納米tio2對(duì)斑馬魚(yú)肝損傷基因表達(dá)的影響【開(kāi)題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開(kāi)題報(bào)告</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　納米TiO2對(duì)斑馬魚(yú)肝損傷基因表達(dá)的影響</p><p>　　一、選題的背景與意義</p>&l

2、t;p>　　納米技術(shù)是當(dāng)今高科技發(fā)展中最快的領(lǐng)域之一，大約超過(guò)200種的納米材料被用于個(gè)人、商業(yè)、醫(yī)藥和軍事等領(lǐng)域。隨著納米材料所帶來(lái)的利益的同時(shí)，對(duì)納米材料釋放到環(huán)境中并對(duì)環(huán)境及生物所造成的潛在毒性也受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。有研究表明，當(dāng)宏觀物質(zhì)被粉碎成納米級(jí)超微顆粒后，其諸多方面的性質(zhì)均發(fā)生了根本性改變，納米顆粒特殊的理化性質(zhì)（如小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等） 使其與宏觀材料在生物活性和生物動(dòng)力學(xué)過(guò)程

3、等方面產(chǎn)生了明顯差異，因此對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的生物效應(yīng)和作用強(qiáng)度也發(fā)生了本質(zhì)上的改變，一些原本無(wú)毒或微毒的顆粒粒徑達(dá)到納米級(jí)時(shí)毒性明顯增強(qiáng)，一些原本無(wú)害的材料在達(dá)到納米級(jí)時(shí)可能會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生各種潛在危害（汪冰等，2005；朱融融等，2007）. 常規(guī)二氧化鈦（TiO2） 是一種低毒粉塵，在許多粉塵的毒理學(xué)研究中往往被用作無(wú)毒的對(duì)照粉塵，然而當(dāng)其達(dá)到納米級(jí)時(shí)（納米TiO2）其毒性明顯增強(qiáng). 研究表明，納米TiO2 染毒后可在肝大量富集，肝是納米Ti

4、O2 在生物體內(nèi)的主要靶器官（王江雪等，2008）</p><p>　　目前研究納米TiO2顆粒對(duì)生物的影響及生物效應(yīng)的受試生物主要為小鼠和細(xì)胞,對(duì)水生生物的效應(yīng)研究較少,更未見(jiàn)有研究納米TiO2對(duì)魚(yú)肝損傷及相關(guān)基因表達(dá)的報(bào)道.然而, 使用納米材料可能導(dǎo)致排放到水環(huán)境 ，并危及水生物與水生生態(tài)系統(tǒng).斑馬魚(yú)除了具有經(jīng)濟(jì)、觀賞價(jià)值外，還被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、毒理學(xué)、分子生物學(xué)等研究，被喻為理想的分子生物學(xué)的脊椎動(dòng)物

5、模型，具有很高的科研價(jià)值, 是外界環(huán)境變化，如重金屬鹽類、農(nóng)藥、工業(yè)污水、放射性物質(zhì)等對(duì)人類影響的良好研究材料。本項(xiàng)目希望通過(guò)納米TiO2對(duì)斑馬魚(yú)肝損傷及其相關(guān)基因表達(dá)的研究,為該領(lǐng)域的研究提供參考,積累數(shù)據(jù),更為深入了解納米TiO2 的毒性及其機(jī)制提供基礎(chǔ)依據(jù).</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問(wèn)題：</p><p><b>　　研究的基本內(nèi)容：</b

6、></p><p>　　從轉(zhuǎn)錄水平研究TiO2對(duì)魚(yú)的生物需效應(yīng)，包括RNA含量的測(cè)定；</p><p>　　從分子水平研究TiO2對(duì)魚(yú)的生物學(xué)效應(yīng)，如測(cè)定相關(guān)基因的表達(dá)。</p><p><b>　　擬解決的主要問(wèn)題：</b></p><p>　　如何提取出比較純的斑馬魚(yú)肝，并將其在液氮中完善的保存一段時(shí)間。<

7、;/p><p>　　用液氮研磨法提取出比較純凈的RNA。</p><p>　　以Actin作內(nèi)參配制等濃度的RNA量</p><p><b>　　引物的設(shè)計(jì)。</b></p><p>　　熟練運(yùn)用RT-PCR技術(shù)及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)待測(cè)基因的表達(dá)情況。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線

8、：</p><p>　　研究的方法：對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行納米材料TiO2的染毒培養(yǎng)，提取出斑馬魚(yú)肝中的RNA，以Actin作內(nèi)參配制等濃度的RNA量，RT-PCR技術(shù)及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)待測(cè)基因的表達(dá)情況。</p><p><b>　　技術(shù)路線：</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2

9、010年11月到2010年12月：查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解實(shí)驗(yàn)原理與實(shí)驗(yàn)過(guò)程。</p><p>　　2011年2月到2011年3月，RNA的提取，跑RT-PCR。</p><p>　　2011年3月到2011年4月，后期數(shù)據(jù)的處理。</p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] 朱融融,

