的多樣性(和致中　1992)。近年來的大量的研究結果表明，肽聚糖具有包括佐劑活性在內的多種生物活性。肽聚糖能對免疫系統(tǒng)產生不同的免疫調節(jié)作用，能夠增強機體免疫能力，是一種免疫系統(tǒng)的免疫增強劑。肽聚糖能夠刺激B、T 淋巴細胞，增強體液免疫和細胞免疫，激活單核細胞及多核白細胞的吞噬活性，活化補體(聞玉梅等　1992)，其分子中的多糖成分還具有抗腫瘤，抗感染能力（Takashi 1994）。在水產養(yǎng)殖中投喂肽聚糖后發(fā)現，其能顯著提

8、高水產動物如五條鰤（Ttami 1996）、斑節(jié)對蝦（Sitdhi Boonyaratpalin 1995）、日本對</p><p>　　二、研究的基本內容與擬解決的主要問題：</p><p><b>　　研究基本內容：</b></p><p>　　1. 諾卡氏菌細胞壁肽聚糖的分離提取。</p><p>　　2. 通過

9、腹腔注射的方式，對烏鱧注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖粗提物，研究其對烏鱧免疫活性指標的影響。</p><p><b>　　擬解決的主要問題：</b></p><p>　　1.諾卡氏菌細胞壁肽聚糖的提取方法。</p><p>　　2. 烏鱧免疫活性指標的篩選及測定方法的建立。</p><p>　　三、研究的方法與技術路線：<

10、;/p><p><b>　　研究的方法:</b></p><p><b>　　1.試驗用魚：烏鱧</b></p><p>　　2.試驗用菌：鰤魚諾卡氏菌(Nacardia seriolea)</p><p>　　3.試劑與藥品：三氯乙酸（TCA）、胰蛋白酶磷酸緩沖液(3 mg/ mL 胰蛋白酶、0.1

11、mol/ L 磷酸緩沖液、pH 8.0)、肝素鈉、生理鹽水、白細胞稀釋液（冰醋酸1. 5 ml、1%龍膽紫1 ml、蒸餾水97.5ml）、溶壁微球菌( Microcrococcus lysodeikticus)、紅細胞稀釋液（NaCl 0. 5g、硫酸鈉2. 5g、氯化汞0. 25g、</p><p>　　蒸餾水加至100 ml）、溶壁微球菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（牛肉浸膏1. 5g、蛋白胨2. 5g、NaCl 4. 0

12、g、瓊脂7. 5g、蒸餾水500mL、pH = 7. 4）、丙酮、乙醚等。</p><p>　　4.主要器材：玻璃缸、注射器、生化自動分析儀、離心機、顯微鏡等</p><p><b>　　5. 實驗方法：</b></p><p>　　5.1諾卡氏菌細胞壁肽聚糖粗提物的制備：</p><p>　　參考宋曉玲等（2005）改

13、進的Park法。取離心洗滌得到的諾卡氏菌濕菌20g，懸浮于200mL 10 %三氯乙酸(TCA)溶液中，沸水浴20min以裂解菌體；冷卻后，1.2萬r/ min 離心15 min，收集不含磷壁酸的細胞壁沉淀，蒸餾水洗滌沉淀3次；沉淀溶于胰蛋白酶磷酸緩沖液(3 mg/ mL 胰蛋白酶；0.1 mol/ L 磷酸緩沖液；pH 8.0)中，37 ℃水浴振蕩3h，以3000r/min轉速離心5 min，棄去未溶解的胰蛋白酶沉淀。上清液1.2萬

14、r/min離心15 min，沉淀用蒸餾水洗2次，加入乙醚(除脂類物質)1.2萬r/min離心15min，70 ℃干燥脫水后，即得淡褐色膠質肽聚糖提取物。最后，將制備的肽聚糖干燥物用生理鹽水配成1%濃度的溶液，高溫高壓滅菌20min后備用。</p><p>　　5.2腹腔注射與血樣采集：</p><p>　　試驗分對照組和試驗組，每組50尾魚。試驗組腹腔注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖粗提物每尾0.

15、3mL，對照組以同量無菌生理鹽水注射。注射后分別于24h 、48h 、72h 、96h 、120h 、144h 、168h 時尾靜脈取血液樣本，每時間點每組取5 尾魚，實驗重復2次。</p><p>　　用肝素鈉作為血液抗凝劑，臀鰭尾端基部無鱗處穿刺抽血, 取得全血，測定紅細胞數量、脆性及白細胞數量等生理指標，當天完成測定；用5mL針筒尾靜脈取血（不抗凝），全血制備血清，4 ℃靜置過夜，吸出血清后3 000r/

16、min 離心，用于溶菌酶等生化指標的測定。</p><p>　　5.3溶壁微球菌粉末的制備：將溶壁微球菌涂布于營養(yǎng)瓊脂上，28 ℃下培養(yǎng)過夜，用無菌重蒸水將溶壁微球菌菌落從營養(yǎng)瓊脂平板上洗下來，2 500r/ min 離心15min ，去上清，用4mL 丙酮洗滌后，2 500r/ min 離心3min，去上清，重復2 次，再用4mL 乙醚洗滌，2 500r/ min 離心3min，重復1 次，把溶壁微球菌從離心管

