一株加納木霉菌的分離鑒定研究【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）</p><p>　　論文題目：一株加納木霉菌的分離鑒定研究</p><p>　　所在學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 </p><p>　　專(zhuān)業(yè)班級(jí) 生物技術(shù) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p&g

2、t;<p>　　指導(dǎo)教師 職稱(chēng) </p><p>　　完成日期 年 月 日</p><p>　　畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）誠(chéng)信承諾書(shū)</p><p>　　1．本人承諾所上交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)），是在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下嚴(yán)格按照學(xué)校和學(xué)院有關(guān)規(guī)定完成的，引用他人的觀點(diǎn)和參考資料均加以注

3、釋和說(shuō)明。</p><p>　　2．本人鄭重地承諾所上交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）沒(méi)有抄襲他人研究（設(shè)計(jì)）成果和偽造相關(guān)數(shù)據(jù)等行為。</p><p>　　3．畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）若有侵犯他人知識(shí)產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。</p><p>　　學(xué)生簽名： __________</p><p>　　日 期： __________</p

4、><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　本文從土壤中分離得到一株真菌，并且實(shí)驗(yàn)室對(duì)該菌株的產(chǎn)麥角固醇特性進(jìn)行了研究。為了更好的利用該菌株，我們利用形態(tài)學(xué)觀察法和分子生物學(xué)手段對(duì)該菌株進(jìn)行了種屬鑒定。從形態(tài)學(xué)觀察初步確定為木霉屬真菌，利用PCR方法擴(kuò)增與測(cè)序分析了該菌株的rDNA-ITS序列，并與GENBANK中的已有序列進(jìn)行了BLAST比對(duì)分析，獲得了

5、相似序列，然后運(yùn)用clustalx軟件對(duì)所獲得的序列進(jìn)行比對(duì)以及利用Mega4軟件的N-J法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。其結(jié)果顯示我們所分離得到的未知菌株與菌株Trichoderma ghanense基因登錄號(hào)JF904869處在同一分枝，他們的相似度達(dá)到99%，可確定我們分離的菌株為菌株Trichoderma ghanense，即加納木霉。本文為該菌株的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：真菌；分離；

6、形態(tài)學(xué)；分子生物學(xué)；鑒定；木霉</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　This article from the soil have been isolated a plant and the fungi lab in this strains in the research on the ergosterol. In order

7、to make better use of the fungus, we use morphological observation and molecular biology of the strains on the means of genus identification. From the morphological observation preliminary determined for trichoderma viri

8、de of fungi, using the polymerase chain reaction (PCR) amplification and analysis on the sequencing strains rDNA-ITS sequence, and with the existing</p><p>　　Key words: Fungi; Separation; Morphology; Molecul

9、ar biology; Appraisal; Trichoderma viride目 錄</p><p><b>　　1 前言2</b></p><p>　　1.1 木霉概述2</p><p>　　1.2 木霉的分類(lèi)2</p><p>　　1.3 木霉的鑒定方法研究2</p><p>　

10、　1.4 木霉的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景3</p><p>　　1.5 本文研究?jī)?nèi)容及意義4</p><p><b>　　2 材料和方法4</b></p><p><b>　　2.1材料4</b></p><p>　　2.1.1 菌種采集來(lái)源4</p><p>　　2.1.2

11、實(shí)驗(yàn)試劑4</p><p>　　2.1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備5</p><p><b>　　2.2實(shí)驗(yàn)方法6</b></p><p>　　2.2.1 培養(yǎng)基制備6</p><p>　　2.2.2 菌種的分離與純化6</p><p>　　2.2.3 菌種的形態(tài)學(xué)鑒定6</p><

12、;p>　　2.2.4 菌種總DNA基因組提取7</p><p>　　2.2.5 DNA 純度檢測(cè)7</p><p>　　2.2.6 DNA瓊脂糖平板電泳7</p><p>　　2.2.7 基因組PCR擴(kuò)增檢測(cè)8</p><p>　　2.2.8 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序及分析8</p><p><b&g

13、t;　　3 結(jié)果與分析8</b></p><p>　　3.1 液體培養(yǎng)生長(zhǎng)情況8</p><p>　　3.2 固體培養(yǎng)生長(zhǎng)情況10</p><p>　　3.3顯微觀察及結(jié)果10</p><p>　　3.4 樣品基因組純度檢測(cè)結(jié)果11</p><p>　　3.5 樣品基因組電泳檢測(cè)結(jié)果11<