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19、料在羅非魚(yú)飼料中應(yīng)用試驗(yàn)[J]. 中國(guó)水產(chǎn), 2007, 3: 78-79 .</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　熱激蛋白基因hsp70的研究進(jìn)展</p><p>　　摘要：熱激蛋白HSP70是一類高度保守的蛋白

20、質(zhì)，普遍的存在于原核和真核生物中。hsp70在細(xì)胞不同功能中發(fā)揮著作用。它可以作為分子伴侶參與細(xì)胞的發(fā)育、生長(zhǎng)和分化。近年來(lái)hsp70與疾病的關(guān)系成為了研究的熱點(diǎn)。本文從hsp70結(jié)構(gòu)，功能以及在疾病領(lǐng)域最新研究進(jìn)展展開(kāi)介紹。最后總結(jié)了hsp70的研究進(jìn)展，并展望了未來(lái)hsp的研究方向。</p><p>　　關(guān)鍵詞：熱激蛋白； hsp70； 研究進(jìn)展</p><p><b>　　

21、1熱激蛋白HSP</b></p><p>　　1.1熱激蛋白的發(fā)現(xiàn)及研究歷史</p><p>　　生物細(xì)胞在受熱或者其它理化因素(如乙醇、病毒感染 氨基酸類似物、DNA 損傷、缺氧、重金屬離子等) 應(yīng)激后發(fā)生熱休克反應(yīng)，可以抑制一些正常蛋白質(zhì)的合成，同時(shí)啟動(dòng)一類新的蛋白質(zhì)合成基因(熱休克蛋白基因)產(chǎn)生熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)[1]。</p

22、><p>　　在1962年，Ritossa觀察到在果蠅幼蟲(chóng)的飼養(yǎng)溫度從25cc提高到30cc后，發(fā)現(xiàn)在其唾液腺多絲染色體的某一區(qū)域出現(xiàn)了膨突，這表明了該區(qū)域的基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，為熱激反應(yīng)。1974年Tissieres等利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離技術(shù)得到熱休克反應(yīng)所產(chǎn)生的一組新蛋白質(zhì)(分子量為70kDa和26kDa)，為熱激蛋白。Nover(1984年)與Soger(1987年)先后闡明了編碼HSP的序列，基因結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)，

23、并確定其機(jī)理是由于高熱影響到該基因中的上游調(diào)節(jié)序列，熱激元件(Heat Shock Element，HSE)，并由此引起了熱激反應(yīng)，從而激活該基因編碼轉(zhuǎn)錄合成HSP。最早發(fā)現(xiàn)熱激蛋白的產(chǎn)生是由高溫引起的，實(shí)際上能夠引起熱激反應(yīng)的不僅是高溫，很多物理因素以及重金屬離子等外源物質(zhì)和相關(guān)組織損傷等 ，總之那些能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷的各種物理化學(xué)因素一般都是可以引起熱激反應(yīng)的，產(chǎn)生了熱激蛋白 [2]。</p><p>　　1.

24、2熱激蛋白的分類</p><p>　　再目前，對(duì)于熱休克蛋白的分類較多用的是日本學(xué)者森本的劃分方法。這種方法將主要的HSP劃分為了4個(gè)家族：HSP90家族(分子質(zhì)量約為83～90ku)，HSP70(分子質(zhì)量約為66～78 ku)，HSP60以及小分子量的HSP家族(分子質(zhì)量約為12～43 ku)。HSP70家族是最保守的熱休克蛋白家族，它在原核生物及真核生物體內(nèi)都存在，并且存在于所有的細(xì)胞和器官中，幾乎在所有的生

25、物的應(yīng)激細(xì)胞中都能夠被高度誘導(dǎo)，在熱休克蛋白中，HSP70是最為保守的一類，其擁有廣泛的生物學(xué)功能，這使其成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)[3]。</p><p>　　1.3 HSP70家族</p><p>　　在絕大多數(shù)生物中，HSP70是含量最多的熱休克蛋白。HSP70蛋白具有許多共同的性質(zhì)，這包括：所有的HSP70在與ATP的結(jié)合時(shí)，具有高親和力，并且具有微弱的ATPase活性；可以識(shí)別不同的靶多

26、肽并且調(diào)節(jié)它們的構(gòu)象；需要其它的HSP或細(xì)胞因子輔助其行使功能；在細(xì)胞的適當(dāng)部位折疊態(tài)蛋白的積累可以誘導(dǎo)個(gè)別HSP70家族成員的合成。HSP70具有高度的保守性，在真核生物中，HSP70蛋白具有60%~70%的保守性。大腸桿菌中的DnaK與真核生物中的HSP70具有40%~60%的同源性。氨基端部分具有ATP結(jié)合區(qū)和ATPase活性，這比羧基端部分具有更高的保守性。羧基端部分可能與一系列特殊蛋白底物作用，而氨基端部分與所有HSP70共同