17、中取出，放到研缽中，于28 ℃下干燥3h，把結塊的細菌磨成粉末分裝到小離心管中,4 ℃下保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　5.4免疫活性指標的測定</p><p>　　5.4.1紅細胞計數（RBC）：用紅細胞稀釋液將血液稀釋200倍，用Neubarner計數板在顯微鏡下計數。</p><p>　　5.4.2白細胞計數（WBC）：用Türk稀釋液將血液稀釋20

18、0倍，用Neubarner計數板在顯微鏡下計數。</p><p>　　5.4.3 紅細胞脆性( EOB): 將血液滴入濃度為0.20%～0.48% (梯度為0.02% )的NaCl溶液，以完全溶血的NaCl濃度作為紅細胞最大抵抗值。</p><p>　　5.4.4 溶菌酶活力測定：主要根據簡紀常的方法進行。用0. 067mol/ L PBS (pH 6. 4) 將溶壁微球菌配成0. 2mg

19、/ mL 的菌懸液，每個樣品取3mL 菌懸液，吸取40μL 血清加入到3mL 菌懸液中，混勻后立刻在540nm 下測定A0 值。然后在28 ℃水浴中溫浴30min，取出后置于4 ℃冰浴中以終止反應，再測定A值，按公式計算溶菌酶的活力：U = (A0 - A) / A。</p><p>　　5.4.5 血清酶類的測定：堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脫氫酶(LDH)等在生化自動分析儀上完成，具體方法

20、根據說明書進行。</p><p>　　5.數據處理與分析：：</p><p>　　利用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對試驗結果進行分析。每個樣品進行3次平行測試取平均值，所有數據分析均采用單因素方差分析(one-factor analysis of variance)和Duncan檢驗法。</p><p><b>　　技術路線: </b></

21、p><p>　　四、研究的總體安排與進度：</p><p>　　2010年1月—2010年4月：</p><p>　　1.實驗前的準備工作：查找資料，寫開題報告和論文綜述；</p><p>　　2.儀器、藥品的準備和各種實驗材料的準備。</p><p>　　2010年5月—2010年12月：</p><

22、p>　　1. 諾卡氏菌細胞壁肽聚糖的分離提取。</p><p>　　2. 研究諾卡氏菌細胞壁肽聚糖粗提物對烏鱧免疫活性指標的影響。</p><p><b>　　3、翻譯外文文獻。</b></p><p>　　2011年1月—2011年4月：</p><p>　　1、補充相關數據，整理試驗結果；</p>

23、<p><b>　　2、撰寫論文初稿。</b></p><p>　　3、論文定稿，論文答辯。</p><p><b>　　五、主要參考文獻：</b></p><p>　　[1]陳曉耘. 魚類的血液[J].重慶師專學報, 2000,19(3):70-73.</p><p>　　[2]陳寅兒

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30、表大會暨學術年會論文集[C].1988,200- 203.</p><p>　　[19]袁思平, 王國良, 金珊. 養(yǎng)殖魚類致病諾卡氏菌研究進展[J]. 微生物學通報, 2006,(02):137-141</p><p>　　[20]周玉,郭文場,楊振國,等. 魚類血液指標研究的進展[J] . 上海水產大學學報, 2001,10(2):163 -165.</p><p&

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33、a infection in yellowtail Seriola quinqueradiata Temminck and Schlegel by oral administration of Peptidoglycan derived from Bifidobacterium thermophilum[J]. J . Fish Dis . 1996.19:185-187</p><p>　　[24]Itami

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36、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　水產養(yǎng)殖</b></p><p>　　魚類血液指標的主要功能及研究概況</p><p>　　摘要：血液是具有活體組織所固有特性的一種結締組織，承擔著體內運輸、防御、免疫、體液調節(jié)及維持內環(huán)境相對穩(wěn)定的功能。當魚體受到病菌感染而引起疾病并

37、發(fā)生生理或病理變化時, 必定會引起其血液生理生化指標的變化。本文綜述了魚類的主要血液指標、功能及疾病、免疫增強劑等因素對魚類血液指標的影響，以期為魚類疾病致病機理及免疫防病的研究提供理論參考。</p><p>　　關鍵詞：魚類；血液指標；疾?。幻庖咴鰪妱?lt;/p><p>　　血液是具有活體組織所固有特性的一種結締組織，承擔著體內運輸、防御、免疫、體液調節(jié)及維持內環(huán)境相對穩(wěn)定的功能。其主要的

38、成分為血漿、血細胞。血液中含有各種營養(yǎng)成分，如無機鹽、氧、以及細胞代謝產物、激素、酶和抗體等，有營養(yǎng)組織、調節(jié)器官活動和防御有害物質的作用[1]。一般情況下，血液的調節(jié)能力是不強的，有時它的組成和結構也會發(fā)生相應的變化，而這種變化通常是病理性的。當魚體受到病菌感染而引起疾病并發(fā)生生理或病理變化時，必定與其血液生理生化指標變化有密切的關系[2]。因此，動物血液的各項生理生化指標被廣泛應用于評價魚類的健康與否、營養(yǎng)狀況及對環(huán)境的適應程度。&

