2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題（含答案詳解+作文范文）_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、<p>　　材料：腦片、標(biāo)記好檢測(cè)好的探針</p><p>　　儀器：恒溫烤箱、搖床、切片雜交盒（20ml）、染缸、濕盒、水浴恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床</p><p><b>　　試劑配方：</b></p><p>　　DEPC水（1000ml，RNAse-free，121℃60min，4℃貯存）:</p><p>

2、;　　蒸餾水:1000ml /DEPC:1ml/攪拌過夜或者37℃2小時(shí)。</p><p>　　1 M Tris-HCl（pH7.5，500ml，RNAse-free，121℃30min，4℃貯存）:</p><p>　　Tris Base: 60.55g/DEPC水: 400ml/燒杯中攪拌/11.6N HCl (37%):35ml/調(diào)PH/DEPC水定容。</p><

3、;p>　　1 M Tris-HCl（pH8.0，500ml，RNAse-free，121℃30min，4℃貯存）:</p><p>　　Tris Base: 60.55g/DEPC水: 400ml/燒杯中攪拌/11.6N HCl (37%):21ml/調(diào)PH/DEPC水定容。</p><p>　　1 M Tris-HCl（pH9.5，500ml，RNAse-free，121℃30mi

4、n，4℃貯存）:</p><p>　　Tris Base: 60.55g/DEPC水: 400ml/燒杯中攪拌/11.6N HCl (37%):10ml/調(diào)PH/DEPC水定容。</p><p>　　10% SDS（1000ml，RNAse-free）:</p><p>　　SDS:100g/DEPC水900ml/燒杯中68℃攪拌助溶/ DEPC水定容。</p

5、><p>　　0.1M DP-PBS（1000ml，RNAse-free，121℃60min，4℃貯存）:</p><p>　　0.2M PB（PH:7.4）:500ml/蒸餾水:300ml/NaCl:8.5g/蒸餾水定容/DEPC:1ml/攪拌過夜。</p><p>　　20×SSC（pH4.5，1000ml，RNAse free，121℃30min，4℃貯

6、存）:</p><p>　　NaCl: 175.3g/檸檬酸鈉:88.2g/水:800ml/檸檬酸調(diào)PH:1水/無水檸檬酸約14.6/10g/水定容后，加入0.1%DEPC處理過夜，高壓滅菌。</p><p>　　2N HCl/DEPC水（100ml，10×，4℃貯存，臨用前用DEPC水稀釋）:</p><p>　　濃鹽酸（11.6N）:17.2ml/DE

7、PC水定容。</p><p>　　蛋白酶K（1ml，1000×，2mg/ml，-20℃貯存）:</p><p>　　蛋白酶K（Merck）:2mg/DEPC水:1ml。</p><p>　　10、0.1M TEA（100ml，新鮮配制或配制不含乙酸酐的溶液，臨用前加入，4℃貯存）: </p><p>　　DEPC水:90ml/1M三

8、乙醇胺:1.49ml/濃鹽酸:0.21ml/DEPC水定容/乙酸酐:0.25ml。</p><p>　　11、10×TBST（500ml，1×TBST臨用前用蒸餾水稀釋，4℃貯存）:</p><p>　　無菌水:300ml/1M Tris-HCl(pH7.5):125ml/NaCl:40g/KCl:0.1g/Tween-20:50ml/攪拌/定容。</p>

9、<p>　　12、Denhardt’s液（50ml，100×，RNAse free，-20℃貯存）:</p><p>　　聚蔗糖:1g/聚乙烯吡咯烷酮:1g/牛血清白蛋白:1g/DEPC水:500ml</p><p>　　13、雜交液（10ml，RNAse free，-20℃貯存）:</p><p>　　去離子甲酰胺:5ml/20XSSC:2.

10、5ml/加熱到50℃/硫酸葡聚糖:1g/50℃混合溶解/100×Denhardt’s液:500ul/10%SDS:500ul/10mg/ml變性過的鮭精DNA:100ul/DEPC水定容。</p><p>　　14、Solution X（200ml，4℃貯存）:</p><p>　　無菌水:50ml/20×SSC:20ml/甲酰胺:100ml/10% SDS:20ml/

11、攪拌加熱助溶/無菌水定容。</p><p>　　15、1.5%BBR（100ml，4℃貯存）:</p><p>　　滅菌水:60ml/1 M Tris-HCl（pH7.5）:10ml/NaCl:0.876g/胎牛血清:4ml/滅菌水定容。</p><p>　　16、4% PFA/DP-PBS（100ml，RNAse free，提前一天配制，4℃暫存）:</p&