27、的生化性質(zhì)是有關(guān)的 [4]。</p><p>　　HSP70家族成員及其功能[4]</p><p>　　1.4 HSP70基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)</p><p>　　在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的HSP70合成是一個(gè)自身調(diào)節(jié)的過(guò)程，包括HSP70與熱休克轉(zhuǎn)錄因子(HSF1)之間的相互作用。目前已鑒定出兩種種熱休克轉(zhuǎn)錄因子，HSF1介導(dǎo)應(yīng)激誘導(dǎo)的熱休克基因轉(zhuǎn)錄， HSF2參與細(xì)胞分化和細(xì)

28、胞功能的其他過(guò)程。在非應(yīng)激細(xì)胞中，HSF1是以單體的形態(tài)存在的，如果HSF1與HSP70相互反應(yīng)，HSF1就具有了DNA結(jié)合能力。在熱休克期間，復(fù)性及非折迭的蛋白質(zhì)濃度增加，而HSP70游離于HSF1之外，被釋放的HSF1聚積成三聚體，隨后進(jìn)入細(xì)胞核，被磷酸化，結(jié)合熱休克元件(HSE)的熱休克基因啟動(dòng)子區(qū)域。這些熱休克基因剛開(kāi)始具有轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致了HSP70濃度增加。當(dāng)合成到HSP70達(dá)到最佳濃度時(shí)，HSP70就與剛被激活的HSF1相互

29、作用，形成HSP70-HSF2復(fù)合物。在結(jié)合處，HSF1與DNA相互分離，轉(zhuǎn)變成了無(wú)活性，且未結(jié)合DNA的單體 [1]。</p><p>　　2 HSP70的功能</p><p>　　2.1 為分子伴侶的Hsp70</p><p>　　2.1.1 HSP70與分子伴侶</p><p>　　分子伴侶是指：能夠結(jié)合和穩(wěn)定另外一種蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象

30、，并能通過(guò)有控制結(jié)合和釋放，促進(jìn)新生多肽鏈的折疊、多聚體的裝配或降解及細(xì)胞器蛋白的跨膜運(yùn)輸?shù)鹊囊活惖鞍踪|(zhì)。分子伴侶是在進(jìn)化上非常保守的蛋白質(zhì)家族，廣泛分布于各種生物體內(nèi)。由于分子伴侶能夠防止未折疊蛋白質(zhì)的變性和促進(jìn)聚集的蛋白質(zhì)的溶解復(fù)性，所以在細(xì)胞經(jīng)受高溫或其他脅迫時(shí)的作用是特別重要的，許多分子伴侶在生物體內(nèi)首次以HSP(heat shock protein)形式被鑒定出來(lái)[5]。</p><p>　　2.1.2

31、 HSP70的結(jié)構(gòu)</p><p>　　HSP70結(jié)構(gòu)主要由一個(gè)N端高度保守的44 ku ATPase功能域(ATP binding domain)和一個(gè)分子質(zhì)量為25 ku的C端區(qū)域組成 [8]。</p><p>　　HSP70的結(jié)構(gòu)可分為三部分：44 kD部分(N端)，由4個(gè) 螺旋形成一個(gè)裂縫，是結(jié)合ATP的構(gòu)域，有ATPase活性；18 kD部分，由4個(gè)反相平行的B折疊和一個(gè)螺旋構(gòu)成

32、，是多肽的結(jié)合部位；10 kD部分(C端)，主要由螺旋構(gòu)成，是活性調(diào)節(jié)區(qū)域。其C端具有EEVD這四個(gè)氨基酸序列，在HSP70和HSP90中都是高度保守的[5]。</p><p>　　2.1.3 作為分子伴侶的HSP70</p><p>　　分子伴侶可以幫助體內(nèi)蛋白質(zhì)的正確組裝，它可以抑制產(chǎn)生非功能結(jié)構(gòu)的非正常折迭方式。一種蛋白質(zhì)自發(fā)性折迭要比自身快得多，這說(shuō)明了生多肽的折迭對(duì)與自身或其他蛋

33、白質(zhì)的隨意結(jié)合極為易感。當(dāng)一種蛋白質(zhì)的拆迭區(qū)域在此蛋白合成過(guò)程中變得易感時(shí)，核糖體就離開(kāi)此區(qū)域，并且出現(xiàn)分子內(nèi)和分子間聚集。這些特點(diǎn)被認(rèn)為是由于疏水殘基顯露出來(lái)所導(dǎo)致的。在蛋白質(zhì)的重新折迭過(guò)程中，一個(gè)非常常見(jiàn)的錯(cuò)誤是錯(cuò)誤折迭和聚集。這種現(xiàn)象在體內(nèi)極少發(fā)生，除非在溫度升高時(shí)發(fā)生蛋白質(zhì)突變。研究已證實(shí)新生多肽在體外折迭是無(wú)效的，而體內(nèi)折迭有效率通?？梢赃_(dá)到100％。因此可以判斷體內(nèi)多肽在合成過(guò)程中受到了保護(hù)，從而避免了錯(cuò)誤折迭和聚集的發(fā)生。

