氨氧化菌的分離及其氨氧化條件優(yōu)化【畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　氨氧化菌的分離及其氨氧化條件優(yōu)化</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物

2、工程 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目　錄</b>

3、</p><p><b>　　目　錄I</b></p><p><b>　　摘要II</b></p><p><b>　　1引言3</b></p><p><b>　　2材料與方法4</b></p><p>　　2.1

4、樣品來源4</p><p>　　2.2培養(yǎng)基、試劑及使用方法4</p><p>　　2.3氨氧化細菌的富集與分離6</p><p>　　2.4菌株的鑒定6</p><p>　　2.5氨氧化活性影響因子分析6</p><p>　　2.5.1溶氧量6</p><p>　　2.5

5、.2pH值6</p><p>　　2.5.3起始氨氮濃度6</p><p>　　2.6分析方法6</p><p><b>　　3結果與討論6</b></p><p>　　3.1菌株的鑒定6</p><p>　　3.1.1菌落菌體形態(tài)鑒定6</p><p&

6、gt;　　3.1.2分子鑒定7</p><p>　　3.1.2.1功能基因鑒定7</p><p>　　3.1.2.2 16s rDNA鑒定7</p><p>　　3.1.2.3AOB菌株分類學地位8</p><p>　　3.2菌株AOB-1氨氧化活性研究8</p><p>　　3.2.1溶

7、氧量8</p><p>　　3.2.2pH值9</p><p>　　3.2.3起始氨氮濃度9</p><p><b>　　4結論10</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻10</b></p>

8、<p>　　附錄錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　錯誤!未定義書簽。</b></p><p>　　摘要： 從舟山近海南美白對蝦養(yǎng)殖池塘底泥樣品中篩選到一株具有氨氧化功能的細菌，命名為AOB-1。菌株AOB-1好氧，革蘭氏陰性，球狀；菌落呈淡黃色、干燥、針尖狀。16S rDNA序列分析表明，該菌株與Nitrosomonas eutropha C

9、91T的相似性為100%，氨氧化功能基因-氨單加氧酶（amoA）比對也表明，該菌株與Nitrosomonas eutropha C91T的相似性為98%。在30℃，100 r/min時，25 mL-200 mL培養(yǎng)基裝量范圍內裝液量越少氨氧化率越高；最適pH值為8，pH值大于或小于8時，氨氧化效率都明顯受影響；氨氮濃度在1 mg/L-200 mg/L的范圍內，氨氧化速率隨氨濃度的升高而加快，在200 mg/L-1200 mg/L的范圍內

10、氨氧化速率基本保持不變，但當氨氮濃度高達2000 mg/L時，其活性受到明顯的抑制。因此，AOB-1菌株不僅對養(yǎng)殖水體，而且對高濃度氨氮廢水的處理也具有潛在的應用價值。</p><p>　　關鍵詞： 氨氧化細菌；亞硝化單胞菌；鑒定；氨單加氧酶基因</p><p>　　Abstract: A strain of ammonia oxidizing bacterial, AOB-1, was

11、isolated from the sediment of coastal Penaeus vannamei rearing pond in ZhouShan, Zhejiang Province. It is aerobic, gram-negative, spherical; and the single colony is light yellow, dry and needle tip-like. Its 16S rRNA ge

12、ne shows 100% similarity with that of Nitrosomonas eutropha C91T and it is 98% similar with Nitrosomonas eutropha C91T in ammonia monooxygenase(amoA). Ammonia oxidation rate is higher with more media in flasks in the r&l

13、t;/p><p>　　Keywords: Ammonia oxidizing bacteria; Nitrosomonas; Identification; Ammonia monooxygenase.</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　隨著我國經濟的迅速發(fā)展和城市化進程的加快，大量的工農業(yè)廢水、生活廢水排入天然水體中，