14、/p><p>　　3.6 ITS 序列 PCR 擴(kuò)增結(jié)果12</p><p>　　3.7 rDNA—ITS序列測(cè)序分析12</p><p>　　3.8 rDNA-ITS序列比對(duì)與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建13</p><p>　　4 結(jié)論與展望15</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)16</b></

15、p><p><b>　　致 謝17</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p><b>　　1.1 木霉概述</b></p><p>　　木霉屬于半知菌亞門(mén)，絲孢綱、絲孢目，叢梗孢科、粘孢菌類(lèi)，在自然界的分布十分廣泛。木霉是一類(lèi)普遍存在的絲狀真菌, 廣

16、泛存在于土壤、腐爛的木材及植物殘?bào)w等基質(zhì)中, 是土壤微生物的重要組成群落之一,也是一種植物內(nèi)生真菌,在海洋中也有發(fā)現(xiàn)[1] 。</p><p><b>　　1.2 木霉的分類(lèi)</b></p><p>　　木霉的研究最早可追溯到200多年前，Persoon依據(jù)菌種具有不同的分生孢子顏色，于1794年建立了木霉屬(Trichoderma Pers.)。1871年，Harz

17、提出了第一個(gè)精確木霉屬的定界，即微觀特征,特別是瓶梗(phialide )在木霉屬定界上的重要性[2,3]。</p><p>　　1926年，Abbott根據(jù)木霉菌瓶梗的著生方式，孢子的大小、形態(tài)及不同培養(yǎng)基上菌落外觀特征的差異等列成檢索表，將他從土壤中分離到的7個(gè)木霉菌株分為3個(gè)種，即白色木霉(T.album)、綠色木霉(T.viride)、康氏木霉(T.koningii)。</p><p&

18、gt;　　1969年，Rifai和Webste依據(jù)分生孢子梗、孢子形態(tài)，首次提出了木霉屬的分類(lèi)系統(tǒng)，他們將木霉屬分為9個(gè)集合種(species aggregates)，即綠色木霉(T.viride)、康氏木霉(T.koningii)、黃綠木霉(T.aureovirid)、哈茨木霉(T.harzianum)、長(zhǎng)枝木霉(T.longibraehiarum)、擬康氏木霉(T.pseudokoningii)、鉤狀木霉(T.hamatum)、多孢

19、木霉(T.polysporum)和小球木霉(T.piluliferm) [4]。</p><p>　　Bissett(1984， 1991) 在前人的研究工作的基礎(chǔ)上提出了一個(gè)新的分類(lèi)系統(tǒng)，根據(jù)木霉菌產(chǎn)孢區(qū)的形狀、分生孢子梗的分枝方式及大小、瓶梗的著生方式、形狀及數(shù)量等特征提出了一個(gè)新的分類(lèi)系統(tǒng)，引進(jìn)了組(section)的概念，將木霉屬分成了5個(gè)組:長(zhǎng)枝組(Longibrachiatuln)、土星孢組(Satu

20、misporum)、木霉組(Triehoderma)、厚基組(pachybasium)和肉座組(Hypoereaum)。Gams和Bissett (1999)接受了4個(gè)組,取消了土星孢組[3,4]。</p><p>　　1.3 木霉的鑒定方法研究</p><p>　　根據(jù)木霉分類(lèi)研究歷史得出木霉的形態(tài)學(xué)鑒定主要是觀察培養(yǎng)基上菌落外觀特征和顯微鏡下分生孢子梗的分枝方式及大小，瓶梗的著生方式、

21、形狀、數(shù)量及大小，孢子的形狀及大小，從而根據(jù)特征進(jìn)行分類(lèi)鑒定。但木霉種類(lèi)繁多，僅依靠形態(tài)學(xué)特征，容易對(duì)那些生長(zhǎng)條件特殊、形態(tài)相似的菌株產(chǎn)生混淆，所以存在一定的缺陷。</p><p>　　從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，由于形態(tài)學(xué)觀察的局限性，國(guó)際上對(duì)木霉分類(lèi)的研究逐步進(jìn)入分子水平?，F(xiàn)代分子生物學(xué)方法的介入為木霉的鑒定及分類(lèi)學(xué)研究開(kāi)辟了一條新的途徑。人們?cè)诜肿予b定方面進(jìn)行了許多嘗試，大大提高了鑒定效率及分類(lèi)的準(zhǔn)確性。<

22、;/p><p>　　現(xiàn)代分子生物學(xué)鑒定木霉有多種方法，本文主要涉及一種，即通過(guò)PCR擴(kuò)增與測(cè)序的方法對(duì)菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行分析，所以對(duì)此進(jìn)行著重介紹。真核生物基因組中編碼核糖體的基因包括28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA 4種，它們?cè)谌旧w上頭尾相連、串聯(lián)排列，相互之間由間隔區(qū)分隔。其中18S、5.8S和28S rDNA基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元(如圖1所示)，三者高度保守，適