34、這種保護(hù)是受分子伴侶控制的，分子伴侶與之結(jié)合，并保護(hù)了有活性的蛋白質(zhì)表面，預(yù)防蛋白質(zhì)折迭的發(fā)生。HSP70具有結(jié)合肽類的能力，并且在HSP70的ATP酶活性較低時(shí)，在合成整個(gè)蛋白質(zhì)分子或者在蛋白質(zhì)分子進(jìn)入一個(gè)細(xì)胞器過(guò)程中與一個(gè)新生肽鏈發(fā)生了聯(lián)系，避免錯(cuò)誤折迭和聚集發(fā)生[1]。</p><p>　　2.1.4 HSP70分子伴侶系統(tǒng)</p><p>　　HSP70具有多種生物學(xué)功能，主要是由

35、于它能夠以依賴于ATP的方式結(jié)合或者釋放非天然構(gòu)象多肽的疏水片段，并且能遮蔽這些片段穩(wěn)定蛋白質(zhì)的松弛構(gòu)象和阻止聚集。HSP70不能獨(dú)自起作用，其依賴于co-chaperone的調(diào)節(jié)作用．在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，DnaJ可以提高HSP70的ATPase活性和促進(jìn)其與底物的結(jié)合。例如E.coli DnaK有兩個(gè)co-ehaperone：DnaJ和GrpE。DnaJ是41 ku的熱休克蛋白(HSP40)，可以為DnaK提供蛋白質(zhì)底物和促進(jìn)其ATPa

36、se活性。而GrpE是22 ku的熱休克蛋白(HSP20)，可以通過(guò)ADP和ATP的交換啟動(dòng)多肽的釋放，故GrpE又被叫做核苷酸交換因子。DnaJ家族成員廣泛存在于原核生物和真核生物中HSP70存在的區(qū)域。在真核生物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種DnaJ—like，有些(如SEC63和Tim44)是以膜結(jié)合的形式存在的，有些則以溶解的形式存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)中。但是GrpE類似物(如Mge1)只是在真核生物的線粒體中被發(fā)現(xiàn)。</p>

37、<p>　　2.2 HSP70的抗原遞呈作用</p><p>　　HSP70具有結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的抗原多肽上的功能。這是內(nèi)源性抗原遞呈的一部分，將導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞的激活。結(jié)合有HSP70的多肽釋放到細(xì)胞外時(shí)或HSP-肽復(fù)合物在體外存在時(shí)，復(fù)合物將會(huì)通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被當(dāng)作疫苗被抗原遞呈細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等吸收。這些HS-肽復(fù)合物將會(huì)經(jīng)過(guò)存在于巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞表面的MHC-I類分子遞呈

38、到T淋巴細(xì)胞，這個(gè)過(guò)程被稱作交叉遞呈作用。和單獨(dú)的抗原遞呈作用相比，HSP-肽復(fù)合物可以誘導(dǎo)更強(qiáng)的T細(xì)胞活化作用[6]。</p><p>　　2.3 HSP的抗凋零作用</p><p>　　凋亡(序列細(xì)胞死亡)是一個(gè)主動(dòng)過(guò)程，其特征性形態(tài)變化包括：核濃縮，核糖體之間DNA裂解及膜產(chǎn)生氣泡。斷裂的染色質(zhì)和膜結(jié)合的染色質(zhì)可以被鄰近細(xì)胞所吞噬，而且沒(méi)有炎癥應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程。</p>&

39、lt;p>　　最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，HSP72可以通過(guò)調(diào)節(jié)Caspase途徑來(lái)抑制熱應(yīng)激所誘導(dǎo)的凋亡，盡管它在抗離子化輻射方面使無(wú)效的。同樣，對(duì)小鼠精母細(xì)胞特異性HSP70基因進(jìn)行指定性破壞可以導(dǎo)致精母細(xì)胞凋亡的增加。在已證明抗雕亡蛋白質(zhì)BAG-1是HSP70和HSC70的調(diào)節(jié)子情況下，證明了HSP70s進(jìn)一步參與細(xì)胞死亡的抑制。Hsp70的抗凋亡功能部分是通過(guò)抑制ICE樣Caspases來(lái)實(shí)現(xiàn)的，BAG-1可與Hsp70在這些過(guò)程中

40、相互合作[1]。</p><p>　　2.4 HSP是與微管有關(guān)的蛋白質(zhì)</p><p>　　與微管有關(guān)的蛋白質(zhì)(MAPs)可以被分為二種：動(dòng)力型MAP s，它可以把微管做為細(xì)胞內(nèi)路徑亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生易位，如膜結(jié)合性囊泡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)元件，線粒體和染色體等；結(jié)構(gòu)型MAPs，它起到一種建筑作用，調(diào)節(jié)微管的空關(guān)組成，因而影響他們的功能。就是這后一種方式，表示了HSP70的特點(diǎn)。HSP70移附在聚合微管