14、造成水體富營養(yǎng)化速度加快，污染現象嚴重。根據環(huán)境監(jiān)測總站的報道，我國大部分地表水和城市河道受到了不同程度的污染，氮素污染是引起水體污染的重要原因之一，而氮素廢水的超標排放是水體富營養(yǎng)化的主要原因。水體的富營養(yǎng)化對人體的健康和水中生物都是非常有害的，因此去除廢水中的氮素顯得尤為重要。氮主要以NH4+、NO2—、NO3—等形式對水體造成污染，對氮素污染的治理方法有很多，而最經濟且對環(huán)境友好的方法當推生物脫氮了。傳統(tǒng)生物脫氮是由好氧條件下的硝

15、化作用與厭氧條件下的反硝化作用完成的。</p><p>　　由于生物脫氮技術在很多方面都有無可比擬的優(yōu)勢，如可操作性強、投資少、見效快、無二次污染、廢水達標排放可靠性強等優(yōu)點，所以目前對廢水中氮素的處理主要采用生物脫氮法。而生物脫氮法主要受脫氮菌劑的活性、溫度、pH和DO等因素的影響，其中脫氮菌劑是最重要的影響因子，它直接決定了生物脫氮作用的強度和代謝反應的特征。而氨氧化菌的氨氧化能力是去除氨氮的主要因素，因此選

16、育高效的氨氧化菌株，并研究其氨氧化作用的最佳條件，對于應用生物脫氮法去除氨氮具有重要的意義。</p><p>　　隨著集約化和工廠養(yǎng)殖的發(fā)展，養(yǎng)殖水體中出現氨積累現象，對養(yǎng)殖動物產生毒害作用，嚴重時會造成大批死亡[1-4]。因此，養(yǎng)殖水體中的氨濃度的控制成為高密度養(yǎng)殖的一個重要環(huán)節(jié)?？刂拼胧┲痪褪鞘┯孟趸毦瑢毖趸蓙喯跛猁}，然后再進一步氧化成對養(yǎng)殖動物無害的硝酸[5-6]。高效的氨氧化菌和亞硝酸氧化菌的篩

17、選和配伍是調控水體氨氮濃度的關鍵。目前較常用的氨氧化菌屬于化能自養(yǎng)細菌，生長十分緩慢，采用傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)分析檢測法研究AOB相當費時、繁瑣[7-8]。我們經過一年的時間，從舟山南美白對蝦海水養(yǎng)殖池塘底泥樣品中分離純化得到一株具有較高氨氧化活性的菌株，通過16S rDNA和amoA功能基因序列比對對該菌株進行了鑒定，研究了其氨氧化特性。</p><p>　　氮素污染是引起水體富營養(yǎng)化的重要原因之一，因此污水的脫

18、氮處理對于維持水體清潔以及防止富營養(yǎng)化都具有重要的作用，硝化-反硝化的工藝路線是目前廢水脫氮處理的最主要工藝路線，該工藝的技術核心是硝化作用，其效率的高低往往決定著整個處理系統(tǒng)效率的高低[41]。硝化作用中的氨氧化細菌可以將水體中的氨氮轉為亞硝酸鹽，再結合反硝化細菌轉化為氮氣溢出水體完成脫氮。其中氨氧化細菌包括亞硝酸葉菌屬(Nitrosolobus)、亞硝酸球菌屬(Nitrosoccus)、亞硝酸螺菌屬(Nitrosospira)和亞硝

19、酸單孢菌屬(Nitrosomonas)等。</p><p>　　一般將氨氧化細菌歸為硝化桿菌科。近年在硝化細菌系統(tǒng)發(fā)育研究中, 基于16S rRNA 寡聚核苷酸的序列比較分析最先為硝化細菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性提供了框架。自養(yǎng)亞硝化細菌為硝化桿菌科的兩個生理亞群之一, 在自然界氮循環(huán)鏈中起重要作用, 能將氨態(tài)氮轉化為亞硝酸鹽氮, 并從該氧化過程中獲得能量, 同化無機碳化合物如CO32- 、HCO3-和CO2[5-8],