39、lt;/p><p>　　1 魚類血液的主要生理生化指標及其功能</p><p>　　1.1 魚類血液的主要生理指標及其功能</p><p>　　魚類血液生理指標主要有紅細胞數RBC、白細胞數WBC、血紅蛋白Hb、紅細胞比容HCT、紅細胞沉降率ESR、紅細胞脆性EOB等。紅細胞也稱紅血球，是血液中數量最多的一種血細胞，同時也是脊椎動物體內通過血液運送氧氣的最主要的媒介。血

40、紅蛋白是脊椎動物紅血細胞的一種含鐵的復合變構蛋白，由血紅素和珠蛋白結合而成，其功能是運輸氧和二氧化碳，維持血液酸堿平衡。紅細胞數量、血紅蛋白含量是與機體呼吸和供氧狀況緊密有關的指標[3]，當魚體受到病菌感染后，其正常生理活動發(fā)生紊亂，其紅細胞數量、血紅蛋白含量、紅細胞比容等都會發(fā)生明顯的變化。魚類白細胞數量及形態(tài)變化，也在一定程度上反映其造血機能及疾病的情況。當病原人侵機體時，刺激造血機能和體液防御機能相對增強，白細胞數相對增加，其中的

41、顆粒細胞和單核細胞增加明顯。而當疾病進人后期，魚體造血機能和體液防御機能就會相應減弱，此時的白細胞數量也隨之減少，并呈老化現象。紅細胞沉降率是指紅細胞在一定條件下的沉降速度。一般情況下，健康機體的血沉數值波動于一個較狹窄范圍內，但在許多病理情況下，血沉就會明顯下降。紅細胞脆性是指引起紅細胞全部溶血的NaCl濃度，一般而言，新生紅細</p><p>　　1.2 魚類血液的主要生化指標及其功能</p>

42、<p>　　魚類血液生化指標主要有谷丙轉氨酶ALT、谷草轉氨酶AST、乳酸脫氫酶LDH、總蛋白TP、尿素BUN、肌酐Cr、總膽固醇CHO、血糖GLU，溶菌酶活性以及K+、Na+、Cl-等。谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、乳酸脫氫酶等血清酶類主要分布于機體的肝、腎、肌肉等組織細胞中，在正常情況下血清中這些酶活性低且相對恒定，并參與和控制機體內糖、蛋白質和脂肪等物質的代謝。當魚感染疾病后，血清中這些酶類的活性就會大大增強，預示機體的肝、腎

43、、肌肉等主要器官組織細胞發(fā)生病變，細胞內酶釋出?？偟鞍准囱蹇偟鞍祝茄骞腆w成分中含量最多的物質，主要是由肝臟合成的；總膽固醇是指血液中所有脂蛋白所含膽固醇之總和，包括游離膽固醇和膽固醇酯，肝臟也是其合成和貯存的主要器官；而血糖在血清中的含量也與肝臟密切相關。因此，總蛋白、總膽固醇和血糖都是反映肝臟功能的重要指標。Marja等[5]研究表明，在一定程度上，血漿中溶菌酶活性變化與循環(huán)系統(tǒng)中白細胞數目變化相一致，白細胞數目多，溶菌酶活性就

44、增加，兩者正相關。尿素、肌酐、K+、Na+、Cl-等的含量則是腎功能的參考指標[3,6,7]。腎功能的衰竭，腎單位濾過與重吸收功能的失調會引起</p><p>　　2 疾病對魚類血液指標的影響 </p><p>　　國內外學者對魚類血液學的研究做了很多工作。眾多的研究資料表明，魚類的血液學指標值與魚的種類、生活環(huán)境、營養(yǎng)、性別、健康狀況、疾病種類等有關[2,3,8]。如一些學者觀察到饑餓時

45、魚類血液中紅細胞數量會減少[9-11]，林光華[9]曾報道饑餓時紅細胞大小的變化，許多學者都發(fā)現魚類紅細胞數隨季節(jié)變化明顯等[12-14]。余毅[15]及米瑞芙[16]等的研究表明，患瘋狂病的鰱其TP和UGLU明顯降低，而患敗血癥鰱其TP、ALB明顯降低，BUN、肌酸酐(CREA)、P、谷草轉氨酶(GOT)等顯著升高，球蛋白(GLB)、GPT、甘油三酯(TG)、AChE的差異不顯著；患敗血癥和狂游癥的鰱白細胞數目都明顯增多，血漿中K、C

46、l離子也均明顯增高。陳福華等[17]關于赤點石斑魚增生性腎臟病的研究認為，當病原人侵魚體時，刺激造血機能和體液防御機能相對增強，白細胞數會相對增加；而當疾病進入后期，造血機能和體液防御機能也相應減弱，此時的白細胞數量會隨之減少。朱心玲等[18]研究患出血病的草魚表明，白蛋白和膽固醇的變化在潛伏期和發(fā)展期并不相同，白蛋白在潛伏期為顯著的增加，而在發(fā)展期為明顯的降低；膽固醇在潛伏期無變</p><p>　　3 免疫增