41、蛋白的羧基末端(尤其在431～444殘基處)，此部位具有MAP s識(shí)別的位點(diǎn)，HSP70被看作為微管蛋白聚合作用的調(diào)節(jié)因子。HSP70作為MAPs(又能夠促進(jìn)微管蛋白的組裝和穩(wěn)定)的拮抗劑可抑制微管形成，F(xiàn)Isp70也可通過(guò)破壞MAPs來(lái)問(wèn)接促進(jìn)微管蛋白組裝。HSP70也可以穩(wěn)定細(xì)胞骨架蛋白如肌動(dòng)蛋白。[1]</p><p>　　2.5HSP是一種應(yīng)激保護(hù)質(zhì)</p><p>　　HSP70

42、是熱應(yīng)激和其他應(yīng)激所誘導(dǎo)出的最為顯著的蛋白質(zhì)之一。HSP的誘導(dǎo)往往與對(duì)其他應(yīng)激耐受性的誘導(dǎo)有關(guān)。多數(shù)應(yīng)激，由于暴露了蛋白質(zhì)的隱蔽性疏水區(qū)而使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性協(xié)調(diào)化。Hsp70s結(jié)合這些被損傷的蛋白質(zhì)，可預(yù)防它們發(fā)生聚集。HSP70不僅可以預(yù)防胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生聚集而且還可以遷徙到核仁中，與部分組裝的核糖體建立聯(lián)系，從而保護(hù)細(xì)胞核。用一種部分折迭構(gòu)象把損傷蛋白質(zhì)穩(wěn)定住可以為這些損傷蛋白質(zhì)的重新折迭起來(lái)或降解提供機(jī)會(huì)。HSP70蛋白質(zhì)還在耐

43、熱上起作用。耐熱通常被定義為通過(guò)先接觸輕度高溫后，忍受嚴(yán)重高溫的能力，各種觀察結(jié)果證實(shí)了HSP70在耐熱方面的作用。例如，耐熱的誘導(dǎo)與HSP70的積累之間關(guān)系要比與其他熱休克蛋白之間的關(guān)系更為密切。向接觸45℃ 的成纖維細(xì)胞中顯微注射HSP70抗體可以阻止此類細(xì)胞存活，而對(duì)照性抗體，則無(wú)此作用。通過(guò)高溫處理，篩選耐熱細(xì)胞系列可以生產(chǎn)出過(guò)分表達(dá)HSP70蛋白的細(xì)胞。用HSP70 mRNA顯微注射小鼠卵母細(xì)胞，隨后讓卵母細(xì)胞接觸高溫，結(jié)果發(fā)

44、現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組卵母細(xì)胞的受精率和發(fā)育狀況明顯高于對(duì)照組。[1]</p><p>　　3HSP在治療人類疾病中的作用</p><p>　　3.1HSP70在腫瘤免疫反應(yīng)中的作用</p><p>　　在1943～1962年間，人們發(fā)現(xiàn)大鼠用滅活的腫瘤細(xì)胞接種后，能夠?qū)﹄S后的活腫瘤細(xì)胞的進(jìn)攻產(chǎn)生免疫力，并且這種滅活的腫瘤細(xì)胞只對(duì)同源的腫瘤起免疫反應(yīng)，而對(duì)其它腫瘤不應(yīng)答。80年代

45、初，在從腫瘤細(xì)胞成分中純化腫瘤排斥抗原的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)HSPs參與了腫瘤免疫，已發(fā)現(xiàn)HSP70，Gp96和HSP90參與該過(guò)程。</p><p>　　在研究過(guò)程中，研究人員先以電泳分析腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)譜，試圖比較腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的蛋白質(zhì)譜之間的不同而找到能產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組分，但是一無(wú)所獲。而后，研究人員又以功能分離法，將腫瘤細(xì)胞抽提物逐步細(xì)分，追蹤能產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組分，發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組分是HSPs?？墒?，比較

46、腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞HSP的序列卻發(fā)現(xiàn)兩者幾乎完全一致。繼續(xù)深入研究發(fā)現(xiàn)，與HSP結(jié)合的小肽才是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。</p><p>　　Tamura等在1997將3LLcarcinoma的一株高轉(zhuǎn)移的細(xì)胞株D122，注射人小鼠足墊中，正常的結(jié)果是一段時(shí)間后(11天)將在其肺部發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的腫瘤。以D122的GP96制備物治療小鼠，小鼠轉(zhuǎn)移的腫瘤數(shù)目明顯減少，而若用其它3LL carcinoma細(xì)胞株的GP96制備物治