20、 合成細胞物質。在細菌系統(tǒng)發(fā)育圖譜中根據16S rDNA 序列同源性分析[9-10], 把亞硝化細菌生理亞群中的亞硝化單胞菌屬歸為紫色細菌群(Proteobacteria) 的B亞群。其它基于16S rDNA 序列同源性分析或氨單加氧酶(Ammonia monooxygenase, AMO)序列分析進行系統(tǒng)發(fā)育關系的研究表明, 除海洋亞硝化球菌(Nitrosococcus oceanus) 和嗜鹽亞硝化球菌(Nitrosococcus

21、halophilus) 為紫色細菌群的C亞群(Gamma subdivision or gamma subclass) 外, 亞硝化細菌各屬構成紫色細菌群B亞群。 一般亞硝化細菌的最適酸堿度是從中性趨于弱堿性</p><p>　　除了亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas) 外, 其它能把氨氧化成亞硝酸的細菌屬包括亞硝化螺菌屬(Nitrosospira) 、亞硝化球菌屬(Nitrosococcus) 、亞硝化弧

22、菌屬(Nitrosovibrio) 、亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus) 、亞硝化膠團菌屬(Nitrosogloea) 、亞硝化囊菌屬(Nitrosocystis) 。土壤生境中常見的是亞硝化單胞菌屬、亞硝化球菌屬、亞硝化葉菌屬、硝化螺菌屬 。海洋生境中常見的是亞硝化單胞菌屬、亞硝化球菌屬、亞硝化螺菌屬 。鹽湖生境中則有亞硝化單胞菌屬。</p><p>　　自養(yǎng)硝化作用在自然界生物硝化過程中占主導地位, 但

23、在某些環(huán)境中, 真菌、放線菌、異養(yǎng)細菌等異養(yǎng)硝化微生物進行化能有機營養(yǎng), 能將氨、羥胺或有機氮化合物如肟等氧化成亞硝酸和硝酸。 </p><p>　　實際上, 一個世紀以前就有關于異養(yǎng)硝化微生物及其異養(yǎng)硝化作用的報道, 近幾十年研究者相繼不同類型生境發(fā)現和分離了多種具有硝化活性的異養(yǎng)微生物(包括細菌、放線菌、真菌) 。其中, 異養(yǎng)硝化細菌有反硝化假單胞菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、產堿桿菌、節(jié)桿菌、糞產堿菌、P

24、B16 假單胞菌以及一些新發(fā)現的菌種(或屬) 。</p><p>　　氨氧化細菌是化能自養(yǎng)細菌，具有繁殖速率慢，世代周期長等特點，因此在污水處理中要保持硝化細菌的較好生長，需要較長的時間，難以高效地應用。本章的研究內容包括了氨氧化活性影響因子分析，氨氧化活力維持，了解其生長狀況，為水體富營養(yǎng)化中氮素的去除提供了數據支持。</p><p><b>　　材料與方法</b>

25、</p><p><b>　　樣品來源</b></p><p>　　舟山近海南美白對蝦高位養(yǎng)殖池塘表層底泥。</p><p>　　培養(yǎng)基、試劑及使用方法</p><p><b>　　a. 富集培養(yǎng)基</b></p><p><b>　　純化培養(yǎng)基：</b>

26、;</p><p><b>　　b. 試劑：</b></p><p>　　（1）Griess I ：磺銨酸 0.5 g加入150 mL30%的醋酸中。</p><p>　　（2）Griess II ：0.5 g a-萘銨加入50 mL水沸后加入150 mL30%的醋酸。</p><p>　　（3）NaOH 溶液：1 m

27、ol/L。</p><p>　　（4）HCl 溶液：1 mol/L。</p><p>　　（5）對氨基苯磺酰胺（NH2SO2C6H4NH2）溶液</p><p>　　稱取5.0 g對氨基苯磺酰胺溶于350 mL1:6（V:V）鹽酸中，用蒸餾水稀釋至500 cm3，儲于棕色瓶中。有效期2個月。</p><p>　?。?）二鹽酸-1-奈乙二胺（C