47、強劑對魚類血液指標的影響 </p><p>　　免疫增強劑，是一類通過不同方式達到增強機體免疫力的免疫治療藥物，如增強吞噬細胞的功能、提高細胞免疫或促進體液免疫功能等。免疫增強劑按其作用分為免疫佐劑、免疫恢復劑和免疫替代劑[23]。國內外關于魚類免疫增強劑的研究報道很多，目前研究報道過的免疫增強劑主要有:左旋咪唑、FK-565、MDP、β-葡聚糖、肽聚糖，脂多糖、寡糖、甲殼質、甲殼胺、VC以及VE等[24]。研究

48、表明，免疫增強劑能引起魚類血液指標的變化，通過作用于魚體非特異性免疫因子來提高魚類的抗病力。如劉云等[25]報道了免疫增強劑（甲殼胺）能提高血液中白細胞數量和吞噬能力，增強鯽魚血清中酚氧化酶的活性，且對鯽魚的生長無明顯影響。鄧時銘等[26]證實了蛭弧菌微生態(tài)制劑在鯽魚體內主要對頭腎產生顯著作用，能提高鯽魚的非特異性免疫。劉勇等[27]研究發(fā)現免疫增強劑可使河鯽魚血液中白細胞吞噬活性、血清和體液粘液的溶菌酶活性顯著提高。陳昌福等[28]研

49、究表明,在飼料中添加適量的免疫多糖(酵母細胞壁) 能夠增強異育銀鯽非特異性免疫功能，試驗組異育銀鯽白細胞吞噬活性均顯著高于對照組。</p><p><b>　　4 展望</b></p><p>　　隨著集約化養(yǎng)殖技術的應用，養(yǎng)殖規(guī)模突飛猛進，然而制約養(yǎng)殖生產的問題也日益突出。水環(huán)境污染、高密度養(yǎng)殖等不可避免地影響?zhàn)B殖魚類的健康，使其感染疾病的機率大大提高，導致養(yǎng)殖病害

50、頻繁發(fā)生，造成了巨大的經濟損失。目前，通過提高水產動物免疫力來抵抗疾病的發(fā)生已成為研究熱點?？股丶盎瘜W藥品的使用會使魚類疾病的病原生物抗藥性增強，并對生態(tài)環(huán)境造成污染，因此，深入研究水產動物免疫機理以及通過使用合適的免疫增強劑來增強養(yǎng)殖魚類免疫防御力，將會是魚類病害防治研究的趨勢。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 陳曉耘.

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55、業(yè),1982(4):10-16.</p><p>　　[11] 羅貫一.黃鱔血液的實驗.魚類學論文集(第三輯)[M].科學出版社.1983:69-75.</p><p>　　[12] 沈曉民,華苒.團頭魴九項血液學指標的正常值[J].動物學雜志,1990,25(1):3-6.</p><p>　　[13] 朱心玲,賈麗珠,張明瑛.草魚血液學的研究.I.九項血液常數的

56、周年變化[J].水生生物學報,1991,9(3):248-256.</p><p>　　[14] 林光華,張豐旺,翁世聰. 草魚血液的研究[J].動物學報,1985,31(4):336-343.</p><p>　　[15] 余毅,吳寶華.白鰱瘋狂病血液的研究[A].中國水產學會第四次全國會員代表大會暨學術年會論文集[C].1988,200-203.</p><p>

57、;　　[16] 米瑞芙,陶煩春,王曉梅,等.鰱敗血癥血液生理指標的變化[J].淡水漁業(yè),1993,23(4):16-19.</p><p>　　[17] 陳福華,陳畢生,楊鶯鶯,等.赤點石斑魚增生性腎臟病的血液病理觀察[J].熱帶海洋,1997,16(3):49-53.</p><p>　　[18] 朱心玲,賈麗珠,張明瑛.草魚出血病潛伏期和發(fā)展期的血液病理研究[J].水生生物學報,198

58、7,11(1):59-66.</p><p>　　[19] 張永嘉,吳澤陽,許其爵,等.網箱養(yǎng)殖羅非魚綜合癥的血清分析[J].水利漁業(yè),1994,(2):8,9,47.</p><p>　　[20] 陳寅兒,金珊,王國良.鱸魚溶藻弧菌病的血液生理生化指標研究[J].臺灣海峽, 2005,24(1):104-108.</p><p>　　[21] 邢維賢,安利國,傅榮

59、恕.鯉魚豎鱗病的血液病理學研究[J].山東師大學報(自然科學版),1996,11(4):84-86.</p><p>　　[22] 龐啟華,黃文芳,謝鳳.豐產鯽細菌性敗血癥的血液病理變化[J].應用與環(huán)境生物學報,2004,10(3):315-317.</p><p>　　[23] 謝少文.中國醫(yī)學百科全書-免疫學[M].上?？茖W技術出版社.1983:37-38.</p>&

