大亞灣現(xiàn)場圍隔不同營養(yǎng)鹽加富對浮游細菌豐度的影響研究【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文（設(shè)計）</p><p>　　論文題目：大亞灣現(xiàn)場圍隔不同營養(yǎng)鹽加富對浮游細菌豐度的影響研究</p><p>　　所在學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物工程 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號

2、 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 日</p><p>　　畢業(yè)論文（設(shè)計）誠信承諾書</p><p>　　1．本人承諾所上交的畢業(yè)論文（設(shè)計），是在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下嚴格按照學(xué)校和學(xué)院有關(guān)規(guī)定完成的，引用他人

3、的觀點和參考資料均加以注釋和說明。</p><p>　　2．本人鄭重地承諾所上交的畢業(yè)論文（設(shè)計）沒有抄襲他人研究（設(shè)計）成果和偽造相關(guān)數(shù)據(jù)等行為。</p><p>　　3．畢業(yè)論文（設(shè)計）若有侵犯他人知識產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。</p><p>　　學(xué)生簽名： __________</p><p>　　日 期： ____

4、______</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　本研究主要對受人類活動影響少的深圳大亞灣海區(qū)進行了基于圍隔的生態(tài)調(diào)查，利用現(xiàn)場圍隔營養(yǎng)鹽投加對海水中浮游細菌的豐度變化進行了調(diào)查研究。結(jié)果顯示，所有圍隔中浮游細菌總數(shù)量在106數(shù)量級，其中空白對照圍隔海水中浮游細菌數(shù)量為4.55×106 ~ 7.07×106個/mL，投

5、加營養(yǎng)鹽圍隔細菌數(shù)量平均值范圍為5.80×106 ~ 8.44×106個/mL。實驗結(jié)果表明：海水中加入營養(yǎng)鹽，在一定程度上促進了浮游細菌的生長，細菌豐度的變化隨著營養(yǎng)鹽投加的比例和種類而異，但是差異不顯著（P > 0.05）。本文研究為今后開展海洋生態(tài)災(zāi)害的防治工作提供了一定的理論基礎(chǔ)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：大亞灣海域；圍隔；浮游細菌；營養(yǎng)鹽</p><p&

6、gt;<b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　This study mainly made a ecological investigation based on enclosed mescoms experiments in Daya Bay, which tested the effects of nutrients enrichment to the anundanc

7、e of bacterioplankton. The results showed that the bacterioplankton abundance of all the mescosms is 106cell/mL, and the abundance of marine bacterioplankton with the contrasted mescomsms was 4.55×106 ~ 7.07×10

8、6 cells/mL, the abundance of marine bacterioplankton with the tested mescomsms was 5.80×106 ~ 8.44×106cells/mL. The experimen</p><p>　　Key words: Daya Bay; Mescomsms; Bacterioplankton; Nutrient 目

9、錄</p><p><b>　　1 前言1</b></p><p>　　1.1 海洋細菌簡介1</p><p>　　1.1.1 海洋細菌種類及浮游細菌的定義1</p><p>　　1.1.2 海洋細菌的分布及功能1</p><p>　　1.2 國內(nèi)研究現(xiàn)狀2</p><

10、;p>　　1.3 本課題的研究意義3</p><p><b>　　2 材料和方法3</b></p><p>　　2.1 材料與儀器設(shè)備3</p><p>　　2.1.1 儀器3</p><p>　　2.1.2 試劑4</p><p>　　2.1.3 其他用品4</p>

11、<p>　　2.2 樣品的來源及處理4</p><p>　　2.2.1 樣品來源地簡介4</p><p>　　2.2.2 采樣站點設(shè)置4</p><p>　　2.2.3 圍隔設(shè)置4</p><p>　　2.2.4 營養(yǎng)鹽投加5</p><p>　　2.2.5 樣品處理5</p>

12、<p>　　2.3 材料準備6</p><p>　　2.3.1 玻片的制備6</p><p>　　2.3.2 抽濾水的制備6</p><p>　　2.3.3 配制DAPI染色劑6</p><p>　　2.3.4 用品滅菌6</p><p>　　2.4 實驗方法7</p><p&

13、gt;　　2.4.1 樣品稀釋7</p><p>　　2.4.2 樣品制片7</p><p>　　2.4.3 熒光顯微鏡觀察7</p><p>　　2.4.4 細菌計數(shù)方法8</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析8</b></p><p>　　3.1 浮游細菌計數(shù)結(jié)果與分析8&l

14、t;/p><p>　　3.1.1 總體分布8</p><p>　　3.1.2 不同圍隔的浮游細菌豐度變化10</p><p>　　3.2 浮游細菌數(shù)量與營養(yǎng)鹽的相關(guān)性分析13</p><p>　　3.2.1 浮游細菌數(shù)量與營養(yǎng)鹽Si含量相關(guān)性分析13</p><p>　　3.2.2 浮游細菌數(shù)量與營養(yǎng)鹽N、P含量相

15、關(guān)性分析15</p><p><b>　　4 結(jié)論17</b></p><p><b>　　參考文獻19</b></p><p><b>　　致 謝21</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p>