28、10H7NHCH2CH2NH2·2HCl）溶液（ρ=1.0 g/dm3）</p><p>　　稱取0.5 g二鹽酸-1-奈乙二胺，用少量蒸餾水溶解后，稀釋至500 mL，儲于棕色試劑瓶中，低溫保存（如出現棕色時應重配）。</p><p>　?。?）溴酸鉀-溴化鉀氧化劑貯備溶液</p><p>　　稱取2.8 g溴酸鉀（KBrO3）和20.0 g溴化鉀（KB

29、r）溶于1000 mL無氨蒸餾水中低溫保存，此溶液有效期一年。</p><p>　　（8）次溴酸鈉氧化劑使用溶液</p><p>　　吸取溴酸鉀-溴化鉀氧化劑貯備溶液1.0 cm3于棕色瓶中，加入49 mL蒸餾水，加入3.0 mL 1:1（V/V）鹽酸，迅速蓋上瓶蓋，混勻，置于暗處5 min，加入50 mL氫氧化鈉溶液（ρ=400 g/L），混勻。此溶液在35℃以下可穩(wěn)定8 h，臨用前配置

30、。</p><p>　?。?）氨標準貯備溶液</p><p>　　稱取0.5349 g一級氯化銨（NH4Cl，預先在100℃烘1 h，置于干燥器內冷卻），用少量蒸餾水溶解后，轉移至1000 mL量瓶中，稀釋至標線，加1.0 mL三氯甲烷，混勻。此溶液1.00 mL含10.00 μmolNH3-N冷藏，有效期6個月。</p><p>　?。?0）氨標準使用溶液<

31、/p><p>　　吸取1.00 mL氨標準貯備溶液于200 mL容量瓶中，稀釋至標線，混勻。此溶液1.00 mL含0.0500 μmolNH3-N，當天有效。</p><p>　　（11）顯色劑（水楊酸-酒石酸鉀鈉溶液）</p><p>　　稱取50 g水楊酸[C6H4(OH)COOH]，加入約100 mL水，再加入160 mL氫氧化鈉溶液(2 mol/L)，攪拌使之完

32、全溶解；再稱取50 g酒石酸鉀鈉（KNaC4H6O6·4H2O），溶于水中，與上述溶液合并移入1000 mL容量瓶中，加水稀釋至標線。貯存于加橡膠塞的棕色玻璃瓶中，此溶液可穩(wěn)定1個月。</p><p>　?。?2）次氯酸鈉使用液，ρ（有效氯）=3.5 g/L，c（游離堿）=0.75 mol/L</p><p>　　取經標定的次氯酸鈉，用水和氫氧化鈉溶液（2 mol/L）稀釋成含有

33、效氯濃度3.5 g/L，游離堿濃度0.75 mol/L（以NaOH計）的次氯酸鈉使用液，存放于棕色滴瓶中，本試劑可穩(wěn)定一個月。</p><p>　　（13）亞硝基鐵氰化鈉溶液，ρ =10 g/L</p><p>　　稱取0.1 g亞硝基鐵氰化鈉{Na2[Fe(CN)5NO]·2H2O}置于 10 mL具塞比色管中，加水至標線。本試劑可穩(wěn)定一個月。</p><p

34、>　　（14）酒石酸鉀鈉溶液，ρ = 500 g/L </p><p>　　稱取50.0 g酒石酸鉀鈉（KNaC4H6O6·4H2O）溶于100 mL水中，加熱煮沸以驅除氨，充分冷卻后稀釋至100 mL。</p><p>　　c. DNA提取方法（傳統(tǒng)法）：</p><p>　　（1）1.5 ml EP管收集菌體 8000 r/min,5 min,

35、 (10000 r/min, 2 min) , 收好的菌體可置于-20度保存，把培養(yǎng)基吸干。</p><p>　?。?）加1*TE pH = 8.0 500 ul 混勻 彈勻</p><p>　?。?）加入20 ul 溶菌酶(50 mg/ml) 至終濃度為2 mg/L 上下輕輕搖勻(破壁),置于37℃熱水中 觀察粘稠度的變化 每3-5 min搖一次 約30-40 min</

