遞增負荷運動對大鼠早期b細胞發(fā)育數(shù)量及凋亡情況的影響

1、<p>　　遞增負荷運動對大鼠早期B細胞發(fā)育數(shù)量及凋亡情況的影響</p><p>　　摘 要：目的：探討運動性免疫失衡對早期B細胞發(fā)育及調(diào)節(jié)體系的影響。方法：SPF級雄性SD大鼠128只，隨機分成絕對安靜組（AC）組，運動前安靜組（A）、運動后即刻組（J）、運動后3H組（3H），進行6周遞增負荷跑臺運動，分別在第0、2、4、6周用四色流式細胞術(shù)檢測大鼠早期immature B、mature B細胞群數(shù)量

2、及凋亡情況。結(jié)果：0周：各組間immature B、mature B細胞群數(shù)量及凋亡情況均無顯著性差異（P>0.05）；2周，與A組相比，J組immature B、mature B數(shù)均呈顯著性下降（P<0.05），3H組均顯著性上升（P<0.05），而J組immature B細胞凋亡率呈顯著性上升（P<0.05），mature B細胞凋亡率則呈顯著性下降（P<0.05）；4周：immature B細胞數(shù)在J

3、組呈顯著性下降（P<0.05），而mature B細胞數(shù)在3H組呈顯著性上升（P<0.05），J組immature B細胞凋亡率呈顯著性上升（P<0.05）；6周：J組僅mature B細胞數(shù)呈顯著性下降（P<0.05），僅immature B細胞凋亡率J組呈顯著性上升</p><p>　　關(guān)鍵詞：B淋巴細胞；發(fā)育；調(diào)節(jié)體系；細胞凋亡；骨髓；運動性免疫失衡 </p><

4、p>　　中圖分類號：G804.7 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-2076（2013）01-0060-06 </p><p>　　筆者前期的實驗研究證明：“運動性免疫抑制”最初是針對T細胞發(fā)育分化調(diào)節(jié)而言，總結(jié)了前期工作，筆者認為針對B細胞、T細胞等免疫細胞的發(fā)育分化調(diào)節(jié)而言，稱之為“運動性免疫失衡”會更準(zhǔn)確、全面[1-5]。6周遞增運動過程中，機體根據(jù)運動需要，通過改變凋亡率，進而改變早期發(fā)育中Pro

5、 B細胞、Pre B細胞的數(shù)量百分比，以盡可能維持免疫穩(wěn)態(tài)，而且發(fā)現(xiàn)Pre B細胞對運動負荷更敏感，易受運動的刺激而發(fā)生凋亡，細胞數(shù)量百分比顯著性下降[1]。也研究了早期B細胞發(fā)育起著關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子[2]，它們在6周遞增負荷運動中，產(chǎn)生的適應(yīng)性及應(yīng)答性變化，以及與Pro B、Pre B細胞之間的等級性調(diào)節(jié)。那么，骨髓早期B細胞在經(jīng)歷了Pro B、Pre B細胞發(fā)育后的immature B，mature B細胞階段，又發(fā)

6、生了哪些變化？這些變化與Pro B細胞、Pre B細胞的變化又有著怎么樣的聯(lián)系？ </p><p>　　基于此問題的思考，在前期長期遞增負荷對早期Pro B細胞、Pre B細胞在骨髓中發(fā)育影響的基礎(chǔ)上，利用流式細胞術(shù)，分析6周遞增負荷運動對immature B，mature B細胞數(shù)量與凋亡情況的影響及其與Pro B細胞、Pre B細胞的相關(guān)關(guān)系，探討長期運動對骨髓早期B細胞發(fā)育的調(diào)節(jié)機制，為運動性免疫失衡的調(diào)控

7、機制及進一步的干預(yù)措施提供一定的理論依據(jù)。 </p><p><b>　　1 材料與方法 </b></p><p><b>　　1.1 實驗動物 </b></p><p>　　雄性SD大鼠（8周齡，體重130～150 g）128只 （許可證號：SCXK（粵）2008-0020；NO：0043379，粵監(jiān)證字 F2008A0

8、02），隨機分為實驗組和對照組。實驗組（96只）進行 6 周遞增強度訓(xùn)練；絕對安靜組（對照組，32只），正常喂養(yǎng)，不進行運動干預(yù)，分別于第 0、2、4、6 周末采樣，用于判別大鼠生長對測試指標(biāo)的影響（實驗組實際參與運動的大鼠是106只，以備補充建模中意外死亡大鼠。本次建模因意外死亡大鼠2只）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組各指標(biāo)各周之間沒有顯著性差異（P>0.05），表明 6 周生長對這些指標(biāo)沒有顯著影響。 </p><p&