23、合于較高等級(jí)水平的生物群體間的系統(tǒng)分析，其間的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer,ITS)，包括ITS1及1TS2兩部分，由于進(jìn)化相對(duì)迅速而具多態(tài)性，因而適合于等級(jí)水平較低的系統(tǒng)學(xué)研究[5]。</p><p>　　圖1 真菌rDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)</p><p>　　表1 真菌rDNA-ITS通用擴(kuò)增引物</p><p>　　IT

24、S的引物選擇與擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)間有關(guān)(如上表1所示)，單獨(dú)分析ITSl區(qū)、ITS2區(qū)序列可以研究親緣關(guān)系較近的屬種或群組之間小范圍、低水平的序列變化；若需要相對(duì)足夠的序列信息用于未知菌種的系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)研究或鑒定未知菌種的屬種，可對(duì)于整個(gè)ITS區(qū)設(shè)計(jì)引物，由于真菌全長(zhǎng)ITS區(qū)序列(如圖1所示)包含了其兩端的18S rDNA、28S rDNA的部分序列和中間的ITSl區(qū)、5.8S rDNA、ITS2區(qū)的完整序列(長(zhǎng)度300～1000bp，真菌通常

25、600bp左右)擁有相對(duì)豐富的信息，因而全長(zhǎng)序列的ITS分析在木霉分子生物學(xué)鑒定中比較常用[5]。</p><p>　　1.4 木霉的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景</p><p>　　木霉對(duì)環(huán)境適應(yīng)性極強(qiáng)，具有殺菌和抑菌作用，所以它是一種理想的、難得的生物防治菌種資源，并具有重大應(yīng)用前景。由于其在農(nóng)業(yè)上的生物防治作用和通過(guò)發(fā)酵所產(chǎn)生的纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、幾丁質(zhì)酶及蛋白酶等,被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)病

26、蟲(chóng)害防治、食品、衛(wèi)生、飼料、制漿、紡織、造紙、生物基因工程和環(huán)保等領(lǐng)域，從而受到了廣泛的研究和關(guān)注。</p><p>　　木霉在科學(xué)研究上也有重要價(jià)值，對(duì)于木霉菌生活史的研究,有助于查清子囊菌和半知菌之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。木霉菌還能通過(guò)與植物形成共生關(guān)系，來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，誘導(dǎo)并激發(fā)植物自身免疫功能。此外,木霉菌個(gè)別種也可導(dǎo)致蘑菇生產(chǎn)污染，造成減產(chǎn)，也會(huì)引起動(dòng)物，包括人類(lèi)的免疫障礙疾病的機(jī)遇性病原菌，但由于其在酶、抗

27、生素及生防等方面有著重要的經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)價(jià)值而得到世界廣泛的研究和關(guān)注，所以合理準(zhǔn)確對(duì)木霉菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定有利于分析引起該種不利因素的原因，從而找到解決的方法[1,6,7]。</p><p>　　1.5 本文研究?jī)?nèi)容及意義</p><p>　　木霉菌形態(tài)多樣，種類(lèi)繁多，功能各異，對(duì)木霉進(jìn)行分類(lèi)鑒定能夠便于更好的開(kāi)發(fā)利用木霉資源，在農(nóng)業(yè)上和環(huán)境上具有重大應(yīng)用前景，所以合理準(zhǔn)確對(duì)木霉菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定對(duì)于

28、木霉菌的研究和利用有著重要的意義。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)從采集的土壤中分離純化得到菌種，并通過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng)篩選出一株高產(chǎn)麥角固醇的菌株，從而采用形態(tài)學(xué)鑒定方法和分子生物學(xué)鑒定方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，了解它的種屬關(guān)系，從而能夠更好的利用其產(chǎn)麥角固醇的特性，為工業(yè)化生產(chǎn)麥角固醇的工藝奠定基礎(chǔ)。</p><p><b>　　2 材料和方法</b></p>&l

29、t;p><b>　　2.1材料</b></p><p>　　2.1.1 菌種采集來(lái)源</p><p>　　實(shí)驗(yàn)選取樹(shù)林土壤，晾干后分離純化并篩選得到菌種。</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑</p><p>　　表2 實(shí)驗(yàn)主要試劑一覽表</p><p><b>　　續(xù)表2&