16、;　　1.1 海洋細菌簡介</p><p>　　水是生命之源，地球上水量的分布大致：海洋占97.41%，冰帽和冰河占1.984%，地下水占0.592%，湖泊占0.007%，土壤水體占0.005%，大氣中水蒸氣占0.001%，河流占0.0001%，生物體中占0.0001%[1]。地球上的生命首先來自海洋。海洋生物資源豐富、種類繁多，約有20多萬種，實際數(shù)量更可能是預(yù)計數(shù)的10倍。海洋中的微生物雖然個體微小，但是在生

17、態(tài)系統(tǒng)中扮演著極其重要的角色，而海洋微生物中分布最廣、數(shù)量最多的一類生物就是海洋細菌。它們在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)、能量流動、元素轉(zhuǎn)化、生態(tài)平衡及環(huán)境凈化等方面起著舉足輕重的作用。</p><p>　　1.1.1 海洋細菌種類及浮游細菌的定義</p><p>　　海洋中有自養(yǎng)和異養(yǎng)、光能和化能、好氧和厭氧、寄生和腐生以及浮游和附著等類型的細菌。幾乎所有已知生理類群的細菌，都可在海洋環(huán)境中找

18、到。最常見的有：假單胞菌屬（Pseudomonas）、弧菌屬（Vibrio）、無色桿菌屬 （Achromobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、螺菌屬 （Spirillum）、微球菌屬（Micrococcus）、八疊球菌屬（Sarcina）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、棒桿菌屬 （Corynebacterium）、枝動菌屬（Mycoplana）、諾卡氏菌屬 （Nocardia）和鏈霉菌屬（Streptomyces

19、）等十多個屬。</p><p>　　海洋浮游細菌（marine bacterioplankton）是指在海洋中營浮游生活的細菌，有可動性和不可動性兩種。前者在水中的含量與深度、季節(jié)、水溫及光照有關(guān)；后者多附著于浮游生物體上，一般有螺菌、球菌和桿狀菌。它主要包括異養(yǎng)細菌（heterotrophic bacteria）和超微型光合原核生物（picoprokaryoton），藍細菌（Synechococcus，聚球菌屬

20、，細胞粒徑為0.5 ~ 1.5 μm）及原綠球藻（prochlorococcus，細菌粒徑為0.4 ~ 0.8 μm），在全球碳循環(huán)中非常重要，已經(jīng)成為生物學(xué)和生態(tài)學(xué)研究中的前沿領(lǐng)域之一[2-5]。</p><p>　　1.1.2 海洋細菌的分布及功能</p><p>　　海洋細菌數(shù)量分布特點是近海區(qū)的細菌密度較遠洋區(qū)大，尤以內(nèi)灣和河口區(qū)最大。每毫升近岸海水中一般可分離到10個細菌菌落，有

21、時超過10個；而在每毫升深海海水中，有時卻分離不出一個細菌菌落。表層海水和水底泥界面處的細菌密度較深層水大，底泥中的細菌密度一般較海水中大，泥土底質(zhì)中的細菌密度一般高于沙土底質(zhì)。在海洋調(diào)查中，有時發(fā)現(xiàn)某水層中的細菌數(shù)量劇增，出現(xiàn)不均勻的微分布現(xiàn)象。這種現(xiàn)象主要是由于海水中可供細菌利用的有機物質(zhì)分布不均勻所引起，一般在赤潮之后常伴隨著細菌數(shù)量的劇增。</p><p>　　海洋細菌在生態(tài)環(huán)境中的作用主要表現(xiàn)在兩方面：

22、一方面，海洋細菌分解死的有機質(zhì)，同時合成并向水中分泌浮游植物光合作用所需要的營養(yǎng)，使初級生產(chǎn)持續(xù)進行；另一方面，通過“DOM→細菌→細菌捕食者”的途徑把來自初級生產(chǎn)者的有機碳不斷的向較高營養(yǎng)級傳遞[6]。它們將江河帶來的豐富有機質(zhì)及海洋中的浮游生物等遺體分解，又以無機鹽的形式回到水中，對水體產(chǎn)生顯著的影響。同時，海水的物理、化學(xué)的因素也影響著細菌的種類組成和數(shù)量分布。</p><p>　　由于海洋微生物富變異性，

23、故能參與降解各種海洋污染物或毒物，這有助于海水的自凈和保持海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。當海洋生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)平衡遭受某種破壞時，海洋細菌以其敏感的適應(yīng)能力和極快的繁殖速度，迅速形成異常微生物區(qū)系，積極參與氧化、還原活動，調(diào)整和促進新動態(tài)平衡的形成和發(fā)展。海洋細菌是產(chǎn)生新抗菌素、氨基酸、維生素和其他生理活性物質(zhì)的重要生產(chǎn)者；細菌參與海洋的沉積成巖作用，如參與硫礦和深海錳結(jié)核的形成等；在海洋成油、成氣的過程中，細菌起著重要作用；海水具有殺菌效果，是由

