堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)不同日齡大鼠癲疒間持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)發(fā)生的影響

1、<p>　　堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)不同日齡大鼠癲疒間持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)發(fā)生的影響</p><p>　　作者：戴園園 袁寶強(qiáng) 魏海燕 </p><p>　　【摘要】 目的 了解不同年齡大鼠癲疒間持續(xù)狀態(tài)后外源性堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)對(duì)海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層神經(jīng)發(fā)生的影響。方法 建立14天大鼠和60天大鼠戊四氮(PTZ)誘導(dǎo)癲疒間持續(xù)狀態(tài)模型,生理鹽水（NS）注射作為對(duì)

2、照，皮下注射bFGF進(jìn)行干預(yù)，分4組：NS組、NS+ bFGF組 、PTZ組、PTZ+ bFGF組。采用Brdu標(biāo)記新生細(xì)胞，免疫組化方法檢測(cè)造模后大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生情況，造模后第7、14天2個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀(guān)察海馬齒狀回Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 造模后第7天和14天,PTZ組中各日齡組大鼠海馬齒狀回Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于各自對(duì)應(yīng)的NS組(P&lt;0.01),NS+bFGF組各日齡大鼠Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)亦高于NS組(P&

3、;lt;0.05), PTZ+bFGF組Brdu免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較PTZ組亦有升高(14天日齡組P&lt;0.05,60天日齡組P&lt;0.01)。60天大鼠較14天大鼠升高幅度更為明顯(P&lt;0.01)。結(jié)論 bFGF可增加癲疒間持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞發(fā)生,對(duì)60日齡大鼠比14日齡幼鼠更為明顯。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 癲疒間持續(xù)狀態(tài) 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 神

4、經(jīng)發(fā)生 齒狀回 </p><p>　　Abstract: Objective To study the neurogenesis of hippocampal dentate gyrus granular cell layer in different-age rats with induced status epilepticus and its response to ectogenic basic fi

5、broblast growth factor (bFGF). Methods Pentetrazole (PTZ) was used to form status epilepticus model on 14-day and 60-day old rats. The experiment was carried out in four groups, with the results analysed 7 days and 14

6、days after treatment. Brdu labeled new cells were counted to describe the neurogenesis in d</p><p>　　Key words: status epilepticus; basic fibroblast growth factor; neurogenesis; dentate gyrus </p>&l

7、t;p>　　癲疒間是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)疾患，發(fā)作后海馬齒狀回可發(fā)生多種可塑性變化，包括軸索重組、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、樹(shù)突重組和顆粒細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)等。神經(jīng)發(fā)生是指包括人在內(nèi)的大多數(shù)哺乳類(lèi)動(dòng)物均存在的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生新神經(jīng)元的過(guò)程。近年來(lái)，已有研究證實(shí)癲疒間發(fā)作后海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層的神經(jīng)發(fā)生增加［1－2］。海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層的神經(jīng)發(fā)生受到多種生長(zhǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的調(diào)控，其中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fi

8、broblast growth factor, bFGF)是較重要的一種。本試驗(yàn)即給予外源性bFGF皮下注射，探討bFGF是否促進(jìn)大鼠癲疒間發(fā)作后海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層神經(jīng)發(fā)生，并探討年齡因素對(duì)于癲疒間發(fā)作后這一可塑性變化有無(wú)影響。 </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 動(dòng)物及分組 生后14天和60天的SD大鼠 ，分別

9、隨機(jī)分為癲疒間持續(xù)狀態(tài)組（PTZ組）、 生理鹽水組（NS組）、 bFGF干預(yù)癲疒間持續(xù)狀態(tài)組（PTZ+ bFGF）和bFGF干預(yù)生理鹽水組（NS+ bFGF組）。 </p><p>　　1.2 模型的建立 PTZ組和PTZ+ bFGF組給予腹腔內(nèi)注射1％戊四氮(PTZ，Sigma公司) 80 mg/kg, 用雙蒸水稀釋成10 g/L,腹腔注射；NS組、NS+ bFGF組給予腹腔注射等體積生理鹽水。NS+ bF