30、lt;/b></p><p><b>　　2.1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備</b></p><p>　　表3 實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備一覽表</p><p><b>　　續(xù)表3</b></p><p><b>　　2.2實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 培

31、養(yǎng)基制備</p><p>　　固體培養(yǎng)基：采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)為分離和純化培養(yǎng)基。稱(chēng)取PDA 21.5g，加入蒸餾水500mL，攪拌加熱煮沸至完全溶解，移至500mL錐形瓶后于121℃高壓滅菌30min，待冷卻至50-60℃后于無(wú)菌室分裝至培養(yǎng)皿，待用。</p><p>　　液體培養(yǎng)基：葡萄糖4%、酵母浸膏0.5%、硫酸鎂0.05%、氯化鉀0.05%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸亞

32、鐵0.0001%。制取液體培養(yǎng)基500mL，分裝于5個(gè)培養(yǎng)瓶，121℃高壓滅菌30min，冷卻待用。</p><p>　　2.2.2 菌種的分離與純化</p><p>　　把采集的土樣自然晾干后輾碎，用細(xì)篩篩過(guò)后稱(chēng)取1g土樣置于盛有9mL無(wú)菌水的試管中，用渦旋儀充分振蕩，吸取1mL懸浮液加入9mL的無(wú)菌水中稀釋?zhuān)購(gòu)南♂尩膽腋∫褐形?mL加入9mL的無(wú)菌水中稀釋?zhuān)绱祟?lèi)推，稀釋至10-3

33、，10-4，10-5，用微量移液槍從各濃度的土壤懸浮液中取出 0.1mL的懸浮液分散滴于PDA培養(yǎng)基平板上，再用滅菌后的三角玻璃棒涂勻，靜置20min放入28℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)至菌落形成[4]。</p><p>　　挑取單一菌落，采用平板劃線法接種于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時(shí)間后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異以及長(zhǎng)出時(shí)間的不同，挑取單菌落接種于新的PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)數(shù)

34、日后，再挑取其邊緣的菌絲培養(yǎng)，如此反復(fù)純化，得到純化的菌株。實(shí)驗(yàn)室通過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng)，從中篩選出一株高產(chǎn)麥角固醇的菌株，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此菌株進(jìn)行種屬鑒定，從而確定該種菌株。</p><p>　　2.2.3 菌種的形態(tài)學(xué)鑒定</p><p>　　用接種環(huán)挑取純化后的菌絲接種于液體培養(yǎng)基中，于恒溫振蕩(空氣)培養(yǎng)箱中28℃、120r/min振蕩培養(yǎng)4～5天。每天觀察記錄菌絲體的生長(zhǎng)情況和液體培養(yǎng)基的顏

35、色。</p><p>　　將分離純化后的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，逐日觀察菌落生長(zhǎng)速度，形狀、大小顏色等培養(yǎng)性狀。待產(chǎn)孢后挑取不同部位的菌絲體直接制成切片，在顯微鏡下觀察分生孢子梗分枝情況、延長(zhǎng)枝有無(wú)、瓶梗形狀、著生方式、大小及分生孢子形態(tài)、大小及顏色等。</p><p>　　2.2.4 菌種總DNA基因組提取</p><p>　　采用

36、上述液體培養(yǎng)的菌株，用真空抽濾法分離菌絲與培養(yǎng)基。菌絲體收集后，依次用無(wú)菌生理鹽水、20mmol/L EDTA、生理鹽水各洗滌一次，然后置于無(wú)菌濾紙上，于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中風(fēng)干得到干凈的菌絲體，于-20℃冰箱冷藏備用。</p><p>　　DNA基因組參照李曉倩[11]改良SDS法提取。實(shí)驗(yàn)將-20℃冷凍的菌絲0.3 g加入固體形式的PVP(占菌絲量的2%)迅速研磨成粉末，后及時(shí)轉(zhuǎn)入2mL 的離心管中，加入2m

37、L SDS提取緩沖液輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，并加入 0.5mL 20% SDS( pH7.2)，混勻，65℃水浴保溫45 min，間或輕搖混勻。加入 1mL 5mol/L KAC，混勻后冰浴 30min，10000r/min、4℃ 離心10min。取上清，加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)，混勻，10000r/min、4℃離心 10min；離心后取水相，準(zhǔn)確加入0.6 倍體積的預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻，于-20℃冰箱放2h，12000