24、于海洋細菌的拮抗和溶菌作用，致使陸源致病菌迅速死亡；海洋細菌可直接作為海洋經(jīng)濟動物的餌料；細菌參與對各種海洋物質(zhì)的腐蝕、變性、污穢和破壞過程；某些海洋細菌是人體或海洋生物的致病菌；在特定條件下，海洋細菌代謝產(chǎn)物的積累會毒化養(yǎng)殖環(huán)境，如氨和硫化氫的積累危害生物養(yǎng)殖；也可以利用細菌的代謝活動來改善被毒化的養(yǎng)殖環(huán)境。</p><p>　　1.2 國內(nèi)研究現(xiàn)狀</p><p>　　我國于上世紀50

25、年代末開始海洋細菌學(xué)的研究。早期在海岸帶調(diào)查和大陸架調(diào)查中應(yīng)用培養(yǎng)的方法計數(shù)海洋細菌的數(shù)量，對海洋微生物的研究也還比較少，如1982年陳篤[7]對東海大陸架異養(yǎng)細菌的生態(tài)分布進行研究。80年代后期一些新方法和手段逐漸應(yīng)用于海洋微生物學(xué)的研究工作中，人類對海洋微生物的研究就豐富起來。如寧修仁[8]對長江口及其沖淡水區(qū)中的藍細菌、細菌的分布特點進行了研究；鄭天凌等[9]發(fā)表了對閩南——臺灣淺灘漁場上升流區(qū)的細菌生物量研究的文章；近年來肖天[

26、10]等研究了海洋浮游細菌在碳循環(huán)中的作用；李云等[11]對長江口鄰近海域浮游細菌分布與環(huán)境因子的關(guān)系做了相關(guān)報道；曾永輝[12]對典型海洋環(huán)境中的浮游細菌多樣性及環(huán)境適應(yīng)機制進行了研究；張喆等[13]對于青島近岸水體夏冬季浮游病毒、細菌分布特征極其環(huán)境因子的關(guān)系進行了研究。</p><p>　　1.3 本課題的研究意義</p><p>　　隨著大亞灣周邊地區(qū)現(xiàn)代工業(yè)的建立和人口密度的增加

27、，工業(yè)廢水和生活污水的排放以及網(wǎng)箱養(yǎng)殖的自身污染會給海灣帶來一定的環(huán)境壓力。在全球性富營養(yǎng)化進程中，隨著攝食食物鏈的變細與變短，以及微生物環(huán)的持續(xù)增粗，海洋細菌在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的地位和作用顯著增強，已成為海洋環(huán)境與生態(tài)學(xué)研究中不可缺少的重要內(nèi)容，也是正確評價海洋生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的重要組成部分[14?17]。海洋微生物與赤潮的形成有密切的關(guān)系，根據(jù)浮游細菌數(shù)量變化規(guī)律判斷水質(zhì)變化情況，可初步預(yù)測赤潮的發(fā)生[18]。該課題選取的區(qū)域是受人

28、類活動影響較小的南澳鎮(zhèn)海區(qū)，利用現(xiàn)場圍隔實驗進行海洋浮游細菌數(shù)量及營養(yǎng)鹽相關(guān)性影響的研究，對進一步了解海洋微生物在物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化過程中的作用機理，以及開發(fā)、利用和保護海洋資源具有極為重要的意義。在調(diào)查得到該地區(qū)環(huán)境狀況后可與大亞灣海域其他海區(qū)及其他海域做相對比較，對環(huán)境質(zhì)量好的區(qū)域加以效仿。</p><p><b>　　2 材料和方法</b></p><p>　　2.

29、1 材料與儀器設(shè)備</p><p><b>　　2.1.1 儀器</b></p><p>　　本實驗所采用的主要儀器和設(shè)備如表1所示。</p><p>　　表1 主要儀器和設(shè)備</p><p><b>　　2.1.2 試劑</b></p><p>　　DAPI染色液（Sig

30、ma公司）、工業(yè)酒精（江北科龍化工有限公司）、醫(yī)用酒精（寧波市鎮(zhèn)海甬峰化工廠）、濃硫酸（溧陽市光源工貿(mào)有限公司）。</p><p>　　2.1.3 其他用品</p><p>　　量筒、離心管、試管架、移液槍、槍頭、濾膜（0.22 μm Millipore Nitrocellulose， 0.02 μm Whatman）、鑷子、指甲油、無熒光的鏡油、干凈載玻片和蓋玻片、放制好的玻片的盒子、錫

31、箔紙、75% 酒精棉花、酒精燈、抽濾水、絲口瓶、注射器（1 mL、5 mL）、濾頭（0.22 μm、0.45 μm）、裝有冰塊的泡沫盒、標簽紙、記號筆、燒杯、報紙、橡皮筋等。</p><p>　　2.2 樣品的來源及處理</p><p>　　2.2.1 樣品來源地簡介</p><p>　　大亞灣地處惠州市東南，在惠東縣、惠陽區(qū)和深圳市之間。東靠紅海灣，西鄰大鵬灣。瀕