10、GF組和PTZ+ bFGF組在注射戊四氮或生理鹽水前2 h皮下注射bFGF（Sigma公司）20 μg/kg （用生理鹽水稀釋成1 mg/L）。PTZ組和PTZ+bFGF組中除去無(wú)發(fā)作和死亡者，每組入組6只。 </p><p>　　參照Racine癲疒間發(fā)作分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［3］:0級(jí),無(wú)任何發(fā)作;1級(jí),口、面部抽搐;2級(jí),節(jié)律性點(diǎn)頭樣運(yùn)動(dòng);3級(jí),前肢陣攣;4級(jí),前肢陣攣伴后肢站立;5級(jí),反復(fù)的4級(jí)發(fā)作或抽搐致死。PTZ

11、組和PTZ+ bFGF組入組大鼠均達(dá)到3~5級(jí)發(fā)作，持續(xù)30 min以上，發(fā)作間期意識(shí)無(wú)清醒，呈癲疒間持續(xù)狀態(tài)。發(fā)作1 h以上者給予地西泮4 mg/kg腹腔注射中止發(fā)作。 </p><p>　　1.3 Brdu注射 Brdu（Sigma公司）溶于生理鹽水，濃度10 g/L。注射戊四氮或生理鹽水后第6、13天各組經(jīng)腹腔注射Brdu，劑量為50 mg/kg,每2 h 1次，共4次。 </p><

12、;p>　　1.4 組織切片制備 各組分別于注射Brdu后24 h腹腔注射10％水合氯醛（0.35 ml/kg）麻醉。生理鹽水快速灌注后，含4％多聚甲醛的PBS先快速灌注再緩慢灌注，直到大鼠肝臟變白、尾變硬,停止灌注。開(kāi)顱,取嗅腦至中腦之間的腦組織,放入4%多聚甲醛固定12 h以上,然后依次移入20%和30%蔗糖中4℃過(guò)夜至沉底。在海馬部位做冠狀冰凍切片,每隔2張取1張切片,每例標(biāo)本(雙側(cè)海馬結(jié)構(gòu))取切片不少于8張,進(jìn)行免疫組化

13、染色。 </p><p>　　1.5 Brdu免疫組化 應(yīng)用SP免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物公司）, 按以下步驟處理:腦片入新配制的0.1%H2O2溶液中室溫下孵育30 min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶; 入2 mol/L HCl溶液中，37℃ 浸泡60 min使DNA變性，再用0.1 mol/L硼酸緩沖液(pH 8.5)室溫下浸泡10 min用以中和鹽酸；然后以鼠抗尿嘧啶脫氧核苷單克隆抗體（1∶100，北京

14、中杉金橋生物公司）作為一抗， 采用SP法行Brdu免疫組織化學(xué)染色， 用DAB和H2O2 呈色， 自來(lái)水沖洗， 貼片、 脫水、 透明、 封片。 胞核棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。 </p><p>　　1.6 圖像分析 切片置于Olympus PM-CB顯微鏡下觀(guān)察,在高倍鏡下觀(guān)察整片大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層(GCL)、亞顆粒增生帶(SGZ,CL與門(mén)區(qū)之間約2個(gè)細(xì)胞體厚的1層)及門(mén)區(qū)的Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),每只大鼠隨機(jī)取5

15、~6個(gè)非連續(xù)腦片進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。 </p><p>　　1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)由SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，x±s表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）及t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。 </p><p><b>　　2 結(jié) 果 </b></p><p>　　2.1 行為學(xué)觀(guān)察 PTZ組、PTZ+bFGF

16、組：注射戊四氮后經(jīng)過(guò)1～4 min的潛伏期，大鼠由自由活動(dòng)狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)為安靜，眼神呆滯，出現(xiàn)咀嚼運(yùn)動(dòng)、流涎、扒地、搔抓動(dòng)作，雙后肢分開(kāi)站立，繼之進(jìn)入大發(fā)作期，出現(xiàn)前肢痙攣、狂奔，跳躍、嘶叫、頭偏向一側(cè)及全身陣發(fā)性抽動(dòng)；部分動(dòng)物表現(xiàn)為摔倒、翻滾等全身強(qiáng)直－陣攣性發(fā)作，同時(shí)伴有喉鳴、肢端青紫等。入組動(dòng)物發(fā)作均超過(guò)30 min，發(fā)作超過(guò)1 h者經(jīng)注射地西泮后逐漸緩解。發(fā)作停止后，動(dòng)物經(jīng)約1 h安靜狀態(tài)后活動(dòng)漸恢復(fù)。 </p>&l