36、p><p>　　（4）加20 % SDS 57.8 ul至終濃度為2 %, 60℃水浴約20 min(時間可以自己掌握) 至透明 每5-10 min搖一次. 觀察粘稠度增加則破壁效果好.</p><p>　?。?）加入等體積(578 ul)的酚:氯仿:異戊醇(V比25:24:1) 混勻萃取 上下顛倒至乳濁狀</p><p>　　（6）4℃ 12000 r/mi

37、n離心10 min </p><p>　　（7）用剪子剪去尖端的槍頭吸取上清夜至另一EP管中(DNA溶于上層水相中) 加入與上清夜等體積的酚:氯仿:異戊醇,混勻</p><p>　?。?）12000 r/min離心10 min</p><p>　　重復5 -6 步至蛋白除去較完全</p><p>　　（9）去上清夜加等體積的氯仿:異戊醇

38、(24 : 1) 混勻至乳濁狀 12000 r/min離心10 min</p><p>　　（10）取上清夜, 加3 mol/L 醋酸鈉1/20 體積 : 即15ul , 再加入預冷的異戊醇(2倍體積) 600 ul 或(100乙醇) 輕輕混勻， 4℃ 12000 r/min離心10 min</p><p>　　（11）離心后輕輕倒掉溶液, DNA貼在管壁上,倒扣于紙上 吸干 加

39、70 % 酒精離心8 min(洗脫)</p><p>　　（12）倒去溶液,風干, 待管內酒精完全風干時(若未風干則點樣時會漂樣),加相應體積的純水或1×TE 溶解DNA</p><p>　　氨氧化細菌的富集與分離</p><p>　　取養(yǎng)殖池塘表層底泥樣品10 g接于內裝100 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在30℃，100 r/min搖床中培養(yǎng)，并

40、采用格里斯試劑檢驗NO2?是否生成，確定所富集細菌是否具有氨氧化功能。當格里斯試劑的顯色反應呈現陽性時，按1%接種量將富集液轉接到新的培養(yǎng)基中繼續(xù)富集，一般轉接一次需要10天。如此重復多次。</p><p>　　取最后一次轉接的富集培養(yǎng)液，梯度稀釋，涂布瓊脂平板，平板用封口膜封住，于30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌落出現。取30-300個菌落的平板，無菌條件下挑取所有單菌落接于裝有氨氧化細菌液體培養(yǎng)基的試管內，于30℃、

41、100 r/min轉速條件下培養(yǎng)。測定氨氧化能力，選取氨氧化能力最強的菌株作為研究的出發(fā)菌株。</p><p><b>　　菌株的鑒定</b></p><p>　　將純化菌株進行革蘭氏染色[12]，用光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)、大小。按Lemarchand K.等的方法提取細菌DNA[18]。利用特異性引物對amoA-F和amoA-R擴增氨氧化過程的關鍵酶—氨單加氧酶基因

42、[19]，同時，用引物對27F和1541R擴增16S rDNA。產物送上海生工測序，測序結果在NCBI上BLAST進行比對分析。</p><p>　　氨氧化活性影響因子分析</p><p><b>　　溶氧量</b></p><p>　　往250 mL三角瓶中分別裝入體積為25、50、100、200 mL的液體培養(yǎng)基，其中NH4+-N濃度均為1

43、00 mg/L，pH為7.2，按照1%的接種量加入AOB-1種子液（30℃,100 r/min培養(yǎng)7天，MPN計數法得到氨氧化細菌的菌數約為6.4×106個/mL，下同），在30℃條件下100 r/min搖床培養(yǎng)。</p><p><b>　　pH值</b></p><p>　　分別配制起始pH值分別為5、6、7、8、9、10的培養(yǎng)基，其中NH4+-N濃度均