32、臨南海，水域面積近1000平方公里，是南海向陸地延伸最深的海灣，如同一個大袋子。</p><p>　　2.2.2 采樣站點設(shè)置</p><p>　　現(xiàn)場圍隔實驗于2011年9月5日 ~ 2011年9月14日在大亞灣南澳鎮(zhèn)海域進行，將圍隔定在魚排上，實驗周期定為10天。經(jīng)10天自然海水監(jiān)測，該站點海水的理化性質(zhì)：水溫30.3 ℃，鹽度31.01 ‰，pH值7.58，溶解氧168.31 μg/

33、L，硝酸鹽氮（NO3--N）0.6116 μmol/L，亞硝酸鹽氮（NO2--N）0.0786 μmol/L、氨鹽氮（NH4+-N）2.7877 μmol/L，磷酸鹽磷（PO43--P）0.45 μmol/L，活性硅酸鹽硅（SiO32--Si）12.5 μmol/L。</p><p>　　2.2.3 圍隔設(shè)置</p><p>　　強化帆布圍隔：圍隔由青島某公司定制，規(guī)格如下：長×

34、寬×高（加浮體）分別為1.0 m×1.0 m×1.5 m；頂端開口，附有四個浮體；一角設(shè)有一個0.5 m長的活動開口，可粘合；邊角配有相應(yīng)直徑的鍍鋅銅管活動框架，以撐開整個圍隔布，圍隔總?cè)莘e約為1.5 m³，底部附有配重沙龍。將其固定在漁排上，圍隔浸入海水中，將表層自然海水引入圍隔內(nèi)。該裝置盡可能地與周邊海域環(huán)境保持一致，避開了人為因素對實驗過程的干擾。</p><p>　

35、　配套塑料罩體：配套設(shè)計一與圍隔開口面同等大小的罩體，在雨天罩住圍隔，以排除淡水稀釋對圍隔水體造成的干擾。</p><p>　　塑料桶：規(guī)格為直徑0.6 m，高1.2 m，頂端開面，有蓋。設(shè)置把柄，其中的兩個面各設(shè)置4個把柄，可供栓拉繩索。</p><p>　　2.2.4 營養(yǎng)鹽投加</p><p>　　實驗挑選了5個圍隔。圍隔M0為對照組，圍隔M1~M4定為實驗組

36、，圍隔M0中未添加營養(yǎng)鹽；在圍隔M1中一次性在添加NaNO3 150 mL、NH4Cl 50 mL、KH2PO4 50 mL；圍隔M2中在圍隔M1的基礎(chǔ)上同時還一次性添加了Na2SiO3·9H2O 200 mL；圍隔M3中每天添加NaNO3 15 mL、NH4Cl 5 mL、KH2PO4 5 mL；圍格M4在圍隔M3基礎(chǔ)上同時每天添加Na2SiO3·9H2O 20 mL（如表2所示）。同時設(shè)置一個陰性對照Nc，即圍隔

37、試驗區(qū)域附近海域海水。</p><p><b>　　表2 營養(yǎng)鹽投加</b></p><p>　　2.2.5 樣品處理</p><p>　　營養(yǎng)鹽添加24 h后采集樣品。每日上午9 : 00攪動圍隔，攪拌均勻后用有機玻璃采水器取水樣（如圖2），用5%甲醛固定（具體方法參照《海洋生物生態(tài)調(diào)查技術(shù)規(guī)程》[19]）。記下圍隔號和日期，貼上標簽。放入

38、冰箱中保存。</p><p><b>　　圖1 采樣圖</b></p><p><b>　　2.3 材料準備</b></p><p>　　2.3.1 玻片的制備</p><p>　　將蓋玻片和載玻片浸泡于濃硫酸中1 ~ 2天后，接著將玻片一片一片的用蒸餾水反復(fù)稀釋沖洗數(shù)次，用pH試紙檢測其是否為中

39、性（可以與蒸餾水本身pH作為對比），沖洗至中性后一片一片放于酒精中充分浸泡，制片時待用。</p><p>　　2.3.2 抽濾水的制備</p><p>　　將約預(yù)計好體積的蒸餾水裝入絲口瓶中進行高壓滅菌，待其冷卻后在無菌室中進行抽濾。將高壓滅菌水加滿濾筒并抽濾2 ~ 3次對濾器進行清洗。卸下濾筒，在濾板上放置孔徑為0.22 μm的微孔濾膜，裝配好濾筒。再放上0.45 μm的濾頭，用20 m

40、L的注射器吸取滅菌水，通過濾頭打入濾筒中，接著將滅菌水進行抽濾，絲口瓶用抽濾水洗滌2 ~ 3次后再裝入抽濾水（不可太滿，以免滅菌不完全）。待抽濾工作結(jié)束后，將所有抽濾水進行高壓滅菌，待其冷卻后置于無菌室待用。</p><p>　　2.3.3 配制DAPI染色劑</p><p>　　本實驗細菌數(shù)量的測定采用DAPI(聯(lián)脒基苯吲哚)染色[20]。有濃度為1 mg/mL DAPI母液，實驗所需要