9、gt;　　1.2 運動模型設(shè)計、取材時間及建模測試指標(biāo) </p><p>　　參照Bedfor d（1979）根據(jù)大鼠體重/ 攝氧量回歸方程所建立的遞增負荷（ 跑臺坡度），課題組前期通過反復(fù)實驗性探索獲得的運動性免疫失衡發(fā)生、發(fā)展的動物模型[6-11]：模擬運動訓(xùn)練安排，長時間、大強度且負荷遞增。 </p><p>　　因此，采用低強度適應(yīng)性運動（10 m/min）訓(xùn)練 1 周后，負荷遞增

10、至 20 m/min。隨后，每周遞增負荷增量 5 m/min。至第 6 周，達到 40 m/min，基本達到大鼠最大負荷強度。分別在第 0、2、4、6 周最后一次運動后 48 h 采樣。采樣日進行與上周相同負荷的跑臺運動，分別在運動前安靜組（A）、運動后即刻組（J）、運動后3H組（3H）無菌取大鼠（股骨）骨髓，用于流式細胞儀檢測。 </p><p>　　多年來的研究表明，分別從血液指標(biāo)、生化指標(biāo)、脾淋巴細胞分泌I

11、L-2、sIL-2R、T細胞活性、巨噬細胞吞噬能力、白細胞介素、自由基代謝、抗氧化體系、心肌離子泵、神經(jīng)遞質(zhì)等指標(biāo)，同時監(jiān)測大鼠體重、皮毛亮度、進食飲用水量及飼料量，通過比較對照組與訓(xùn)練組的這些指標(biāo)的顯著性變化，來驗證大鼠6周遞增負荷跑臺運動模型的建立是成功的[6-11]。 </p><p>　　1.3 主要試劑與儀器 </p><p>　　主要試劑：Alexa Fluor 647 ant

12、i-rat CD45RA，產(chǎn)品編號202312，購自BioLegend；Phycoerythrin （PE） anti-rat IgM，產(chǎn)品編號12-0990，購自eBioscience；Phycoerythrin （PE） Mouse IgG1， κIsotype Ctrl，產(chǎn)品編號12-4714，購自eBioscience；FITC anti-rat IgD （H6/31），產(chǎn)品編號sc-53081，購自Santa Cruz；nor

13、mal mouse IgM-FITC，產(chǎn)品編號sc-2859，購自Santa Cruz；7-AAD，產(chǎn)品編號00-6993，購自eBioscience；BD Calibrite 3 Beads（FITC，PE，PerCP） 產(chǎn)品編號340486，購自BD PharmingenTM；BD Calibrite APC Bead產(chǎn)品編號340487，購自BD PharmingenTM。主要儀器：美國BD公司FASC Calibur流式細胞儀；

14、日本OLYMPUS倒置生物顯微鏡；美國Thermo FORMA 725超</p><p>　　活體麻醉大鼠取股骨，置冰上快速用16號針頭抽取骨髓；制備新鮮骨髓單細胞懸液，對細胞計數(shù)，將細胞濃度調(diào)至5×106/ml。骨髓中兩個亞群的表型分別為：Immature B cell：CD45RA+ （IgM+ IgD-）；mature B cell：CD45RA+ （IgM+ IgD+）；采用直接染色法，在流式細

15、胞儀FACS Calibur（BD公司）上收集并進行表型分析。 </p><p><b>　　1.5 數(shù)據(jù)處理 </b></p><p>　　所有數(shù)值均以（±SD）表示，SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件完成，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析。顯著性差異水平為P<0.05，非常顯著性差異水平為P<0.01。 </p&g

16、t;<p><b>　　2 研究結(jié)果 </b></p><p><b>　　3 討論與分析 </b></p><p>　　3.1 6周遞增負荷運動對immature B細胞數(shù)量的影響 </p><p>　　Pre B細胞輕鏈基因成功重排后，B細胞膜上就開始出現(xiàn)單體膜型IgM，這標(biāo)志著B細胞抗原非依賴階段imm

17、ature B細胞發(fā)育的完成。此時通過克隆刪除，形成自身免疫耐受，發(fā)育為表達mIgM+mIgD+的成熟B細胞（mature B cell），離開骨髓進入外周免疫器官。 </p><p>　　6周遞增負荷運動過程中，在WK0，運動并未對骨髓早期B細胞數(shù)量百分比造成明顯影響，但從WK2開始，各運動組B淋巴細胞出現(xiàn)較明顯波動，表明一次性的短時間運動訓(xùn)練對骨髓幾乎沒有影響，然而大強度、長時間訓(xùn)練對骨髓早期B細胞發(fā)育有較顯