47、療小鼠，則沒(méi)有明顯效果。這說(shuō)明HSPs治療方法有個(gè)體專一性。他們使HSP70與ATP結(jié)合，放出HSP70結(jié)合的小肽后對(duì)腫瘤的免疫功能幾乎完全丟失，證明了HSPs實(shí)際上只起了載體的作用，與之結(jié)合的小肽才是關(guān)鍵。另外Tamura等還對(duì)一些缺陷型小鼠實(shí)驗(yàn)，表明HSPs對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答必須依賴CD4 T細(xì)胞，CH8 T細(xì)胞，NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[9]。</p><p>　　3.2 HSP70參與腫瘤免疫應(yīng)答的分子機(jī)制<

48、;/p><p>　　3.2.1 MHC-I途徑</p><p>　　胞質(zhì)溶液中抗原經(jīng)蛋白酶體降解后，抗原肽片斷經(jīng)HSP70、HSP90以依賴ATP方式結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP)，再經(jīng)TAP轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，由GP96轉(zhuǎn)運(yùn)。在此過(guò)程中肽分子經(jīng)胞質(zhì)溶膠及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的多種外肽酶依次進(jìn)行修剪，直至適合MHC-I類分子肽結(jié)合槽，形成穩(wěn)定的三聚體。然后MHC-I呈遞抗原肽至細(xì)胞

49、表面，但是由于宿主對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受，這時(shí)并不能真正引起免疫應(yīng)答。只有當(dāng)腫瘤細(xì)胞的HSPs制備物被注射如宿主體內(nèi)時(shí)，HSP一肽通過(guò)巨噬細(xì)胞表面的專一受體進(jìn)入巨噬細(xì)胞(不同于溶酶體方式)，一方面誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-1、IL-2、TNF-d和IFN等細(xì)胞因子激活各種效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤；另一方面由于抗原的呈遞效果在巨噬細(xì)胞表面得到增強(qiáng)，可以為CD8 T細(xì)胞識(shí)別，于是引起免疫應(yīng)答。在巨噬細(xì)胞表面已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了GP96的特異受體CD91，對(duì)這個(gè)機(jī)理

50、是一種佐證[10]。</p><p>　　某些HSP70分子(如PBP74)可以替代MHC分子，與抗原結(jié)合后，呈遞于細(xì)胞表面。吳偉忠等曾用表面缺乏MHC-I類分子表達(dá)的H22細(xì)胞熱休克后與淋巴細(xì)胞單向混合培養(yǎng)后所誘導(dǎo)的CTL能增加對(duì)同種熱休克腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，但這種殺傷作用可被抗小鼠HSP70IgG2a單抗所阻斷，表明效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用是通過(guò)識(shí)別靶細(xì)胞膜上的HSP70介導(dǎo)的，而不是通過(guò)MHC-I類分子介

51、導(dǎo)的。進(jìn)一步分析效應(yīng)細(xì)胞的CD4、CD8及TCR表型發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)細(xì)胞中特異性殺傷作用的CTL表型為CD8- CD4- TCRγδ+ 的淋巴細(xì)胞。由此可見(jiàn)，HSPs可作為γδT細(xì)胞識(shí)別的抗原配體，在γδT細(xì)胞的動(dòng)員、增殖和生物學(xué)活性的發(fā)揮中起著極其重要的作用 [11]。</p><p>　　3.2.2 MHC-II途徑</p><p>　　HSPs轉(zhuǎn)運(yùn)抗原肽可以進(jìn)入內(nèi)質(zhì)體，并且協(xié)助抗原肽與MH

52、C—I1分子結(jié)合，遞呈抗原肽至細(xì)胞表面。這一機(jī)理只是推測(cè)，并無(wú)直接證據(jù)證明[2]。</p><p>　　3.3嵌合DNA疫苗HSP70</p><p>　　3.3.1嵌合DNA疫苗</p><p>　　嵌合DNA疫苗是將幾個(gè)不同的抗原蛋白基因或抗原蛋白基因與編碼細(xì)胞因子、共刺激分子等具有免疫佐劑效應(yīng)的分子基因共同嵌合于一個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒，以增強(qiáng)抗原特異性免疫反應(yīng)。研究

53、證明嵌合DNA疫苗通過(guò)嵌合優(yōu)于普通DNA疫苗與佐劑聯(lián)合免疫，提高了免疫保護(hù)性，減少了毒副作用。它具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)只含部分基因組序列，減少了變態(tài)反應(yīng)，不會(huì)因其毒力回升或滅活失敗而導(dǎo)致疫苗病例，不含有活疫苗制劑經(jīng)常含有的培養(yǎng)基、血清等外源成分的污染，可在新生兒及免疫功能低下人群中應(yīng)用，免疫人群的范圍擴(kuò)大；(2)抗原既能引起體液免疫又能引起細(xì)胞免疫，效果類似減毒活疫苗；(3)制備簡(jiǎn)單，成本低，易進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)；(4)構(gòu)建周期短，利于對(duì)病原