41、的DAPI染色劑濃度為5 μg/mL。所以在無菌室避光條件下進行DAPI染色劑的配制。將小支DAPI母液凍融，用200 μL移液槍移取將DAPI母液0.2 mL置于50 mL離心管中；再用5 mL移液槍移取7次5 mL超濾水至上述離心管中，再調(diào)動移液槍，移取4.8 mL超濾水至上述離心管內(nèi)。配制成了5 μg/mL的DAPI 染色劑40 mL，搖勻后分裝入15 mL小離心管中，包上錫箔紙。保存在 -40℃低溫保存箱中，待用時凍融即可。&l

42、t;/p><p>　　2.3.4 用品滅菌</p><p>　　實驗中將需滅菌后使用的物品進行高壓滅菌。將待滅菌物品放入高壓滅菌籃子中，檢查滅菌鍋水位，加適量自來水，使液面與鍋底相平。放入籃子，蓋好鍋蓋后開啟電源，設(shè)定好時間和溫度（一般為20 min/121℃）。“關(guān)門”燈熄滅后按下“work”鍵，滅菌鍋開始工作。當溫度上升到100℃時，冷空氣排完，關(guān)上冷氣閥（之前呈打開狀態(tài)）。溫度上升到12

43、1℃時開始自動計時，20 min后警示響起，“End”顯示，可關(guān)掉電源。待壓力表中指針指向“0”時，可以打開鍋蓋，待溫度下降到適宜溫度時，即可拿出滅好菌的物品。將滅菌好的物品放入干燥箱，根據(jù)干燥箱上所指是的步驟“POWER→CALL→TIMEMODE→RUN”開啟干燥箱，等物品干燥后置于無菌室待用。</p><p>　　實驗開始前，將超凈工作臺用酒精棉擦拭干凈后放上實驗物品，進行紫外照射并通風(fēng)15 min，達到殺

44、菌效果。</p><p><b>　　2.4 實驗方法</b></p><p>　　2.4.1 樣品稀釋</p><p>　　進入無菌室前穿好白大褂，進入后用酒精棉全面擦拭手，將工作臺上的實驗耗材整理好，凍融好的DAPI染色劑和水樣放在冰盒中，點燃酒精燈，開始稀釋樣品。用量筒量取45 mL抽濾水倒入離心管中，然后用移液槍移取5 mL樣品打入離心

45、管，慢慢吹打數(shù)次使其混勻，將樣品稀釋到10-1，換掉槍頭，從10-1稀釋樣中移取5 mL樣品打入另一支裝有45 mL超濾水的離心管中，慢慢吹打數(shù)次使其混勻，即為稀釋樣10-2。稀釋完成的樣品都需置于冰上待用，所有操作都需靠近酒精燈，避免污染。并貼上標簽（注明時間，圍隔以及稀釋倍數(shù)）置冰盒內(nèi)待下一步操作。</p><p>　　2.4.2 樣品制片</p><p>　　濾器裝備：裝配好抽濾三聯(lián)

46、體后，用抽濾水清洗2 ~ 3次，在所需要的濾孔上放上0.22 μm微孔濾膜，重新裝配好，并且記好加了膜的孔號（1 ~ 12）。</p><p>　　加樣抽濾：用移液槍移取5 mL樣品，將樣品打入濾孔中，記下樣品詳細和相應(yīng)的孔號，打開真空泵抽濾至干，真空泵的壓力控制在負壓（-50 ~ -60 kPa）。</p><p>　　染色：在弱光條件下，先用1 mL注射器吸取一定量凍融的DAPI染色劑

47、（5 μg/mL），打入0.22 μm濾頭到剛開始有染色劑從濾頭中滴出時為止，再重新吸取1 mL的染色劑滴入到濾孔內(nèi)的膜中間，擋光靜止染色8 min后抽濾。</p><p>　　在染色的同時，使用酒精棉擦拭槍頭盒一遍，待干后用于玻片放置。取出載玻片，用超凈工作臺吹出來的風(fēng)吹干后，放于已滅菌的槍頭盒上。同樣把蓋玻片也取出，干后放于槍頭盒邊上上露出一角，方便蓋蓋玻片時拿取。</p><p>　

48、　制片：待染色劑濾干后卸下12孔濾筒，用專用鑷子小心取下載有染色樣品的微孔濾膜，放于干凈的載玻片上展平，滴上1滴無熒光的鏡油，蓋上蓋玻片，若有氣泡需排除氣泡，用指甲油密封蓋玻片四周，貼上標簽，待指甲油干后放于玻片盒中避光保存待觀察。</p><p>　　2.4.3 熒光顯微鏡觀察</p><p>　?。?）將熒光顯微鏡觀察室環(huán)境打造成無光，汞燈先開10~15 min。時間到后打開電源、電腦