12、gt;<p>　　多聚甲醛:4g/0.1M DP-PBS:80ml/70℃攪拌過夜/過濾/0.1M DP-PBS定容。</p><p>　　17、NTMT（150ml，4℃貯存）:</p><p>　　滅菌水:100ml/NaCl:0.8775g/1 M Tris-HCl（pH9.5）:15ml/MgCl2:1.525g/Tween-20:1.5ml/攪拌混勻/左旋咪唑:79

13、.2mg/滅菌水定容。</p><p>　　18、顯色液（1ml，現(xiàn)用現(xiàn)配，4℃避光暫存）:</p><p>　　NTMT:1ml/NBT（50mg/ml）:5ul/BCIP（50mg/ml）:3.75ul/吹打混勻。</p><p>　　19、anti-DIG（1ml，1:1000，現(xiàn)用現(xiàn)配）:</p><p>　　1.5%BBR:1ml/

14、 Anti-Digoxigenin-AP，F(xiàn)ab fragments（0.75U/ul，Roche）:1ul/吹打混勻。</p><p>　　剝離硅烷處理過RNAse-free的蓋玻片：</p><p>　　重鉻酸鉀-濃硫酸過夜，自來水沖洗，蒸餾水漂洗，180℃干烤4hr，過剝離硅烷（乙醇稀釋50%）。</p><p><b>　　步驟：</b>

15、;</p><p>　　第一天：（RNase-free）</p><p>　　檢查各溶液充裕、儀器空閑后開始實(shí)驗(yàn)。打開37℃水浴鍋，調(diào)好雜交箱溫度，預(yù)熱雜交液。</p><p>　　a、-70度中取出腦片50℃×15 min；（記錄編號(hào)）</p><p>　　b、4% PFA/DP-PBS×15 min，室溫靜置；<

16、/p><p>　　c、0.1M DP-PBS×5 min×3，室溫?fù)u動(dòng)；</p><p>　　d、0.2N HCl/DP-H2O×10 min，室溫靜置；</p><p>　　e、0.1M DP-PBS×5min×3，室溫?fù)u動(dòng)；（配制蛋白酶K，用DP-PBS將原液1000倍稀釋）</p><p>

17、　　f、蛋白酶K（2ug/ml）37℃×15 min，恒溫水浴靜置；</p><p>　　g、4% PFA/DP-PBS×15 min，室溫靜置；（不是PBS洗?。?lt;/p><p>　　h、0.1M DP-PBS×5 min×3，室溫?fù)u動(dòng)；</p><p>　　i、0.1M TEA×10 min，室溫?fù)u動(dòng)；</

18、p><p>　　j、0.1M DP-PBS×5 min×3，室溫?fù)u動(dòng)；</p><p>　　k、DEPC水×10 min，室溫?fù)u動(dòng)；（至此步共約需160分鐘）</p><p>　　l、預(yù)雜交×37-60℃×1 hr，80ul/片，蓋片蓋住，放入雜交箱內(nèi)預(yù)熱的濕盒中；（不要有氣泡）</p><p>

19、　　m、用預(yù)熱的雜交液稀釋探針（1:100-200），65℃×5min（PCR儀或水浴鍋中）；</p><p>　　n、雜交×37-60℃×12-16 hr，80ul/片，蓋片蓋住，放雜交箱內(nèi)的濕盒中；（不要有氣泡）</p><p>　　最好半個(gè)小時(shí)或一個(gè)小時(shí)后檢查片子平不平穩(wěn)，稍作調(diào)整。</p><p>　　第二天：（不必RNase-

20、free）</p><p>　　a、Solution X ×37-60℃×5min (加熱至所需溫度后再將去掉蓋片的片子放入)；</p><p>　　b、Solution X ×37-60℃×45min×3，空氣浴恒溫?fù)u床中搖動(dòng)（80-100rpm）；</p><p>　　c、1×TBST×15m

21、in×3，室溫?fù)u動(dòng)；</p><p>　　d、BBR×1hr，室溫靜置；</p><p>　　e、anti-DIG(1:1000)×2hr，80ul/片，放入濕盒中室溫靜置；</p><p>　　f、1×TBST×15min×3，室溫?fù)u動(dòng)；</p><p>　　g、NTMT×

22、;10min，室溫?fù)u動(dòng)；</p><p>　　h、顯色液室溫顯色12-48小時(shí)，每小時(shí)檢查顯色情況，如顯色液變成淺紫紅色，則需要換液，換液前需要用NTMT×15min×2，室溫?fù)u動(dòng)；</p><p>　　i、顯色充分的片子NTMT×15min×2；</p><p>　　j、蒸餾水×5min×2；</p

23、><p>　　k、4% PFA/DP-PBS×30min或過夜；</p><p>　　l、蒸餾水×5min×2；（若空氣中晾干則可以直接放入95%乙醇）</p><p>　　m、75%乙醇涮洗1min；</p><p>　　n、95%乙醇涮洗1min×2；</p><p>　　100

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