蘇云金芽孢桿菌噬菌體MZTP02c基因組文庫(kù)的構(gòu)建及保藏研究.pdf

1、本文通過(guò)用絲裂霉素C(MMC)誘導(dǎo)蘇云金芽孢桿菌溶原性生產(chǎn)菌株MZ1-H3ab，從裂解液中分離到一株基因組大小約為40 kb的溫和噬菌體MZTP02末端突變株MZTP02c。運(yùn)用構(gòu)建酶切片段質(zhì)粒文庫(kù)和PCR的方法，構(gòu)建了一個(gè)覆蓋該突變體基因組95％以上遺傳信息的DNA文庫(kù)，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)噬菌體MZTP02c的滴度(titer)下降十分迅速，因此同時(shí)研究了不同溫度下MZTP02c混合甘油、DMSO、氯仿等穩(wěn)定劑

2、時(shí)活力保持情況。 通過(guò)9輪空斑純化MMC誘導(dǎo)MZ1-H3ab釋放的噬菌體，得到一株生物學(xué)性狀一致的噬菌體。由子MZ1-H3ab可能含有2株噬菌體，MZTP01和MZTP02.因此分別用MZTP02和MZTP01的特異基因tmp、mur、pep和ogr進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示特異擴(kuò)增條帶序列和tmp、mur完全一致，因此推測(cè)所得到的噬菌體可能來(lái)源于MZTP02，并命名為MZTP02c。SDS—PAGE分析MZTP02c結(jié)構(gòu)蛋白組成

3、，結(jié)果顯示只有4個(gè)條帶與MZTP02一致。MZTP02c結(jié)構(gòu)蛋白組成大致為：34 kDa和37 kDa兩條主帶，24 kDa、26 kDa和28 kDa三條次主帶，49 kDa、55kDa、70 kDa和85 kDa四條次帶。繼而進(jìn)行的基因組DNA酶切圖譜分析也顯示出MZTP02c在基因組大小和DNA序列上與MZTP02有極大的差異。 將基因組酶切片段克隆到載體上，構(gòu)建了含有14個(gè)酶切片段的質(zhì)粒文庫(kù)。運(yùn)用DNASATR和DNAM

4、AN生物軟件拼接后，得到了26 kb、SphI/BamHI—4 kb、XbaI—3 kb和BamHI/EcoRI-1.5 kb四個(gè)獨(dú)立的片段，總計(jì)約35 kb。運(yùn)用DNASTAR MEGLINE軟件進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)MZTP02c和MZTP02 DNA序列的42 bp～15313 bp完全相同，但是MZTP02c在5’端和3’端繼續(xù)向2個(gè)方向延伸了大約20 kb。 再通過(guò)在四個(gè)獨(dú)立片段兩端設(shè)計(jì)引物，兩兩之間進(jìn)行PCR擴(kuò)增連接。最后文

5、庫(kù)序列拼接得到MZTP02c30，054 bp主體片段，1586 bp和3342 bp2個(gè)未拼接的酶切片段以及2485 bp、899 bp和725 bp三個(gè)單端特異PCR擴(kuò)增片段。一共涵蓋MZTP02c DNA信息38.782 kb。 生物信息學(xué)分析顯示，MZTP02c基因組文庫(kù)DNA序列GC含量為36.31％．BLASTN同源序列聯(lián)配比較表明，MZTP02c和三個(gè)蠟狀芽孢桿菌B．cereus G9842(27％)，B．cere

6、us B4264(27％)以及B．cereusATCC14579(19％)基因組同源性最大。而較噬菌體基因組而言，Bacillus phage IEBH(4％)和Bacillus anthracis pbage Gamma isolate53(3％)是與MZTP02c同源性相對(duì)高的2個(gè)噬菌體。 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)文庫(kù)DNA序列包含53個(gè)ORFs，7個(gè)啟動(dòng)子，向正反兩個(gè)方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，其中17個(gè)ORFs含有蛋白保守區(qū)域。MZTP

7、02c基因組結(jié)構(gòu)可分為五個(gè)功能模塊，從5’到3’依次為：DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄控制、DNA包裝、噬菌體粒子裝配和細(xì)胞裂解?？赡芘c噬菌體溶原性相關(guān)的蛋白主要有，DNA復(fù)制終止蛋白、DNA修復(fù)ATPase、dUTPase、RNA聚合酶組分以及DNA聚合酶DnaD組分等。 為了研究MZTP02c的最佳保藏方法，把從平板上收集的噬菌體懸液進(jìn)行簡(jiǎn)單的離心分離純化，再加入25％甘油、7％DMSO或1％氯仿作為保藏穩(wěn)定劑，在4℃、—20℃和—80℃