44、為100 mg/L，各分裝100 mL入250 mL三角搖瓶中，接種1 mL AOB-1種子液，在30℃條件下100 r/min搖床培養(yǎng)。</p><p><b>　　起始氨氮濃度</b></p><p>　　在保持培養(yǎng)基其他營養(yǎng)鹽不變的情況下，分別配置NH4+-N濃度為1、10、50、100、200、300、400、800、1200、2000 mg/L的培養(yǎng)基，調節(jié)

45、pH值為7.2。往裝有100 mL培養(yǎng)基的三角搖瓶里分別接種AOB-1種子液1mL，在30℃條件下100 r/min搖床培養(yǎng)。</p><p><b>　　分析方法</b></p><p>　　亞硝酸鹽：N-(1-奈基)-乙二胺光度法[27]；氨氮：次溴酸鈉氧化法[28]；細菌計數：MPN計數法[29]。</p><p><b>　　

46、結果與討論 </b></p><p><b>　　菌株的鑒定</b></p><p><b>　　菌落菌體形態(tài)鑒定</b></p><p>　　經8次富集后，將富集液涂布于平板，初篩得到6個陽性菌株，試管復篩中得到一株氨氧化能力最強的菌株，命名為AOB-1。菌落呈白色小圓點狀，菌落中間逐漸呈淡黃色，直徑1 mm

47、左右，邊緣不光滑，且不易挑取。顯微鏡油鏡觀察，如圖1，菌體大小0.6-0.8 μm×1.0-1.6 μm，革蘭氏陰性，菌體為橢球狀，好氧，液體培養(yǎng)物容易形成絮狀物。</p><p>　　圖1 菌株AOB-1油鏡下照片</p><p>　　Fig.1 The picture of AOB-1 under oil immersion lens</p><p&g

48、t;<b>　　分子鑒定</b></p><p><b>　　功能基因鑒定</b></p><p>　　用引物對amoA-F和amoA-R擴增菌株AOB-1的功能基因組DNA，得到一個近500 bp的片段（如圖2），與預期的氨單加氧酶基因片段491 bp相符，進一步將該片段的測序結果在NCBI上BLAST比對，發(fā)現與Nitromonas eutr

49、opha C91T的氨單加氧酶序列（AJ298713）相似性為98%（如表1）。</p><p>　　圖2 菌株AOB-1氨單加氧酶的PCR產物凝膠電泳圖</p><p>　　Fig.2 The gel electrophoresis of ammonia monooxygenase PCR product of strain AOB-1</p><p>　　注

50、：M：marker；泳道1-3：分別為模板DNA原液、稀釋10倍、稀釋100倍的PCR產物</p><p>　　3.1.2.2 16s rDNA鑒定</p><p>　　將菌株AOB-1的16S rDNA擴增產物的測序結果（ATCGAAAAACTGCGGCTGTTTAAATTCAGTCGACGGCAGCGGGGGCTTCGCGCCCGCCGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATA

51、CATCGGAACGTGTCCTTAAGTGGGGAATAACGCATCGAAAGATGTGCTAATACCGCATATCTCTCAGGAGGAAAGCAGGGGATCGAAAGACCTTGCGCTAAAGGAGCGGCTGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTTACCAAGGCAACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCT

52、ACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCTCTTTTAGTCGGAAAGAAAGAGTCATAGTAAATAGCTATGATTTATGACGGTACCGACAGAAAAAGCACCGGCTAACT</p><p>　　表1 AOB-2 NCBI數據庫比對結果表</p

53、><p>　　Table1 the comparison results on NCBI database of AOB-2</p><p>　　AOB菌株分類學地位</p><p>　　圖3. 16s rDNA細菌系統(tǒng)發(fā)育樹</p><p>　　Fig.2 16s rDNA bacteria system growth trees</p&

54、gt;<p>　　圖3用貝葉斯分析法構建。數值展示了進化枝分配可能性的百分比。本文中獲得的氨氧化菌株AOB-1，用方框標明。分析分析中用到了16種氨氧化細菌菌株16s rDNA序列。分類地位如下：</p><p>　　phylum "Proteobacteria" </p><p>　　class Betaproteobacteria </p>