60、lt;p>　　[24] Masahiro S.Current research status of fishi immunostimulants[J]. Aquaculture,1999,172:63-92.</p><p>　　[25] 劉云,孫峰,王丹.免疫增強劑對鯽魚非特異性免疫功能的影響[J].海洋科學,2004,28(9):42-45.</p><p>　　[26] 鄧時銘

61、,謬伏初,黃華偉,等.蛭弧菌微生態(tài)制劑對鯽非特異性免疫的影響[J].科學養(yǎng)魚,2009,(7):54-55.</p><p>　　[27] 劉勇,賈永紅.免疫增強劑對河鯽魚白細胞吞噬和溶菌酶活性的影響[J].安徽農業(yè)科學.2007,35(1):111-113.</p><p>　　[28] 陳昌福,吳凡,熊傳喜,等.免疫多糖(酵母細胞壁)對受免異育銀鯽免疫應答的調節(jié)作用[J].淡水漁業(yè),2

62、004,6(4):55-57.</p><p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　諾卡氏菌細胞壁肽聚糖粗提物對烏鱧免疫活性的影響</p><p><b>　　目錄</b></p><p

63、><b>　　1引言16</b></p><p>　　2 材料與方法16</p><p><b>　　2.1材料17</b></p><p>　　2.1.1 實驗菌種17</p><p>　　2.1.2 實驗用魚17</p><p>　　2.1.3實驗用水1

64、7</p><p>　　2.1.4 藥品和試劑17</p><p>　　2.2 試驗方法17</p><p>　　2.2.1 溶壁微球菌懸液的制備17</p><p>　　2.2.2肽聚糖注射液的制備17</p><p>　　2.2.3注射實驗17</p><p>　　2.2.4 血清

65、、血細胞樣本的采集17</p><p>　　2.2.5血細胞脆性（EOB）的測定17</p><p>　　2.2.6血細胞計數（RBS）17</p><p>　　2.2.7溶菌酶活力的測定18</p><p>　　2.2.8血液生化指標的測定18</p><p>　　2.3數據分析18</p>

66、<p><b>　　3 結果18</b></p><p>　　3.1諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧血液生理指標的影響18</p><p>　　3.1.1諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧血細胞數量的影響18</p><p>　　3.1.2諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧血細胞脆性的影響18</p><p>　　3.1.

67、3 諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧溶菌酶活力的影響19</p><p>　　3.2諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧血液生化指標的影響19</p><p>　　3.2.1 血清總蛋白TP20</p><p>　　3.2.2 血清白蛋白ALB20</p><p>　　3.2.3 堿性磷酸酶ALP21</p><p>　　3

68、.2.4 尿素氮BUN21</p><p>　　3.2.5 乳酸脫氫酶LDH22</p><p>　　3.2.6 乳酸脫氫酶同工酶LDH122</p><p><b>　　4 討論23</b></p><p>　　4.1 免疫多糖對水產動物血細胞數量和血細胞脆性的影響23</p><p>

69、;　　4.2 免疫多糖對水產動物溶菌酶活力的影響23</p><p>　　4.3免疫多糖對水產動物血清總蛋白（TP）和血清白蛋白（ALB）的影響23</p><p>　　4.4 免疫多糖對水產動物堿性磷酸酶（ALP）的影響24</p><p>　　4.5 免疫多糖對水產動物尿素氮（BUN）的影響24</p><p>　　4.6免疫多糖

70、對水產動物乳酸脫氫酶（LDH）和乳酸脫氫酶同工酶（LDH1）的影響24</p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻25</b></p><p>　　摘要：采用濃度為16.7mg/mL的鰤魚諾卡氏菌細胞壁肽聚糖粗提物對烏鱧進行腹腔注射，于實驗24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h時

71、取其血液測定血細胞數目、血細胞脆性（EOB）、溶菌酶活力（LSZ）、血清總蛋白（TP）含量、血清白蛋白(ALB)含量、堿性磷酸酶（ALP）活性、尿素氮（BUN）含量、乳酸脫氫酶（LDH）活性以及乳酸脫氫酶同工酶（LDH1）等與烏鱧免疫力相關的血液生理指標和生化指標，結果表明：鰤魚諾卡氏菌細胞壁肽聚糖使烏鱧血細胞數目和血細胞脆性均有增加，但影響不顯著（P>0.05）；溶菌酶活力、血清總蛋白和血清白蛋白在48h時顯著上升（P<0

72、.05）；堿性磷酸酶ALP活性與對照組相比，均呈現上升趨勢，且差異性顯著（P<0.05）；尿素氮水平顯著低于對照組（P<0.05），實驗96 h后保持相對穩(wěn)定；乳酸脫氫酶活性和乳酸脫氫酶同工酶均在72h時達到最強，與對照組差異顯著（P<0.05），說明鰤魚諾卡氏菌細胞壁肽聚糖能夠增強烏鱧的免疫活性。</p><p>　　關鍵詞：諾卡氏菌；肽聚糖；烏鱧；血液生理指標；血液生化指標</p>

73、;<p>　　Abstract:With 16.7g/mL of Yellowtail Nocardia cell wall peptidoglycan intraperitoneal injection for argus, at 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h, 168h after the experimental collect blood to determine the Red b