49、、顯微鏡電源開關(guān)、熒光開關(guān)等，到穩(wěn)定狀態(tài)后將樣品放到載物臺。</p><p>　　（2）通過調(diào)節(jié)視物光闌、孔徑光闌到“0”，調(diào)整整個視野亮度均勻一致、亮度最大，開始觀察。</p><p>　?。?）打開shutter鍵，從最低倍鏡下開始觀察，轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋至目鏡中出現(xiàn)亮點，由于顯微鏡直接連接到電腦上，我們可以根據(jù)打開的屏幕上的程序直接觀察，看到亮點后再調(diào)節(jié)細準焦螺旋至清晰后轉(zhuǎn)至下一倍物鏡。

50、</p><p>　　（4）到100倍鏡時，先將物鏡轉(zhuǎn)成八字，在片上滴上一滴Olympus的鏡油后再從100倍鏡下通過調(diào)節(jié)細準焦螺旋觀察，在熒光顯微鏡藍色激發(fā)光道油鏡條件下，DAPI染色的細菌呈亮黃色。</p><p>　?。?）待看到清晰點后，調(diào)節(jié)刻度尺放入拍照界面并拍下照片，拍照時通過調(diào)節(jié)載物臺轉(zhuǎn)化不同視野，拍取多張照片，最后數(shù)據(jù)可求平均值保證數(shù)據(jù)的準確性。</p>&l

51、t;p>　?。?）觀察結(jié)束后，將物鏡轉(zhuǎn)成八字拿出玻片，將玻片和鏡頭上的鏡油擦干凈，避光保存好再拿出另外制好的片子同上述步驟進行觀察。</p><p>　　2.4.4細菌計數(shù)方法</p><p>　　對細菌的染色顆粒進行計數(shù)，并取平均值再計算樣品中所含細菌顆粒。計算公式如下：BN = Na ·S/[Sf ·（ 1－0.05 ）· V][21] 其中：<

52、;/p><p>　　BN----每毫升樣品含細菌數(shù)量，單位為個每毫升（cells/mL）Na-----拍照面積細菌總數(shù)，單位為個（cells）S-------濾膜有效過濾面積，單位為平方毫米（mm2）Sf------拍照面積，單位為平方毫米（mm2）V-------加樣體積，單位為毫升（mL）</p><p>　　（注：式中0.05為加入37% ~ 40%甲醛占固定樣品總體積的比例）&

53、lt;/p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 浮游細菌計數(shù)結(jié)果與分析</p><p>　　3.1.1 總體分布</p><p>　　Nc為海水陰性對照即試驗區(qū)域附近海域海水，該點浮游細菌豐度實測值范圍為3.32×106個/mL ~ 4.27×106個/mL。</

54、p><p>　　圖2 Nc站點熒光計數(shù)圖</p><p>　　從5個圍隔中得到細菌數(shù)量各實測值為（5.81±1.26）×106個/mL、（7.99±2.40）×106個/mL、（7.63±2.32）×106個/mL、（7.70±2.74）×106個/mL、（5.15±0.66）×106個/mL

55、。由此可知，大亞灣海域南澳鎮(zhèn)附近海水的浮游細菌在6個數(shù)量級之間。圖3為5個圍隔的熒光計數(shù)圖，對比可看出上3幅小圖熒光亮點較下2幅多。與圖2做比較，圖3的各個小圖中熒光亮點又較多些。</p><p>　　圖3 M1、M2、M3（上三）M4、M0（下二）熒光計數(shù)圖</p><p>　　3.1.2 不同圍隔的浮游細菌豐度變化</p><p>　　表3 M0各天細菌數(shù)量

56、</p><p>　　圖4 M0熒光計數(shù)對比圖（9月5日、9月8日上；9月11日、9月14日下）</p><p>　　圍隔M0為空白對照，其中未添加營養(yǎng)鹽，照片處理后取得數(shù)據(jù)見表3。由表3可知，圍隔M0浮游細菌數(shù)量達到6個數(shù)量級，且在實驗的10天中，其細菌數(shù)量有下降的趨勢。</p><p>　　圖4為圍隔M0細菌熒光計數(shù)圖，從上面也可以看到視野中的亮點數(shù)量變化不大

57、，但是有逐漸減少的趨勢。</p><p>　　圖5 M1細菌數(shù)量變化圖</p><p>　　圍隔M1一次性投加了一定量的營養(yǎng)鹽N、P，其浮游細菌數(shù)量平均值為7.99×106個/mL，由圖5可以看到其細菌數(shù)量先下降，9月8日為最低點，此后又有上升趨勢。</p><p>　　圖6 M2細菌數(shù)量變化圖</p><p>　　圍隔M2一次

58、性投加了一定量的營養(yǎng)鹽N、P、Si，其浮游細菌數(shù)量平均值為7.70×106個/mL，由圖6可看出其細菌數(shù)量逐漸上升，9月11日達到最高峰后又迅速下降。</p><p>　　圖7 M3細菌數(shù)量變化圖</p><p>　　圍隔M3每天投加了一定量的營養(yǎng)鹽N、P，其浮游細菌數(shù)量平均值為7.63×106個/mL，由圖7可看出其細菌數(shù)量先上升，9月8日到最高峰后又下降。<