17、t;p>　　NS組、NS+bFGF組：無(wú)任何發(fā)作跡象和抽搐表現(xiàn)，行為正常。 </p><p>　　2.2 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)海馬神經(jīng)發(fā)生的影響 造模后第7天和第14天，2個(gè)日齡組中NS+bFGF組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較各自NS組增多（P&lt;0.05），PTZ各組日齡的大鼠Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于各自的NS組（P&lt;0.05），同時(shí)PTZ+bFGF組較PTZ組亦明顯升高（P&

18、amp;lt;0.05）。 </p><p>　　造模后第7天，4組大鼠的大部分Brdu陽(yáng)性細(xì)胞分布于顆粒細(xì)胞下層(圖1A、C)；第14天，新生細(xì)胞在PTZ組和PTZ+bFGF組除分布于顆粒細(xì)胞層外，另有一部分遷移到門(mén)區(qū)和內(nèi)分子層（圖1B、D）。而在NS組和NS+bFGF組，Brdu陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于整個(gè)顆粒細(xì)胞層（圖1E）。 </p><p>　　新生細(xì)胞在由顆粒下層向顆粒細(xì)胞層遷移的

19、</p><p>　　過(guò)程中， 胞核變大， 形狀更接近圓形或卵圓形（圖1F）。 </p><p>　　圖1 大鼠海馬齒狀回Brdu免疫反應(yīng)產(chǎn)物(SP法) </p><p>　　A：PTZ組發(fā)作后7天，Brdu陽(yáng)性細(xì)胞大部分分布在顆粒細(xì)胞下層（×100）； B： PTZ組發(fā)作后14天, Brdu陽(yáng)性細(xì)胞除大部分布于顆粒細(xì)胞層外，還有部分分布在門(mén)區(qū)和內(nèi)分子層

20、（×100）；C：PTZ+ bFGF組處理后7天，Brdu陽(yáng)性細(xì)胞大部分分布在顆粒細(xì)胞下層（×100）；D：PTZ+ bFGF組處理后14天，Brdu陽(yáng)性細(xì)胞除大部分布于顆粒細(xì)胞層外，仍有部分分布在門(mén)區(qū)和內(nèi)分子層（×100）；E： NS+bFGF組處理后14天, Brdu陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于整個(gè)顆粒細(xì)胞層（×100）；F：Brdu陽(yáng)性細(xì)胞（×400）。表1 不同日齡大鼠各組齒狀回Brdu

21、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 </p><p><b>　　3 討 論 </b></p><p>　　1992年，Reynold和Weiss證明成年哺乳動(dòng)物的大腦內(nèi)存在有神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象［2］，主要部位在側(cè)腦室下區(qū)和海馬，海馬齒狀回下顆粒層增生帶的祖細(xì)胞可以在細(xì)胞層和門(mén)區(qū)的邊界增殖后遷移到顆粒細(xì)胞層并分化為成熟神經(jīng)元。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中, 化學(xué)致驚劑誘導(dǎo)的顳葉癲疒間或是癲疒間持續(xù)狀態(tài)所致

22、的齒狀回細(xì)胞增殖至少要經(jīng)過(guò)數(shù)天的潛伏期，而神經(jīng)元發(fā)生的高峰通常在癲疒間發(fā)作后1周左右［4］。我們前期的實(shí)驗(yàn)已證明幼鼠癲疒間持續(xù)狀態(tài)后海馬齒狀回細(xì)胞有顯著的神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象，這種神經(jīng)元生成增加提示在損傷部位可能有代償作用［5］。 </p><p>　　神經(jīng)細(xì)胞的增殖和新生神經(jīng)元的存活受到許多因素的影響,包括年齡、激素水平及多種生長(zhǎng)因子等。其中bFGF對(duì)于腦損傷后的修復(fù)作用正受到越多學(xué)者的關(guān)注。 bFGF長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)