18、著的影響。 </p><p>　　經(jīng)過長期的運動訓(xùn)練，骨髓immature B細胞數(shù)量百分比出現(xiàn)不同時相的顯著性變化（見圖2-A），提示隨訓(xùn)練時間的延長，運動負荷的增強，運動量的積累對immature B細胞的影響漸趨增強，提示6周遞增負荷運動中，immature B細胞漸趨對運動應(yīng)激的敏感性提高。結(jié)合我們前期對Pro B、Pre B細胞的研究結(jié)果[1]，推測是機體根據(jù)運動的需要，通過調(diào)節(jié)B細胞所占骨髓總細胞的數(shù)

19、量百分比，盡力維持免疫穩(wěn)態(tài)。 </p><p>　　可能的原因，一方面是運動訓(xùn)練的骨骼肌適應(yīng)性改變的發(fā)生可能伴隨如中性粒細胞和吞噬細胞在肌肉損傷處聚集、骨骼肌白細胞浸潤等炎癥反應(yīng)。有研究顯示機體發(fā)生炎癥時，在多種炎性介質(zhì)誘導(dǎo)下早期造血細胞更傾向于向髓系方向分化，而抑制向淋巴系的分化[12]。 </p><p>　　推測另一方面可能是由于運動能夠影響各群B淋巴細胞的分化成熟的同時，各種應(yīng)激激

20、素的產(chǎn)生，也誘導(dǎo)早期B細胞的大量凋亡，導(dǎo)致骨髓內(nèi)各群早期B淋巴細胞計數(shù)減少。因此，我們繼續(xù)研究了6周遞增負荷運動對骨髓早期B細胞發(fā)育各階段細胞凋亡的影響。此外，還可能與運動大量耗能，骨髓發(fā)育中B細胞對葡萄糖和氨基酸的攝取減少有關(guān)。 </p><p>　　3.2 6周遞增負荷運動對immature B細胞凋亡的影響 </p><p>　　在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能行使過程中，細胞凋亡始終扮演重要

21、角色，淋巴細胞的分化、成熟乃至死亡過程都伴隨著凋亡。 </p><p>　　本實驗用流式7-AAD染料，不含固定劑的紅細胞溶血素處理細胞，染上 7-AAD的細胞是中晚期凋亡細胞及壞死細胞。因嚴格控制實驗條件的一致性，可認為各組壞死細胞數(shù)相近，故各組的染色細胞的比較，可以認為是凋亡細胞的比較，也被業(yè)內(nèi)人士認可。 </p><p>　　Lu L等運用不同的實驗方法證明發(fā)育中B細胞的丟失是由凋亡

22、造成[13-15]。 當(dāng)未成熟細胞開始表達IgM時，將會遇到并識別骨髓微環(huán)境中的自身抗原，部分表達抗自身抗原受體的B細胞與抗原結(jié)合后被誘導(dǎo)凋亡而清除。 </p><p>　　本研究中immature B細胞凋亡率的變化特征揭示，隨著運動負荷的增加和訓(xùn)練時間的延長，應(yīng)該是機體根據(jù)運動需要，通過改變凋亡率，進而改變B細胞所占骨髓總細胞的數(shù)量百分比，以求緩解運動性免疫失衡（如細胞免疫的抑制；體液免疫的亢進，外周B細胞數(shù)

23、量增多但分泌免疫球蛋白功能降低等），盡可能的維持免疫穩(wěn)態(tài)。各早期B細胞亞群凋亡率的增加，推測可能是運動減少了早期發(fā)育中各B細胞亞群細胞膜表面抗凋亡蛋白 Bcl-2的表達而促成的。 </p><p>　　流式實驗檢測到的凋亡細胞的百分數(shù)，其實僅是代表了在一個短暫時刻里可獲取的、并且是在體非體外培養(yǎng)狀態(tài)中的大量凋亡細胞的一小部分，而且是撲捉了在凋亡發(fā)生伊始與巨噬細胞吞噬這一時間段內(nèi)的細胞。流式細胞術(shù)測得的骨髓中早期B

24、細胞的凋亡，只是一個相對的凋亡活動，本身并不能給予一個在體的真實凋亡率。因此，今后觀測早期B細胞在體發(fā)育的凋亡率，有待于探索一種更直接的檢測方法。 </p><p>　　3.3 6周遞增負荷運動對mature B細胞數(shù)量及其凋亡的影響 </p><p>　　B前體細胞在骨髓中的發(fā)育由Immature B細胞向mature B細胞轉(zhuǎn)化的過程，經(jīng)歷了陰性選擇，從而保證有效產(chǎn)生的mature B

25、細胞對自身抗原的免疫耐受，防止自身免疫性疾病的發(fā)生，所以在immature B細胞向mature B細胞轉(zhuǎn)化的這一過程對機體來說是至關(guān)重要的。 </p><p>　　6周遞增負荷運動過程中，mature B細胞數(shù)量百分比及凋亡率的適應(yīng)性變化特征是：與WK0 A相比，mature B在WK2 A呈顯著性上升（P0.05），WK6 A顯著性高于WK0 A（P0.05）（見圖3-B）。與前期工作中Pro B、Pre B