59、/p><p>　　圖8 M4細菌數(shù)量變化圖</p><p>　　圍隔M4每天投加了一定量的營養(yǎng)鹽N、P、Si，其浮游細菌數(shù)量平均值為5.15×106個/mL，由圖8可看出其細菌數(shù)量逐漸下降，9月11日達到最低點，后又有上升趨勢。</p><p>　　圖9 各圍隔細菌數(shù)量變化圖</p><p>　　由圖9可知，9月5日各個圍隔的浮游細

60、菌數(shù)量在6×106 ~ 8×106個/mL之間變化幅度不大。9月8日圍隔M3浮游細菌數(shù)量明顯高出其他圍隔，其數(shù)量為1.046×107個/mL，達到7個數(shù)量級。9月11日圍隔M2浮游細菌數(shù)量較各圍隔各天達到最高，其值為1.118×107個/mL。9月14日圍隔M1在其余圍隔浮游細菌數(shù)量平均為5×106個/mL時，其浮游細菌數(shù)值高出各個圍隔一倍，達到7個數(shù)量級。</p><

61、;p>　　3.2 浮游細菌數(shù)量與營養(yǎng)鹽的相關(guān)性分析</p><p>　　3.2.1 浮游細菌數(shù)量與營養(yǎng)鹽Si含量相關(guān)性分析</p><p>　　圍隔M1和M3分別為一次性和每天加入營養(yǎng)鹽N、P的圍隔。圍隔M0為空白對照圍隔。</p><p>　　圍隔M2和M4分別為一次性和每天投加營養(yǎng)鹽N、P、Si的圍隔。圍隔M0為空白對照圍隔。經(jīng)過其他小組實驗得知營養(yǎng)鹽Si

62、含量的變化如下圖10所示。</p><p>　　圖10 硅酸鹽含量變化圖</p><p>　　由圖10可知，圍隔M2 營養(yǎng)鹽Si含量最高，其最高值可達200 μmol/L，從第一天投加到第十天，先增加再下降到了一定值。圍隔M4從初始較低量逐漸上升（未達到100 μmol/L）后，開始下降到一定值。此定值接近于第一天投加營養(yǎng)鹽時的濃度。其余圍隔M1、M3中營養(yǎng)鹽Si含量基本與圍隔M0未投加

63、營養(yǎng)鹽時的濃度變化趨勢相仿，即無明顯趨勢變化。</p><p>　　圖11 M2、M4與M0細菌數(shù)量對照圖</p><p>　　取營養(yǎng)鹽Si含量有較大變化的圍隔M2、M4做分析。由圖11可知，圍隔M2細菌數(shù)量從第一天由一個相近于圍隔M0細菌數(shù)量的數(shù)量值，逐漸上升從6個數(shù)量級達到7個數(shù)量級，直到第十天又下降到了一個相近于圍隔M0的細菌數(shù)量值。由此我推測一次性投加硅酸鹽在一定時候促進了細菌生

64、長，但不可忽視其他兩種營養(yǎng)鹽的相對作用。圍隔M4細菌數(shù)量僅次于圍隔M0以相同趨勢下降。這里又顯示每天投加硅酸鹽在一定程度上對細菌生長產(chǎn)生影響較小。</p><p>　　3.2.2 浮游細菌數(shù)量與營養(yǎng)鹽N、P含量相關(guān)性分析</p><p>　　圖12 銨鹽含量變化圖</p><p>　　圖13 硝酸鹽含量變化圖</p><p>　　由圖12

65、和13可知，圍隔M0、M3、M4的營養(yǎng)鹽N含量變化都不明顯，且含量較低。圍隔M1、M2第一天一次性投加的營養(yǎng)鹽中有營養(yǎng)鹽N，所以在第一天出現(xiàn)最高值，且得到硝酸鹽含量比銨鹽高，這與初始投加量成正相關(guān)。至9月8日急速下降到10 μmol/L以下，此后與其他圍隔以相仿趨勢保持在0值附近，無太大波動。</p><p>　　圖14 磷酸鹽含量變化圖</p><p>　　由圖14可知，一次性投加營養(yǎng)

66、鹽中有營養(yǎng)鹽P的圍隔M1、M2，在9月8日其P鹽含量上升到了最高點，然后逐漸下降，最后一天磷酸鹽含量與第一天相近。每天投加的營養(yǎng)鹽中有營養(yǎng)鹽P的圍隔M3、M4，在第一天，其磷酸鹽含量與空白對照圍隔M0相近，之后逐漸上升。圍隔M3其磷酸鹽含量在最后一天甚至超過了圍隔M1和M2；圍隔M4其磷酸鹽含量即將接近圍隔M1、M2 的磷酸鹽含量值。對于圍隔M1 磷酸鹽含量略大于圍隔M2；圍隔M3略大于圍隔M4，兩組圍隔之間差異為硅酸鹽的投加，由此可推