38、r/min、4℃離心10 min，取沉淀用70%乙醇洗滌，同法離心，風(fēng)干后溶于少量無(wú)菌雙蒸水中，再加入30μL RNase(10mg/mL)，37℃溫育1h，去RNA。異丙醇沉淀 DNA，70%乙醇洗滌，略風(fēng)干，溶于TE中，并在-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　2.2.5 DNA 純度檢測(cè)</p><p>　　樣品基因組純度檢測(cè)參考張穎慧等[12]DNA 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)

39、取5μL DNA樣品液，加入995μL的ddH2O 后充分混勻，裝在1.5mL的離心管中待測(cè)。以ddH2O為對(duì)照管，分別讀出260nm和280nm的光密度值，根據(jù)OD260/OD280的值比較所提取的總 DNA 的純度。</p><p>　　2.2.6 DNA瓊脂糖平板電泳</p><p>　　2.2.6.1試劑準(zhǔn)備</p><p>　　TBE緩沖液：稱(chēng)取10.78

40、g Tris，5.50g 硼酸，0.93g EDTA溶于去離子水，定容至1000mL，備用 。</p><p>　　1%瓊脂糖凝膠：稱(chēng)取0.5g瓊脂糖溶于50 mL TBE緩沖液中，混勻后加熱煮沸至瓊脂糖完全溶解，稍微冷卻后將膠液倒入到備好的膠槽中，等待至凝膠完全凝固。</p><p>　　2.2.6.2 樣品基因組電泳</p><p>　　將凝固后的瓊脂糖凝膠拔去

41、電泳齒，放入電泳槽中，點(diǎn)樣孔朝電泳槽陰極，加入配置好的TBE緩沖液，直至完全沒(méi)過(guò)膠面。將提取的DNA樣品(5μL)與10 × Loading Buffer (1μL)用微量移液槍混合點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠，另加5μL DL 2000 DNA Marker作為片段長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。在100v下電泳60min，取出凝膠，在0.05%濃度的溴化乙錠中染色15min, 在凝膠成像儀上觀察 DNA 分子的大小、完整性及電泳條帶的清晰度，并進(jìn)行

42、拍照[13]。</p><p>　　2.2.7 基因組PCR擴(kuò)增檢測(cè)</p><p>　　以提取的基因組DNA為模板，選取通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ITS1 和ITS4的序列分別為5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和5’-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3’。反應(yīng)選取25μL PCR反應(yīng)體系：22μL Gold PCR Mix，引物ITS1和IT

43、S4各0.5μL，模板DNA 1μL，ddH2O 1μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性60s，55℃退火40s，72℃延伸50s(30個(gè)循環(huán))； 最后72℃延伸10min，4℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后，取 5μL PCR 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳(100v，60min)檢測(cè)。染色15min后，在凝膠成像儀上觀察PCR產(chǎn)物的大小、完整性及電泳條帶的清晰度，并進(jìn)行拍照。</p><p>　　2.2.

44、8 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序及分析</p><p>　　將擴(kuò)增出來(lái)的目的核酸片段送杭州華大基因生物工程有限公司純化后進(jìn)行測(cè)序。對(duì)所測(cè)得的序列根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱選取并整理得到序列，然后將測(cè)得的序列提交美國(guó)NCBI的GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST，選取相似度高的序列和一外族序列作為構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的序列，通過(guò)clustalx軟件工具和Bioedit，Mega4軟件進(jìn)行比對(duì)分析并以Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

45、[5]。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 液體培養(yǎng)生長(zhǎng)情況</p><p>　　用接種環(huán)挑取固體培養(yǎng)基上的菌絲，接種于液體培養(yǎng)基，并通過(guò)恒溫振蕩培養(yǎng)觀察菌株的生長(zhǎng)情況。結(jié)果培養(yǎng)至1d生長(zhǎng)出菌絲，但不明顯，培養(yǎng)2d后菌絲明顯變長(zhǎng)，且培養(yǎng)基因?yàn)榫z的原因顯得渾濁，從第3d開(kāi)始，液體培養(yǎng)基呈現(xiàn)圖2的狀態(tài)

46、，可以看出菌絲成一個(gè)個(gè)的球形，且培養(yǎng)基溶液澄清，此現(xiàn)象符合絲狀真菌(霉菌)特征，可以初步判定該菌株屬于絲狀真菌。</p><p>　　圖2 菌種液體培養(yǎng)菌絲形態(tài)</p><p>　　圖3 菌株固體培養(yǎng)菌落形態(tài)</p><p>　　(A ，B為菌株培養(yǎng)2d的菌落形態(tài)，C為菌株培養(yǎng)3d后正面菌落圖，D為背面)</p><p>　　3.2 固體培養(yǎng)