74、lood cell count, blood cell fragility(EOB), Lysozyme activity(LSZ), serum total protein (TP), serum albumin(ALB), alkaline phosphatase(ALP), blood urea nitrogen (BUN), lactate dehydrogenase (LDH), lactate dehydrogenase i

75、soenzyme (LDH1) and other physiological and biochemical indexes of blood r</p><p><b>　　朗讀</b></p><p>　　顯示對應的拉丁字符的拼音</p><p><b>　　字典</b></p><p>　　

76、Key words: Nocardia; peptidoglycan; Ophicephalus argus; blood physiological parameters; blood biochemical parameters</p><p><b>　　1引言</b></p><p>　　諾卡氏菌（Nocardia）為革蘭氏陽性菌，好氧，分類上屬細菌域，厚壁菌

77、門，放線菌綱，放線菌目，諾卡氏菌科。菌體呈長或短桿狀, 或細長分枝狀，常斷裂成桿狀至球狀體，基絲發(fā)達，呈分枝狀，氣絲較少。魚類諾卡氏菌病于1963年在全球首次報告，確認于阿根廷熱帶養(yǎng)殖的虹彩脂魚（Hyphessobrycon innesi）[1]。隨后此病又陸續(xù)發(fā)生在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、黃尾鰤（Seriola lalandi）、烏鱧、大西洋牡蠣（Crassostrea gigas）、大口鱸（Micropter

78、us salmoides）和海鱸（Lateolabrax japonicus）等水產養(yǎng)殖動物中，曾影響日本、美國、澳大利亞、加拿大等地的水產養(yǎng)殖業(yè)，造成很大經濟損失[2]。該病曾是日本水產養(yǎng)殖中最主要的水產動物疾病之一，也是大西洋牡蠣養(yǎng)殖的主要疾病。而該病近年來對我國大陸和臺灣水產養(yǎng)殖業(yè)也產生了較大影響，先后在烏鱧、大口鱸、海鱸、大黃魚等養(yǎng)殖魚類中發(fā)生此病[3]。</p><p>　　肽聚糖( peptidogl

79、ycan) 又稱粘肽、胞壁質或粘質復合物，由雙糖單位，四肽尾還有肽橋聚合而成，是N-乙酰葡萄糖胺（NAG）和N-乙酰胞壁酸（NAMA）交替連接的雜多糖與不同組成的肽交叉連接形成的多層網狀大分子結構。其是一種多糖與氨基酸相連的多糖復合物，由于此復合物中氨基酸鏈不像蛋白質中的那樣長，故稱肽聚糖。肽聚糖是許多細菌細胞壁的主要成分，不同的肽聚糖中出現的氨基酸數是有限的，亞肽單位及間肽橋上氨基酸的組成及排列上的不同，決定了肽聚糖種類的多樣性[4]

80、。近年來的大量的研究結果表明，肽聚糖具有包括佐劑活性在內的多種生物活性。肽聚糖能對免疫系統(tǒng)產生不同的免疫調節(jié)作用，能夠增強機體免疫能力，是一種免疫系統(tǒng)的免疫增強劑。肽聚糖能夠刺激B、T 淋巴細胞，增強體液免疫和細胞免疫，激活單核細胞及多核白細胞的吞噬活性，活化補體[5]，其分子中的多糖成分還具有抗腫瘤，抗感染能力[6]。在水產養(yǎng)殖中投喂肽聚糖后發(fā)現，其能顯著提高水產動物如五條鰤[7]、斑節(jié)對蝦[8]、日本對蝦[9]等抗病力和成活率。因此

81、，使用肽聚糖有利于解決水產養(yǎng)殖中大量使用抗生素藥物防治病害所表現出的生物抗藥性問題及食品的藥</p><p>　　烏鱧（Ophicephalus argus），亦稱黑魚，屬鱸形目，攀鱸亞目，鱧科，鱧屬，體呈烏黑色，細長，前部圓筒狀，后部側扁，由背至腹顏色逐漸變淺，圓鱗。烏鱧分布極為廣泛，除西部高原地區(qū)外，從黑龍江至海南的河川、湖泊、水庫、池塘等各種類型的水體中均有發(fā)現，國外產于朝鮮西、南部。烏鱧肉質鮮美，富含蛋白

82、質、脂肪、18種氨基酸等，還含有人體必需的鈣、磷、鐵及多種維生素，營養(yǎng)豐富、肉味甘性溫且骨刺少，有補脾、利水的藥用功能，深受群眾的歡迎。烏鱧是一種適應性強、對不良水溫、水質及缺氧條件有較強耐受力的魚類，在江河湖塘等自然環(huán)境中很少發(fā)病。但隨著烏鱧人工高密度養(yǎng)殖的發(fā)展，由于養(yǎng)殖密度過高，養(yǎng)殖區(qū)域水質惡化嚴重，以及烏鱧經過多代人工繁育造成種質退化，導致機體抵抗力下降等原因，烏鱧的病害時有發(fā)生，且呈現出種類多、流行范圍廣、防治效果不明顯等特點，