54、抗原變異作出快速反應(yīng)；(5)外源容量大，易發(fā)展為多價(jià)疫苗；(6)儲(chǔ)存簡(jiǎn)單，保存期長(zhǎng)，無(wú)需冷鏈，易在不發(fā)達(dá)的國(guó)家推廣。</p><p>　　3.3.2 嵌合DNA疫苗HSP70</p><p>　　自研究證實(shí)HSPT0在動(dòng)物和人類具有抗感染及抗腫瘤效應(yīng)以來(lái)，有關(guān)嵌合DNA疫苗HSPT0的研究不斷深入。在預(yù)防及治療細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等感染以及腫瘤等方面獲得了明顯進(jìn)展。</p>&

55、lt;p>　　3.3.2.1抗感染作用</p><p>　　1995年，Lowrie等將結(jié)核分枝桿菌HSP70抗原克隆到了巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子下構(gòu)成了DNA疫苗，發(fā)現(xiàn)其免疫效果與BCO非常相近。另外結(jié)核分枝桿菌HSP70-CD80、HSP70-Ag85A等改進(jìn)的嵌合DNA疫苗在實(shí)驗(yàn)中都顯示了有較好的免疫效果，給了免疫低下患者或缺陷患者以及耐藥結(jié)核病患者帶來(lái)了希望。[12]</p><p>

56、;　　1996年，suzue使用結(jié)核分枝桿菌HSP70和HIV-lp24嵌合的表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠，結(jié)果證明比OVA與HIV-1p24嵌合的表達(dá)質(zhì)粒和HIV-1p24表達(dá)質(zhì)粒的免疫效果明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步的研究證明了OVA與HSP70融合蛋白不僅能夠刺激CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，還能夠刺激CD4-非依賴性CTL應(yīng)答，為CD4+細(xì)胞缺乏患者，如艾滋病患者的預(yù)防和治療帶來(lái)了希望。[13]</p><p>　　2000年，Maran

57、on等報(bào)道了使用克魯斯錐蟲(chóng)HSP70與KMP11嵌合DNA疫苗，使用肌內(nèi)注射感染小鼠，發(fā)現(xiàn)了單核細(xì)胞可釋放表達(dá)KMP11-HSP70融合蛋白，并且使未感染細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)，促進(jìn)DC成熟和Th1細(xì)胞的分化，分泌細(xì)胞因子，顯著提高細(xì)胞免疫與體液免疫能力。在小鼠中可有效預(yù)防及治療克魯斯錐蟲(chóng)病。</p><p>　　3.3.2.1抗腫瘤作用 </p><p>　　2000年，Chen等建立了人乳

58、頭瘤病毒(HPV-16)E7抗原基因與結(jié)核分枝桿菌HSP70基因的嵌合DNA疫苗，而且在研究中發(fā)現(xiàn)E7-HSP70嵌合DNA疫苗的E7特異性CD8+T細(xì)咆明顯增高，是未嵌合的E7DNA疫苗的30倍，這證明了HSP70基因與抗原基因的嵌合可以顯著增強(qiáng)DNA疫苗的免疫保護(hù)效果。Hsu等以pSCA1為載體，發(fā)現(xiàn)HPV。l6E7抗原基因與結(jié)核分枝桿菌HSP70基因的嵌合DNA疫苗產(chǎn)生的T細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，顯著高于末嵌合的DNA疫苗，進(jìn)一步證明

59、了HSP70可以增強(qiáng)免疫效果的功能0。Liu等以腺相關(guān)病毒(AAV)為載體也構(gòu)建了HPV。l6E7與HSP70嵌合DNA疫苗，結(jié)里顯示了該疫苗可誘導(dǎo)CD4和CD8依賴性CTL活性，也可抑制同源表達(dá)E7的腫瘤細(xì)胞。HPV-l6E7-HSP70嵌合DNA疫苗已經(jīng)進(jìn)行了臨床I／Ⅱ期試驗(yàn)，用來(lái)治療HPV-l6相關(guān)的頸部高分化上皮鱗癌、頭頸部鱗細(xì)胞癌，證明治療確實(shí)有效，并與通常的肌肉注射法生物介導(dǎo)法相比較，用基因槍導(dǎo)入法可用最小的劑量產(chǎn)生最高數(shù)量

60、的E7特異性CD8+T細(xì)胞，產(chǎn)生最佳抗腫瘤效果。</p><p>　　由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，腫瘤組織來(lái)源的HSP70可以作為一種腫瘤特異性抗原，能夠誘導(dǎo)體內(nèi)CD8+T淋巴細(xì)胞成為腫瘤特異性的CTL，并使Th1型細(xì)胞因子升高，具有特異性的抗腫瘤作用。在Vanaja等的研究中發(fā)現(xiàn)，患者腫瘤細(xì)胞表達(dá)的HSP70是腫瘤表面的特異性結(jié)構(gòu)，與抗腫瘤活性有密切相關(guān)的關(guān)系。傅慶國(guó)等研究也證實(shí)腫瘤組織來(lái)源的HSP70 DNA疫苗有