47、生長(zhǎng)情況</p><p>　　實(shí)驗(yàn)用接種環(huán)挑取固體培養(yǎng)基上的菌絲，在待用的PDA固體培養(yǎng)基中心點(diǎn)一個(gè)點(diǎn)或三個(gè)點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察菌株的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示菌株在PDA平板上生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)1d后長(zhǎng)出白色菌絲，3d即可長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基。由圖3可知，菌落成圓形分布在培養(yǎng)基上，菌落開(kāi)始白色，后慢慢從中心開(kāi)始變?yōu)榫G色，并逐漸向四周擴(kuò)散，直至整個(gè)培養(yǎng)基都轉(zhuǎn)變成深綠色，菌落著生在培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基背面同色。氣生菌絲呈棉絮狀，菌絲叢小

48、而密，似絨毯，分生孢子呈綠色，均一地連續(xù)的分布，沒(méi)有形成離散分布的分生孢子簇的傾向。 </p><p>　　圖4 菌株顯微形態(tài)特征</p><p>　?。ˋ：10×10倍菌絲形態(tài) B：10×40倍菌絲形態(tài) C:10×100倍瓶梗形態(tài) D：10×100倍孢子形態(tài)）</p><p>　　3.3顯微觀察及結(jié)果</p&g

49、t;<p>　　實(shí)驗(yàn)待固體培養(yǎng)基上的菌株產(chǎn)孢后，挑取不同部位的菌絲體直接制成切片，在顯微鏡下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖4?？梢钥闯龇稚咦庸Ｖ髦Ψ种^長(zhǎng)，從頂端向下產(chǎn)生成對(duì)的逐漸變長(zhǎng)的二次分枝，分枝相對(duì)較短，呈直角伸出，瓶梗直接產(chǎn)生于二次分枝上，且單生。瓶梗呈瓶狀，中間膨大，頂部變細(xì)，大小為(3.0~9.5)μm×(2. 1~4.5)μm。分生孢子綠色，呈橢圓形或近球形，大小為(3.5~7.2)μm×(2. 1~4

50、.2)μm，壁光滑。根據(jù)上述形態(tài)特征同楊合同[15]編寫(xiě)的《木霉分類(lèi)與鑒定》對(duì)比可初步確定該菌株為加納木霉。</p><p>　　3.4 樣品基因組純度檢測(cè)結(jié)果</p><p>　　實(shí)驗(yàn)以ddH2O為對(duì)照管，對(duì)改良SDS方法提取的產(chǎn)物稀釋200倍后，進(jìn)行紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，得到260nm和280nm下測(cè)出的值分別為0.759和0.406，得出OD260/OD280為1.87。因?yàn)楹怂岬淖畲?/p>

51、吸收波長(zhǎng)為260nm，蛋白質(zhì)為280nm，所以通過(guò)測(cè)定在260nm和280nm的OD值的比值(OD260/OD280)，可以估計(jì)核酸的純度，且純凈DNA的比值為1.8，RNA為2.0。實(shí)驗(yàn)得到的OD260/OD280值在 1.8~2.0之間，說(shuō)明基因組 DNA所含雜質(zhì)少， 純度較好。</p><p>　　圖5 DNA瓊脂糖電泳圖</p><p>　?。ㄓ镜繫為DL 2000 DNA Mar

52、ker，泳道1為提取的樣品）</p><p>　　3.5 樣品基因組電泳檢測(cè)結(jié)果</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改良SDS方法，對(duì)提取產(chǎn)物進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)上圖5。圖中泳道M為DL 2000 DNA Marker，條帶清晰、整齊，表明電泳效果良好。泳道1為提取的樣品，上端有一條明亮的條帶，表明樣品溶液已成功提取到完整的DNA基因組，而且條帶顯示DNA較純凈，與上述紫外分光

53、光度法檢測(cè)結(jié)果一致，達(dá)至用于PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)?zāi)０宓馁|(zhì)量要求，可進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　3.6 ITS 序列 PCR 擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　實(shí)驗(yàn)以上述提取的基因組 DNA為模板，使用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如下圖6所示。其中泳道M為DL 2000 DNA Marker，條帶清晰、整齊，泳道1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在500bp~75

54、0bp之間有1條明亮的條帶，條帶清晰，符合真菌全長(zhǎng)rDNA-ITS區(qū)的序列大小范圍：300~1000bp，表明實(shí)驗(yàn)成功擴(kuò)增到目標(biāo)基因序列測(cè)序的rDNA-ITS區(qū)的序列片段。 </p><p>　　圖6 PCR瓊脂糖電泳圖</p><p>　?。ㄓ镜?為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道M為DL 2000 DNA Marker）</p><p>　　3.7 rDNA—I