83、給養(yǎng)殖生產造成了較大的經濟損失，也對烏鱧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展起著嚴重的阻礙作用。</p><p>　　本實驗以烏鱧為研究對象，通過對烏鱧人工注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖粗提物，研究其對烏鱧免疫活性指標的影響，為烏鱧諾卡氏菌病的防治提供理論參考。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1材料<

84、/b></p><p>　　2.1.1 實驗菌種 </p><p>　　鰤魚諾卡氏菌（Nacardia seriolea）、溶壁微球菌（Microcrococcus lysodeikticus）。</p><p>　　2.1.2 實驗用魚</p><p>　　烏鱧（O.argus )購自寧波水產市場，體重400~500g，體長約30cm

85、，共40尾。經高錳酸鉀全身消毒后，分成2組，分別為實驗組和對照組。暫養(yǎng)于室內大塑料桶中并用遮陽布遮蓋，以保持適宜的環(huán)境暗度。根據水質情況每天適時換水1~2次，每次換水1/3。定時定量投喂小魚，及時吸出殘餌和糞便，保持水質的清潔。</p><p>　　2.1.3實驗用水 </p><p>　　實驗用水為充分曝氣處理的自來水，試驗期間使用充氧泵持續(xù)充氧。</p><p>

86、;　　2.1.4 藥品和試劑 </p><p>　　血清總蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、乳酸脫氫酶（LDH）、乳酸脫氫酶同工酶（LDH1）等試劑盒購自美康生物科技有限公司；0.067mol/L磷酸緩沖液（KH2PO4 73mL，0.067mol/L K2HPO4 27mL，NaCl 0.5g，pH 6.4）；0.75%的生理鹽水；鰤魚諾卡氏菌肽聚糖（本研究室自制）。

87、</p><p><b>　　2.2 試驗方法</b></p><p>　　2.2.1 溶壁微球菌懸液的制備 </p><p>　　將溶壁微球菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂斜面上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用0.067mol/L PBS（pH 6.4）將溶壁微球菌從營養(yǎng)瓊脂斜面上洗下，配成0.2mg/mL的菌懸液（在570nm處的吸光值為A=0.4

88、00），備用。</p><p>　　2.2.2肽聚糖注射液的制備 </p><p>　　取鰤魚諾卡氏菌細胞壁肽聚糖粗提物0.25g溶于15ml的0.75%生理鹽水中，制成濃度為0.0167g/mL的肽聚糖注射液。</p><p>　　2.2.3注射實驗 </p><p>　　采用腹部注射的方法將已配好的肽聚糖溶液注射到實驗組魚體內，每尾

89、注射0.5ml，對照組注射同量無菌生理鹽水。注射后分別在24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h時每組取魚3尾，抽取其血液樣本，用以各項血液指標的檢測。</p><p>　　2.2.4 血清、血細胞樣本的采集 </p><p>　　將烏鱧側放平躺于解剖盤中，尾部穿刺靜脈采血后，一部分放置于離心管中4℃靜置過夜，經3000r/min離心后吸出血清，用于溶菌酶活力和各項

90、生化指標的測定；另一部分用無菌肝素鈉抗凝，用于血細胞計數以及血細胞脆性的測定，當天完成。</p><p>　　2.2.5血細胞脆性（EOB）的測定</p><p>　　配置系列濃度為0.17%~0.45%（梯度為0.02%）的NaCl溶液放入若干支試管中并編號，取血后立即向各試管中滴入一滴血并揉搓混勻，室溫下放置2小時后觀察結果，以完全溶血的NaCl濃度作為紅細胞最大抵抗值，即紅細胞的最小

91、脆性。</p><p>　　2.2.6血細胞計數（RBS）</p><p>　　按Neubuer氏改良方法進行。用5mL移液槍準確吸取3.98mL紅細胞稀釋液于干凈試管內，然后用毛細吸管吸20μl血放入試管底部，輕輕搖振試管1~2min，以混勻稀釋的血液，然后用血球計數板進行計數。</p><p>　　2.2.7溶菌酶活力的測定</p><p&g

92、t;　　根據簡紀常[10]的方法進行。吸取40uL血清加入到3mL溶壁微球菌菌懸液中，均勻混合后立刻在540nm下測定A0值；然后在28℃水浴中溫浴30min，取出后置于4℃冰浴中以終止反應，再測定A值；最后按公式計算溶菌酶活力：U=(A0-A)/A。</p><p>　　2.2.8血液生化指標的測定 </p><p>　　血清總蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（ALP）

93、、尿素氮（BUN）、乳酸脫氫酶（LDH）、乳酸脫氫酶同工酶1（LDH1）等的測定均在日立7020全自動生化儀上完成，具體方法根據說明書進行。</p><p><b>　　2.3數據分析</b></p><p>　　所得結果均以3個平行組數據的平均值±標準差(Means±SE)表示；所有數據分析均采用SPSS 13.0 (Statiscal Pack

94、age for the Social Science) 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-factor analysis of variance)和均值多重比較分析(LSD法)。</p><p><b>　　3 結果</b></p><p>　　3.1諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧血液生理指標的影響</p><p>　　3.1.1諾卡氏菌細胞壁肽