55、<p>　　order Nitrosomonadales </p><p>　　family Nitrosomonadaceae </p><p>　　genus Nitrosomonas </p><p>　　species eutropha</p><p>　　菌株AOB-1氨氧化活性研究</p><p

56、><b>　　溶氧量</b></p><p>　　圖4 溶氧量對菌株AOB-1氨氧化速率的影響</p><p>　　Fig.4 Effect of dissolved oxygen on ammonia oxidation rate of strain AOB-1</p><p>　　溶氧量（裝液量）對AOB-1的氨氧化活性的影響如圖

57、3：6天后，菌株開始將氨氮氧化至亞硝酸鹽，但此時各試驗組差別不大；11天后，裝液量小的實驗組（25 mL、50 mL、100 mL裝液量）的氨氧化率在18%-14%，200 mL裝量組只有7%；至第16天，裝液量為25 mL的實驗組的氨氧化率接近60%，裝液量50 mL和100 mL的實驗組氨氧化率在40%左右，而裝液量為200 mL的實驗組的氨氧化率只有35%。</p><p><b>　　pH值&l

58、t;/b></p><p>　　圖5 起始pH對菌株AOB-1氨氧化速率的影響</p><p>　　Fig.5 Effect of initiate pH value on ammonia oxidation rate of strain AOB-1</p><p>　　pH對AOB-1的氨氧化活性影響如圖4：pH為8的實驗組在6天時開始進行氨氧化，且氨氧

59、化速率快速提高，11天時已達到46%，至第16天，其氨氧化率已經達到69 %；第11天，pH6和pH7兩個實驗組氨氧化率低于10%；而pH 5、9、10等三組則不足5%；到第16天時，pH為7的實驗組氨氧化率達到37%，pH為5、6、9、10的四個實驗組的氨氧化率都在10%以下。</p><p><b>　　起始氨氮濃度</b></p><p>　　NH4+-N起始濃

60、度為1 mg/L的實驗組在第11天時產生的亞硝酸氮已達到2.88 mg/L，到16天時達到6.24 mg/L，這種情況可能與種子菌液內的NH4+-N濃度較高，對接種后的起始種子液NH4+-N濃度進行測量，發(fā)現1 mg/L的起始NH4+-N濃度已在3.9 mg/L?？赡芗毎€會吐出一些氮，進一步提高了最終亞硝酸氮濃度。NH4+-N起始濃度從1 mg/L到200 mg/L的實驗組產生的亞硝酸氮的量總體上隨NH4+-N的濃度增高而增高。而在反

61、應的整個過程中，NH4+-N起始濃度從200 mg/L到1200 mg/L的實驗組產生的亞硝氮量基本一致，尤其在第16天時，產生的亞硝酸氮的濃度基本維持在約60 mg/L-70 mg/L。另外，當起始NH4+-N濃度為2000 mg/L的時候，氨氧化能力明顯降低，這可能與高濃度NH4+-N在弱堿性條件下產生過量的游離氨，從而抑制了氨氧化細菌有關。</p><p><b>　　結論</b>&l

62、t;/p><p>　　從舟山近海南美白對蝦高位養(yǎng)殖池塘底泥樣品中，富集分離得到一株菌株AOB-1。經16S rDNA和氨氧化功能基因比對后，鑒定為Nitrosomonas eutropha。當溫度為30℃時，菌株AOB-1的氨氧化速率隨著溶氧量的增加而增加，最適起始pH值為8.0；另外，AOB-1在初始氨氮濃度范圍為1 mg/L—1200 mg/L時,氨氧化活性不受抑制。而在起始氨氮濃度為2000 mg/L時，AOB

63、-1的氨氧化活性受到明顯抑制。</p><p><b>　　參 考 文 獻</b></p><p>　　羅瓊芳, 徐恒, 張學俊, 等. 一株氨氧化菌的分離及其生物學特性研究[J]. 四川大學學報, 2006, 43 (3): 683-687.</p><p>　　Brandes JA, Devol AH, Deutsch C. New dev

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