55、TS序列測(cè)序分析</p><p>　　將上述PCR產(chǎn)物送杭州華大基因有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，實(shí)驗(yàn)選取雙向測(cè)序結(jié)果都共用的序列，并且所選取的序列為測(cè)序信號(hào)沒(méi)有出現(xiàn)套峰的測(cè)序信號(hào)。經(jīng)過(guò)整理得到的序列信號(hào)(總計(jì)520個(gè)bp)。如下：</p><p>　　CATTTCAGAAGTTTGGGGTGTTTTACGGCTGTGGCCGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTGTGCAAAC

56、TACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGGATTTCGGGGCCGGCACCCGTGTGAGGGCGTGCCGATCCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCT

57、GCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTCGAGACGCCCGCTAGGGTCGCCGAGAAAGGCTCAGAGCAAAGTTAAAACAGAGCCGCGACGGAAGCCGCGACGGAGAGAAAAAAGAGTTTGGTTGGTCCTCCGGCGGGCGCCATGGGATCCGGGGCTGCGACGCGCCCGGGGCAGAGATCCCGCCG</p

58、><p>　　測(cè)序部分序列圖如下：</p><p>　　圖7 測(cè)序部分序列圖</p><p>　　3.8 rDNA-ITS序列比對(duì)與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建</p><p>　　將上述整理得到的測(cè)序序列提交NCBI（美國(guó)國(guó)立生物信息中心）進(jìn)行核酸序列BLAST，根據(jù)結(jié)果實(shí)驗(yàn)選取了18條相似度高的序列進(jìn)行序列比對(duì)與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建分析。這18條序列的基因登錄號(hào)分別為：

59、JF904869，HQ342416，HQ342419，HQ342414，HQ342415，HQ342392，HQ342382，F(xiàn)J998413，F(xiàn)J998412，GQ203522，GU947794，EU598556，EU598555，EF392796，EF392810，EF429316，AY605756，AY605755，首先將這18條序列與實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)對(duì)象序列使用clustax軟件進(jìn)行比對(duì)并手工進(jìn)行“掐頭去尾”調(diào)整，比對(duì)完后，保存該比對(duì)

60、結(jié)果，如圖8，使用Bioedit進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換格式后的文件使用Mega4軟件按N-J法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)[14]。下圖9即為構(gòu)建的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，從圖中可以看到，目標(biāo)對(duì)象序列與Trichoderma ghanense(JF904869)處于同一個(gè)分枝，它們的相似度達(dá)到99%，因此可確定為T(mén)richoderma ghanense，即加納木霉。</p><p>　　圖8 序列比對(duì)整理圖譜</p><

61、p>　　圖9 N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)</p><p><b>　　4 結(jié)論與展望</b></p><p>　　木霉菌的鑒定與分類(lèi)結(jié)合使用這兩種方法能夠更準(zhǔn)確更貼近木霉菌的系統(tǒng)本身，從而為木霉菌的準(zhǔn)確鑒定提供更為有力的工具。從形態(tài)學(xué)觀察初步確定實(shí)驗(yàn)室分離的該菌株為木霉屬真菌，利用PCR方法擴(kuò)增與測(cè)序分析了該菌株的rDNA-ITS序列，并與GENBANK中的已有序列進(jìn)行了

62、BLAST比對(duì)分析，獲得了相似序列，然后運(yùn)用clustalx軟件對(duì)所獲得的序列進(jìn)行比對(duì)以及利用Mega4軟件的N-J法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。其結(jié)果顯示我們所分離得到的未知菌株與菌株Trichoderma ghanense基因登錄號(hào)JF904869處在同一分枝，他們的相似度達(dá)到99%，可確定我們分離的菌株為T(mén)richoderma ghanense，實(shí)驗(yàn)為該菌株的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。</p><p>　　真菌形態(tài)特

63、征是木霉分類(lèi)的基礎(chǔ)，木霉的形態(tài)特征復(fù)雜，而且少數(shù)形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定。因此，在傳統(tǒng)的木霉分類(lèi)中常引起分類(lèi)系統(tǒng)的不穩(wěn)定或意見(jiàn)分歧，這給形態(tài)學(xué)鑒定帶來(lái)一些困難。一般真菌形態(tài)學(xué)鑒定要有豐富的經(jīng)驗(yàn)，并參考ITS的分類(lèi)結(jié)果，經(jīng)過(guò)反復(fù)比較后得出結(jié)論；隨著生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，應(yīng)木霉分類(lèi)學(xué)自身發(fā)展的客觀要求，在木霉的現(xiàn)代分類(lèi)學(xué)中引入了分子生物學(xué)技術(shù)的鑒定方法，真菌分類(lèi)學(xué)在分類(lèi)方法和分類(lèi)系統(tǒng)等方面都發(fā)生了巨大