26、[1]、immature B細胞數(shù)量百分比的變化相比，實驗采點相同時相下，本研究中mature B則呈現(xiàn)較多的反相變化趨勢（見圖2-B，圖3-B），推測由以下因素造成。 </p><p>　　Laakko等[16]模擬了應(yīng)激下的CS（皮質(zhì)酮）濃度（60～95μg/ dl血液），觀察12～36h內(nèi)CS對BM（骨髓）中的各發(fā)育階段B細胞的影響。發(fā)現(xiàn)：不成熟B細胞，由占BM所有細胞數(shù)的約7%下降到不足1%。成熟B細胞并

27、未受CS的負面影響，由占BM4%上升為12%，增加了近3倍。研究者們對增多的成熟B細胞的來源也不清楚，推測是外周B細胞歸巢入骨髓所導(dǎo)致；另一方面，可能與骨髓早期B細胞各亞群抗凋亡原癌基因bcl-2的表達量多少有關(guān)。在細胞進行基因重排時觀測到抗凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)，只有在prepro B細胞（前祖B細胞）和mature B細胞表達大量的Bcl-2。 　　其他研究報道揭示在Pre B階段，可誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性細胞因子的TLR信號能夠促進Pr

28、e B細胞表達IgM，成為新生B淋巴細胞[17]。另有其他研究者們進一步推測成熟B細胞的增多是由于自身反應(yīng)性B淋巴細胞因逃避陰性選擇過程而存活下來[18]，這是由可誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性細胞因子的TLR4信號促成的。還有研究揭示，一些自身反應(yīng)性的B細胞在陰性選擇過程中并不一定走向凋亡，而是有可能返回到上一個階段重新進行V-D-J重排，重新產(chǎn)生成</p><p>　　Osmond、Stephan、Cancro等先后提出了代償

29、機制學(xué)說[17，20]。他們認為，當(dāng)機體處于應(yīng)激或其他需要更多能量輸出狀態(tài)下，存在代償機制，出現(xiàn)骨髓mature B淋巴細胞增多現(xiàn)象。研究顯示Pro B細胞隨年齡增長數(shù)量變化不大，但對IL-7刺激的增殖能力下降，Pre B細胞數(shù)量減少，但機體通過代償機制使存活的Pre B細胞更多的分化成為mature B淋巴細胞，以適應(yīng)機體整合需要[20]。 </p><p>　　本研究中mature B細胞的變化特征，產(chǎn)生原因

30、可能是在6周遞增負荷運動中，長時間的運動消耗，引起HPA軸活動加強，皮質(zhì)酮明顯上升，機體分解代謝加速；同時，雄激素分泌減少，合成代謝減弱，以此滿足持續(xù)運動對機體大量耗能的需求。推測這些變化驅(qū)動了骨髓發(fā)育中B細胞的代償機制，即促使存活的Pre B細胞更多的分化為mature B細胞，以適應(yīng)機體大量耗能的需要。 </p><p>　　運動對早期B淋巴細胞發(fā)育的影響，涉及多方面、錯綜復(fù)雜的調(diào)節(jié)因素網(wǎng)絡(luò)，今后還有大量的實

31、驗研究工作待進行。如圖4所示，本課題研究希望進一步通過組織學(xué)觀察，細胞水平，轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子及其受體、趨化因子及其受體、Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等各層面進一步探討長期運動對骨髓早期B細胞發(fā)育的調(diào)節(jié)機制，為運動性免疫失衡的調(diào)控機制及進一步的干預(yù)措施提供理論依據(jù)。 </p><p><b>　　4 研究結(jié)論 </b></p><p>　　4.1 提示6周遞增運動過程中，機

32、體根據(jù)運動需要，通過改變凋亡率，進而促成早期發(fā)育中B細胞的數(shù)量百分比的改變，以求緩解運動性免疫失衡（如細胞免疫的抑制、體液免疫的亢進等），盡可能維持免疫穩(wěn)態(tài)； </p><p>　　4.2 聯(lián)系前期對Pro B、Pre B細胞數(shù)量及凋亡率的影響，本研究提示隨訓(xùn)練時間的延長，運動負荷的增強，運動應(yīng)激對mature B凋亡率的影響卻是漸趨減弱的； </p><p>　　4.3 結(jié)合前期對Pro

33、 B、Pre B細胞的研究工作，實驗采點相同時相下，本研究中mature B則呈現(xiàn)較多的反相變化趨勢。提示6周遞增負荷運動可能通過代償機制促使存活的Pre B細胞更多地分化為mature B淋巴細胞，以適應(yīng)機體大量耗能的需要。 </p><p>　?。ǜ兄x華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院郝選明教授在實驗研究中給予的指導(dǎo)與資助。） </p><p><b>　　參考文獻： </b&g

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