23、為是一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有效的有絲分裂原，能改善神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程， bFGF可以改善海馬結(jié)構(gòu)、腦皮質(zhì)、小腦的顆粒層神經(jīng)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。在正常狀態(tài)下,海馬有一定的bFGF基礎(chǔ)表達(dá)，癲疒間發(fā)作后腦內(nèi)海馬區(qū)bFGF表達(dá)顯著增加［6］，提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷局部環(huán)境存在自我修復(fù)，但這種因素短暫而不穩(wěn)定。體內(nèi)bFGF含量極微，病理情況下，內(nèi)源性bFGF作用有限，外源性bFGF可以及時(shí)補(bǔ)充內(nèi)源性bFGF的不足，早期應(yīng)用可限制神經(jīng)元損害的擴(kuò)大。體內(nèi)外實(shí)

24、驗(yàn)證明，bFGF可以通過(guò)血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)［7］,并且 bFGF在生物進(jìn)化上有很強(qiáng)的保守性，人和牛bFGF氨基酸順序同源性達(dá)98.7％，這為臨床利用外源性bFGF進(jìn)行替代補(bǔ)充治療提供了基本依據(jù)。 </p><p>　　有實(shí)驗(yàn)顯示，在胎兒海馬C3區(qū)移植物進(jìn)行移植替代癲疒間持續(xù)狀態(tài)后丟失的神經(jīng)元時(shí)，經(jīng)過(guò)bFGF預(yù)處理的細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng)，且和成年海馬顯示出較好的整合作用并減輕了異常的苔蘚纖維發(fā)芽［8］ 。Zucchi

25、ni等［9］應(yīng)用紅藻氨酸點(diǎn)燃模型發(fā)現(xiàn)小鼠癲疒間發(fā)作后bFGF mRNA和蛋白的水平在某些腦區(qū)升高，給予側(cè)腦室注射低劑量bFGF可以減輕海馬的損傷,促進(jìn)行為的恢復(fù)。 </p><p>　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠年齡的選擇基于人腦和大鼠腦發(fā)育程度的對(duì)應(yīng)關(guān)系。普遍認(rèn)為:14天大鼠的腦發(fā)育程度與1歲兒童相當(dāng),而生后60天鼠腦的發(fā)育基本成熟。 雖然齒狀回的神經(jīng)干細(xì)胞具有終身分化的能力，但隨著年齡的增加，細(xì)胞的增殖能力減弱。本實(shí)驗(yàn)亦顯

26、示，NS組中14天幼鼠海馬的神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象較60天大鼠顯著，bFGF對(duì)14天幼鼠和60天成年大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層的神經(jīng)發(fā)生均有促進(jìn)作用，但對(duì)60天大鼠促進(jìn)作用更明顯。在癲疒間發(fā)作大鼠組中， bFGF干預(yù)后1周后，14天大鼠的海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生較PTZ組增加了7％，而60天大鼠則增加了20％。這一結(jié)果顯示成熟大腦對(duì)于bFGF的促神經(jīng)發(fā)生作用有著更高的敏感性。Jin等［10］ 的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予注射bFGF后，20個(gè)月的小鼠SGZ區(qū)Brdu

27、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加了250％，說(shuō)明年老的大腦對(duì)外源性bFGF仍有著非常敏感的反應(yīng)。據(jù)研究，大鼠出生2周內(nèi)腦內(nèi)bFGF較低，僅為成鼠的20％［11］，故而推測(cè)14天幼鼠腦內(nèi)bFGF受體亦未發(fā)育完全或受體數(shù)量相對(duì)較少而造成這種差異。具體機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。 </p><p>　　bFGF 促進(jìn)大鼠海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生機(jī)制尚不十分明確,可能和以下有關(guān):bFGF 誘導(dǎo)及促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞細(xì)胞核有絲分裂［12］,調(diào)節(jié)神經(jīng)元前體細(xì)

28、胞端粒酶活性［13］,調(diào)控鈣調(diào)蛋白基因、血小板凝血酶敏感蛋白1 基因、特異性成骨細(xì)胞因子2 基因和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的核蛋白的表達(dá)［14］。 </p><p>　　癲疒間發(fā)作后存在神經(jīng)細(xì)胞丟失，嚴(yán)重癲疒間發(fā)作后腦部的病理?yè)p害可累及多個(gè)腦區(qū)，其中海馬區(qū)的細(xì)胞減少密度最為明顯，損傷區(qū)周?chē)男切文z質(zhì)細(xì)胞被激活，能夠產(chǎn)生包括bFGF在內(nèi)的各種細(xì)胞生長(zhǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，有利于神經(jīng)元的生存和軸突再生，但保護(hù)作用是有限的。當(dāng)腦損傷