64、的變化，使得真菌分類(lèi)研究變得操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和可靠。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 張廣志,楊合同,文成敬.木霉菌形態(tài)學(xué)分類(lèi)檢索與分子生物學(xué)鑒定[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué),(自然科學(xué)版),2011,42(2):309-316.</p><p>　　[2] 章初龍,徐同.木霉屬分類(lèi)研究進(jìn)展[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)

65、學(xué)報(bào),2000,15(3):270-274.</p><p>　　[3] 陳榮庚.木霉菌的分離鑒定及其抑菌機(jī)理研究(D).福建農(nóng)林大學(xué)碩士專(zhuān)業(yè)學(xué)位論文,2008:5-6.</p><p>　　[4] 程麗云.木霉菌(Trichoderm spp.)的種類(lèi)鑒定及生防菌株的篩選(D).福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文,2007:5-9.</p><p>　　[5] 燕勇,李衛(wèi)平

66、,高雯潔等.rDNA-ITS序列分析在真菌鑒定中的應(yīng)用[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,10(18):1958-1961.</p><p>　　[6] 孫虎,楊麗榮,全鑫等.木霉生防機(jī)制及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011, 27(03) :242-246.</p><p>　　[7] 孫軍,段玉璽,呂國(guó)忠.木霉菌及其系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)研究回顧[J].菌物研究,2006,4(1):57

67、-63.</p><p>　　[8] 曾青蘭,降解秸稈纖維素絲狀真菌的分離鑒定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,47(6):652-655.</p><p>　　[9] 陳丹,蘇林娟,陳思雅.一株茶樹(shù)葉部?jī)?nèi)生木霉的分離和鑒定[J].福建林業(yè)科技, 2010,47(6):15-18.</p><p>　　[10] 賀字典,孫煥頃,高玉峰.食用菌木霉種類(lèi)鑒定[J].河北科

68、技師范學(xué)院學(xué)報(bào), 2008, 22(4):41-45.</p><p>　　[11] 李曉倩,一種適合于PCR擴(kuò)增的真菌基因組DNA提取方法[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,42(1):49-53.</p><p>　　[12] 張穎慧,魏東盛,邢來(lái)君等.一種改進(jìn)的絲狀真菌DNA提取方法[J].微生物學(xué)通報(bào),2008, 35(3):466-469.</p>&

69、lt;p>　　[13] 劉素玲,冉玉平,曾蔚等.一種適用于PCR反應(yīng)的酵母菌、無(wú)綠藻及絲狀真菌DNA提取方法[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志,2006,12(1):340-342.</p><p>　　[14] 吳小平,吳曉金,胡方平等.食用菌栽培相關(guān)木霉種的鑒定[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2008,16 (6):1048-1055.</p><p>　　[15] 楊合同.木霉分類(lèi)與鑒定[M].

70、北京:中國(guó)大地出版社,2009:123-125.</p><p><b>　　致 謝</b></p><p>　　值此論文完成之際，向四年來(lái)指導(dǎo)和幫助我的老師和同學(xué)表示衷心的感謝!首先感謝我的指導(dǎo)老師，本論文從設(shè)計(jì)選題到資料的搜集直至最后設(shè)計(jì)的修改的整個(gè)過(guò)程中，在老師悉心指導(dǎo)和全面關(guān)懷下完成的，花費(fèi)了他們很多寶貴的時(shí)間和精力。導(dǎo)師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、實(shí)事求是的科研作風(fēng)、

71、高度的責(zé)任心和敏銳的科研思路給我留下了深刻的印象，令我終生受惠。導(dǎo)師在學(xué)習(xí)和生活上所給予的諄諄教海和無(wú)微不至的關(guān)懷，更是讓學(xué)生終生難忘。感謝導(dǎo)師為我的成長(zhǎng)傾注的大量心血，在生活上、學(xué)習(xí)上和科研工作上給予的無(wú)微不至的關(guān)懷和教侮。借此機(jī)會(huì)，學(xué)生表示衷心的感謝和崇高的敬意！</p><p>　　此外，還要感謝所有在學(xué)習(xí)工作生活中一起努力奮斗的同學(xué)們，他們的幫助、支持和鼓勵(lì)是我一生的財(cái)富。</p><