67、測營養(yǎng)鹽Si對營養(yǎng)鹽P在某些因素影響下產(chǎn)生了抑制。</p><p>　　圖15 M1、M2與M0細菌數(shù)量對比圖</p><p>　　由圖15可知，在9月5日圍隔M1、M2細菌含量與圍隔M0相近；9月8日圍隔M2細菌含量開始上升高于圍隔M0，圍隔M1較圍隔M0無太大變化；9月11日圍隔M1、M2細菌含量均高于圍隔M0，且兩個圍格自身細菌數(shù)量在9月8日基礎(chǔ)上在增長；9月14日圍隔M1細菌含量

68、還在繼續(xù)上升，圍隔M2下降到與圍隔M0相近值。</p><p>　　圍隔M2較M1多加了營養(yǎng)鹽Si，一次性添加營養(yǎng)鹽N、P的圍隔M1其細菌數(shù)量在9月11日開始增長且有逐漸上升趨勢，那么我們推測一次性投加N、P鹽對浮游細菌起了促進生長的作用。而在一次性同時投加營養(yǎng)鹽N、P、Si的圍隔M2，其細菌數(shù)量在9月8日開始上升，9月11日達到最大值，9月14日下降到與圍隔M0相近似的數(shù)量值。故推測在此過程中營養(yǎng)鹽N、P、Si

69、共同作用促進了細菌生長，但從其下降值來看，又可以得出其促進細菌生長的時間較營養(yǎng)鹽N、P作用所促進生長的時間短。</p><p>　　圖16 M3、M4與M0細菌數(shù)量對比圖</p><p>　　由圖16可知，9月5日圍隔M3、M4細菌含量與圍隔M0相近；9月8日圍隔M3細菌含量開始上升高于圍隔M0，圍隔M4與圍隔M0比較無太大變化；9月11日圍隔M3細菌含量仍高于圍隔M0，且自身在9月8日

70、基礎(chǔ)上下降了，圍隔M4較圍隔M0還是無太大變化；9月14日圍隔M3細菌含量下降到與圍隔M0相近值，圍隔M4仍與圍隔M0相近。</p><p>　　圍隔M3較圍隔M4少了營養(yǎng)鹽Si的作用，每日投加N、P在一定程度上促進了細菌的生長，但在作用一定時間后，達到飽和不再產(chǎn)生促進作用；圍隔M4每日投加中三種營養(yǎng)鹽，但細菌數(shù)量卻無明顯變化，猜測是否在一定程度上三種鹽相互抑制，對浮游細菌的生長反而無明顯作用。</p>

71、;<p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　從本次調(diào)查結(jié)果看，深圳大亞灣海區(qū)南澳鎮(zhèn)附近海域的水體環(huán)境屬良好。這應(yīng)該與它受人類活動影響小有關(guān)。在其本身海域營養(yǎng)鹽濃度基礎(chǔ)上，再多加入N、P、Si等營養(yǎng)鹽都還會相對促進該海域的浮游細菌的生長，而人類活動過程中產(chǎn)生的污染物，其中也必定含有營養(yǎng)鹽等。大亞灣海域其他海區(qū)遭到的環(huán)境污染程度不同，若是大量的生活污水和工業(yè)污水排入

72、近岸海域，一定會使海洋環(huán)境質(zhì)量快速下降，富營養(yǎng)化加劇，甚至引起局部海域赤潮爆發(fā)，從而嚴重影響海洋經(jīng)濟的發(fā)展。因此，如果不能及時地控制污染物的產(chǎn)生和排放，該海域環(huán)境也會有逐漸惡化的可能。改善大亞灣海域的環(huán)境質(zhì)量，除了要做好環(huán)境保護工作外，也需要加強環(huán)保事業(yè)。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 程曉冰.水資源保護概況[J].水資源保

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86、/p><p>　　本研究是在楊老師的悉心指導(dǎo)下完成的，從論文的選題、實驗的設(shè)計到論文的完稿，導(dǎo)師傾注了大量的心血。是他給了我極大的幫助，尤其是導(dǎo)師公務(wù)繁忙，但時刻不忘記、不放松對我的嚴格要求，時刻關(guān)心我的論文進展情況。令我佩服的是導(dǎo)師才思敏捷，專業(yè)知識豐富，勤于思考和治學(xué)嚴謹?shù)目茖W(xué)態(tài)度，誨人不倦的高尚師德，嚴以律己、寬以待人的崇高風(fēng)范，樸實無華、平易近人的人格魅力。不僅使我樹立了遠大的學(xué)術(shù)目標、掌握了基本的研究方法，

87、還使我明白了許多待人接物與為人處世的道理。之前我對這個課題并不十分了解，但在他嚴謹，一絲不茍的教導(dǎo)下，最終使我明白了研究的意義，掌握了研究的方法。在此，謹向?qū)煴硎境绺叩木匆夂椭孕牡母兄x！</p><p>　　另外，我還要真心感謝王老師和徐老師在實驗過程中給予我的幫助。他們在實驗操作和論文設(shè)計中也提了不少建議，使我的設(shè)計更合理更趨于完善。至此論文完際，我謹向各位表示誠摯的謝意！</p><p&