龍須菜高溫脅迫響應(yīng)的鈣調(diào)素信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究.pdf

1、龍須菜是一種重要的產(chǎn)瓊膠海藻，研究龍須菜的高溫脅迫分子響應(yīng)機(jī)理對(duì)于提高其高溫耐受性，延長(zhǎng)栽培期，提高產(chǎn)量具有重要意義。研究表明，鈣-鈣調(diào)素(Ca2+-CaM)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)在植物的高溫脅迫響應(yīng)中起重要作用。本論文擬在前期通過(guò)對(duì)龍須菜進(jìn)行高溫脅迫下的SSH差異顯示得到CaM的表達(dá)序列標(biāo)簽的基礎(chǔ)上，首次克隆龍須菜的CaM基因及篩查到的其結(jié)合蛋白--肌醇-1-磷酸合成酶(MIPS)的基因，并研究其在高溫脅迫下的表達(dá)模式，為探討龍須菜對(duì)高溫脅迫的

2、響應(yīng)機(jī)理打下基礎(chǔ)，并為龍須菜耐高溫品系的選育提供可用的基因信息。
　　 本論文首先分別從野生型和981龍須菜中克隆得到多種鈣調(diào)素(CaM)亞型基因。野生型龍須菜包含三種CaM亞型基因-cam1、cam2和cam3，981龍須菜包含兩種CaM亞型基因-cam1和cam2。其中，cam1在兩種龍須菜中完全一致，其cDNA序列長(zhǎng)度均為526bp，ORF長(zhǎng)450bp，可編碼150個(gè)氨基酸，其DNA序列長(zhǎng)度均為832bp，含有4個(gè)外顯子，

3、3個(gè)內(nèi)含子，cam1在兩種龍須菜的基因組中均為單拷貝。而cam2在兩種龍須菜中有所不同，其中野生型龍須菜cam2 cDNA全長(zhǎng)為600bp，ORF長(zhǎng)447bp，可編碼149個(gè)氨基酸，981龍須菜cam2cDNA全長(zhǎng)為474bp，ORF長(zhǎng)447bp，可編碼149個(gè)氨基酸，兩種cam2的DNA序列均無(wú)內(nèi)含子，基因相似性為78％，其所編碼的氨基酸序列的相似性為87％。cam3 DNA序列長(zhǎng)度為809bp，預(yù)測(cè)其具有2個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)外顯子，預(yù)測(cè)

4、的cDNA序列長(zhǎng)度為447bp，但目前該基因只能從野生型龍須菜基因組DNA中擴(kuò)增得到，無(wú)法從cDNA中擴(kuò)增得到，推測(cè)cam3可能在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中沉默。
　　 采用熒光定量PCR的方法測(cè)定在28℃和32℃的熱激條件下，981和野生型龍須菜不同CaM亞型的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在28℃還是32℃的熱激條件下，cam1在981龍須菜中的表達(dá)水平在整體上高于野生型龍須菜，表明981龍須菜的cam1在高溫脅迫下能更有效表達(dá)，以傳遞熱激信號(hào)，使得

5、981龍須菜對(duì)高溫的耐受能力更強(qiáng)。cam2在981龍須菜中的表達(dá)情況與cam1不完全一致，在28℃熱激時(shí)，cam2的整體表達(dá)水平低于cam1，但在32℃熱激條件下，兩者表達(dá)情況相似，推測(cè)在981龍須菜熱脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)過(guò)程中，CaM1可能為起主要作用的CaM亞型，而CaM2只有在981龍須菜處于溫度更高、熱激時(shí)間更長(zhǎng)等更為苛刻條件下時(shí)才會(huì)上調(diào)表達(dá)，對(duì)CaM1起到有效的補(bǔ)充和輔助作用。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生型龍須菜的cam2只有通過(guò)巢式PCR

6、反應(yīng)才能夠從其高溫脅迫表達(dá)的cDNA中擴(kuò)增出來(lái)，而不能通過(guò)一步PCR反應(yīng)直接擴(kuò)增到目的條帶，可能由于其在cDNA中的拷貝量較低，因此無(wú)法利用熒光定量PCR對(duì)其熱脅迫下的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。相比較而言，981龍須菜中可能有更多的CaM參與熱激信號(hào)傳導(dǎo)，這可能與981龍須菜耐高溫性更強(qiáng)直接相關(guān)。
　　 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道CaM自身并沒(méi)有活性，只有活化后進(jìn)一步與鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(CaMBP)的短肽序列結(jié)合，才能誘發(fā)其結(jié)構(gòu)變化，從而共同調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)

7、途徑，因此研究CaMBPs有助于探明鈣調(diào)素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩查獲得了龍須菜CaM結(jié)合蛋白--肌醇1-磷酸合成酶(myo-inosito1-1-phosphate synthase，MIPS)的EST，本論文在此基礎(chǔ)上擴(kuò)增得到mips的cDNA和DNA序列全長(zhǎng)，該序列在981龍須菜和野生型龍須菜中完全一致，且與其它物種mips具有較高同源性，其DNA序列全長(zhǎng)為2067bp，無(wú)內(nèi)含子，開(kāi)放閱讀框?yàn)?623b

8、p，可編碼540個(gè)氨基酸。對(duì)MIPS氨基酸序列分析，推測(cè)其CaMBD(CaM_Binding Domain)為第212位至236位氨基酸，符合大多數(shù)CaMBD所具有的結(jié)構(gòu)特征。將該MIPS與CaM進(jìn)行酵母雙雜交回復(fù)驗(yàn)證，證明MIPS與CaM存在相互作用，是龍須菜的一種鈣調(diào)素結(jié)合蛋白。通過(guò)Real-TimePCR對(duì)32℃熱激下981龍須菜和野生型龍須菜CaM與MIPS的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平均呈現(xiàn)周期性上升趨勢(shì)，但CaM與MIPS