95、聚糖對烏鱧血細胞數量的影響</p><p>　　烏鱧注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖后血細胞數目的變化情況見圖1。由圖1可知，烏鱧在注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖后，實驗144h內各實驗組血細胞數量與對照組相比都有增加，但均不存在顯著性差異（P>0.05）。</p><p>　　圖1肽聚糖對烏鱧血細胞數量的影響</p><p>　　Fig.1 Effects of pep

96、tidoglycan on the Red blood cell count of Ophicephalus argus</p><p>　　3.1.2諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧血細胞脆性的影響</p><p>　　烏鱧注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖后血細胞脆性的測定結果見圖2。由圖2可知，在實驗48h后實驗組烏鱧血細胞脆性比對照組均略有增大，但差異不顯著（P>0.05）。</p&g

97、t;<p>　　圖2 注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧血細胞脆性的影響</p><p>　　Fig.2 Effects of peptidoglycan on the blood cell fragility of Ophicephalus argus</p><p>　　3.1.3 諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧溶菌酶活力的影響</p><p>　　注射

98、諾卡氏菌細胞壁肽聚糖后，烏鱧血液溶菌酶活力的變化情況見圖3。由圖3可知，實驗48h時實驗組溶菌酶活力與對照組相比有顯著增強（P<0.05）；其它實驗時間點差異不顯著（P>0.05）。</p><p>　　圖3 注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧溶菌酶活力的影響</p><p>　　Fig.3 Effects of peptidoglycan on the Lysozyme act

99、ivity of Ophicephalus argus</p><p>　　*表示實驗組與對照組存在顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　3.2諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧血液生化指標的影響</p><p>　　3.2.1 血清總蛋白TP</p><p>　　圖4為烏鱧注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖后血清總蛋白TP的變化情況。由圖4可

100、知，在實驗48h內，實驗組烏鱧血清總蛋白含量迅速增高并顯著高于對照組（P<0.05），但其后逐漸降低，與對照組差異不顯著（P>0.05）。</p><p>　　圖4 注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧血清總蛋白TP的影響</p><p>　　Fig.4 Effects of peptidoglycan on the serum total protein of Ophicepha

101、lus argus</p><p>　　*表示實驗組與對照組存在顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　3.2.2 血清白蛋白ALB</p><p>　　注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖后，烏鱧血液血清白蛋白ALB的變化情況見圖5。由圖5可知，烏鱧在注射肽聚糖后，其血清白蛋白含量有增高趨勢，實驗48h時顯著大于對照組（P<0.05），但其它實驗時間點差異

102、性不顯著（P>0.05）。</p><p>　　圖5 注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧血清白蛋白ALB的影響</p><p>　　Fig.5 Effects of peptidoglycan on the serum albumin of Ophicephalus argus</p><p>　　*表示實驗組與對照組存在顯著性差異（P>0.05）<

103、/p><p>　　3.2.3 堿性磷酸酶ALP</p><p>　　注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧堿性磷酸酶ALP活性的影響見圖6。由圖6可知，在實驗時間內各實驗組堿性磷酸酶ALP活性與對照組相比，均呈現上升趨勢。在實驗24h時，實驗組堿性磷酸酶活性最大，實驗24h、48h、96h、144h、168h時實驗組與對照組差異顯著（P<0.05）。</p><p>　　

104、圖6 注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧堿性磷酸酶ALP活性的影響</p><p>　　Fig.6 Effects of peptidoglycan on the alkaline phosphatase of Ophicephalus argus</p><p>　　*表示實驗組與對照組存在顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　3.2.4 尿素氮BU

105、N</p><p>　　圖7為烏鱧注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖后尿素氮BUN含量的變化情況。由圖7可知，隨著實驗時間的延長，實驗組烏鱧尿素氮水平逐漸低于對照組，實驗96h后保持相對穩(wěn)定，且均顯著低于對照組（P<0.05）。</p><p>　　圖7 注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧尿素氮BUN的影響</p><p>　　Fig.7 Effects of pepti

106、doglycan on the blood urea nitrogen of Ophicephalus argus</p><p>　　*表示實驗組與對照組存在顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　3.2.5 乳酸脫氫酶LDH</p><p>　　注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧乳酸脫氫酶LDH活性的影響見圖8。由圖8可知，在實驗72h內烏鱧血液乳酸脫

107、氫酶活性逐漸增強，72h時達到最強，與對照組差異顯著（P<0.05）；其后逐漸降低，并一直處于對照組水平附近，差異不顯著（P>0.05）。</p><p>　　圖8 注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖對烏鱧乳酸脫氫酶LDH的影響</p><p>　　Fig.8 Effects of peptidoglycan on the lactate dehydrogenase of Ophice

108、phalus argus</p><p>　　*表示實驗組與對照組存在顯著性差異（P<0.05）</p><p>　　3.2.6 乳酸脫氫酶同工酶LDH1</p><p>　　圖9為注射諾卡氏菌細胞壁肽聚糖后對烏鱧乳酸脫氫酶同工酶1LDH1活性的影響。由圖9可知，在72h時實驗組烏鱧血液乳酸脫氫酶同工酶活性最強，與對照組差異顯著（P<0.05）；其它實驗