29、較重，或損傷時(shí)間長(zhǎng)，保護(hù)作用則相對(duì)較弱。我們的實(shí)驗(yàn)采用了癲疒間持續(xù)狀態(tài)模型，雖然癲疒間大鼠發(fā)作后神經(jīng)元增殖增加，但仍遜于bFGF干預(yù)的癲疒間大鼠，這就提示內(nèi)源性bFGF等因素所致的增殖代償能力是有限的。外源性加入bFGF改變細(xì)胞再生環(huán)境，調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞至一個(gè)恰當(dāng)?shù)臓顟B(tài)，創(chuàng)造出一個(gè)有利于神經(jīng)功能恢復(fù)的微環(huán)境。 </p><p>　　嚴(yán)重的癲疒間發(fā)作會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，尤其在兒童，而神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象和空間的學(xué)習(xí)、記憶能

30、力有密切關(guān)系。bFGF在腦損傷后是一種極其重要的調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)發(fā)生的因子。在腦損傷后給予外源性生長(zhǎng)因子可以提供一個(gè)治療方面的策略。 </p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　　［1］ Parent JM. Injury-induced neurogenesis in the adult mammalian brain［Ｊ］. Neurosc

31、ientist，2003，9(4):261-２72. </p><p>　?。?］ Reynolds BA, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolate cells of the adult mammalian central nervous system［J］.Science,1992,255(5052):1707-1710. </

32、p><p>　　［3］ Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation: cortical areas［J］. Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 1975,38(1):1-12. </p><p>　?。?］ Jiang W, Wan Q, Zhang ZJ,

33、et al. Dentate granule cell neurogenesis after seizures induced by pentylenetrazol in rats［Ｊ］. Brain Res，2003, 977(2):141-148. </p><p>　　［5］ 陳 靜, 袁寶強(qiáng). 戊四氮誘導(dǎo)發(fā)育鼠癲疒間持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)發(fā)生及MK-801的影響［J］. 中國(guó)當(dāng)代兒科雜志, 2006,8(5)

34、:421-424. </p><p>　?。?］ 張廣慧, 張龍軒, 朱遂強(qiáng),等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在癲疒間大鼠海馬中的表達(dá)［J］. 中國(guó)康復(fù),2005,20(5):267-269. </p><p>　　［7］ Wagner JP, Black IB, DiCicco-Bloom E. Stimulation of neonatal and adult brain neurogene

35、sis by subcutaneous injection of basic fibroblast growth factor ［Ｊ］. J Neurosci, 1999, 19(14):6006-6016. </p><p>　?。?］ Rao MS, Hattiangady B, Shetty AK. Fetal hippocampal CA3 cell grafts enriched with FGF-2

36、and BDNF exhibit robust long-term survival and integration and suppress aberrant mossy fiber sprouting in the injured middle-aged hippocampus ［J ］. Neurobiol Dis, 2006,21(2):276-290. </p><p>　?。?］ Zucchini S

37、, Barbieri M, Simonato M. Alterations in seizure susceptibility and in seizure-induced plasticity after pharmacologic and genetic manipulation of the fibroblast growth factor-2 system［J］. Epilepsia, 2005,46(Suppl 5):52-5

38、8. </p><p>　?。?0］ Jin K, Sun Y, Xie L, et al. Neurogenesis and aging: FGF-2 and HB-EGF restore neurogenesis in hippocampus and subventricular zone of aged mice［J］. Aging Cell, 2003,2(3):175-183. </p>

39、<p>　　［11］ Julliard A, Hartmann D. Spatiotemporal patterns of expression of extracellular matrix molecules in the development and adult rat olfactory system［J］. Neuroscience,1998,84(4):1135-1150. </p><p&g

40、t;　?。?2］ Ortega S, Ittmann M, Tsang SH, et al. Neuroral defects and delayed wound healing in mice lacking fibroblast growth factor 2［J］. Proc Nail Acad Sci USA,1998, 95(10):5672-5677. </p><p>　　［13］ Miyasaka

41、 N, Matsuoka I. Identidication of basic fibroblast growth factor-responsive genes by mRNA-differential display in an immortalizd neural stem cell line ［J ］ . Biol Pharm Bull, 2000,23(3):349 - 351. </p><p>