61、很強(qiáng)的殺瘤活性，該疫苗在停止治療后仍可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持免疫作用，這個(gè)發(fā)現(xiàn)對(duì)于防止腫瘤復(fù)發(fā)、延緩腫瘤進(jìn)展有重要意義。2003年，Cheng等研究證明，癌癥的免疫療法面臨的主要障礙是MHCI工類分子的低表達(dá)。由于腫瘤可使MHC工類分子低表達(dá)，因此建立MHCI類分子低表達(dá)的腫瘤模型是設(shè)計(jì)研制抗腫瘤疫苗的關(guān)鍵。該實(shí)驗(yàn)用建立的低標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)MHC I類分子腫瘤模型，證明了E7-HSPT0 DNA疫苗可對(duì)MHC I類分子低表達(dá)的腫瘤產(chǎn)生顯著的抗腫瘤效應(yīng)

62、，但是牛痘疫苗卻不能產(chǎn)生相似的抗腫瘤效應(yīng)。在同時(shí)淋巴細(xì)胞損耗實(shí)驗(yàn)證明了CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、IFN-γ是應(yīng)用疫苗時(shí)產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)所必須的成分。在另外一些報(bào)道中，HSP110-腫瘤抗原肽復(fù)合物是無(wú)MHC I類抗原</p><p><b>　　問(wèn)題與展望</b></p><p>　　盡管HSP70分子伴侶系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能方面的研究取得了很大的進(jìn)展，但是在DnaJ-lik

63、e為HSC70提供蛋白質(zhì)底物的機(jī)理方面，特別是對(duì)真核生物HS00而言還不清楚。另外ATP與HSP70ATPase功能域的結(jié)合和水解如何引起底物結(jié)合功能域構(gòu)象發(fā)生變化的機(jī)理仍然不知道。如何搞清楚這些問(wèn)題，對(duì)于闡明蛋白質(zhì)的折疊、定位及跨膜運(yùn)輸機(jī)理是有重要意義的.</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 李守軍, 王洪斌. Hsp70研究進(jìn)

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76、/p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　1 引言2</b></p><p><b>　　2 材料與方法3</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料3</p><p>　　2.1.1 動(dòng)物材料1</p>&

77、lt;p>　　2.1.2 主要試劑1</p><p>　　2.1.3 主要設(shè)備3</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法3</p><p>　　2.2.1 斑馬魚(yú)的馴養(yǎng)3</p><p>　　2.2.2 斑馬魚(yú)的染毒處理4</p><p>　　2.2.3 斑馬魚(yú)總RNA的提取4</p>&

78、lt;p>　　2.2.3.1 使用Biozol試劑提取RNA4</p><p>　　2.2.3.2 總RNA完整性檢測(cè)4</p><p>　　2.2.3.3 總RNA濃度及純度分析4</p><p>　　2.2.4 RT-PCR擴(kuò)增4</p><p>　　2.2.4.1 RT-PCR反應(yīng)體系4</p><p

79、>　　2.2.4.2 PCR反應(yīng)條件5</p><p>　　2.2.4.3擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)6</p><p>　　2.3 數(shù)據(jù)處理6</p><p><b>　　3 結(jié)果6</b></p><p>　　3.1 斑馬魚(yú)肝總RNA完整性檢測(cè)6</p><p>　　3.2 總RNA的濃度及

80、純度檢測(cè)7</p><p>　　3.3 納米TiO2對(duì)各基因表達(dá)的影響7</p><p>　　3.3.1 納米TiO2對(duì)ACTIN基因表達(dá)的影響7</p><p>　　3.3.2 納米TiO2對(duì)CTR1基因表達(dá)的影響8</p><p>　　3.3.3 納米TiO2對(duì)MTF-1基因表達(dá)的影響9</p><p>

81、　　3.3.4 納米TiO2對(duì)NKA基因表達(dá)的影響10</p><p>　　3.3.5 納米TiO2對(duì)HSP70基因表達(dá)的影響11</p><p>　　3.3.6 納米TiO2對(duì)HIF基因表達(dá)的影響12</p><p>　　4 分析與展望13</p><p>　　4.1 納米TiO2對(duì)斑馬魚(yú)肝CTR1基因表達(dá)影響的機(jī)理分析13<

82、;/p><p>　　4.2 納米TiO2對(duì)斑馬魚(yú)肝MTF-1基因表達(dá)影響的機(jī)理分析13</p><p>　　4.3 納米TiO2對(duì)斑馬魚(yú)肝NKA基因表達(dá)影響的機(jī)理分析14</p><p>　　4.4 納米TiO2對(duì)斑馬魚(yú)肝HSP70基因表達(dá)影響的機(jī)理分析14</p><p>　　4.4 納米TiO2對(duì)斑馬魚(yú)肝HIF基因表達(dá)影響的機(jī)理分析1

83、5</p><p><b>　　4.5 展望15</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)16</b></p><p>　　摘要：為探討納米TiO2（Nano-TiO2）顆粒對(duì)斑馬魚(yú)（Danio rerio）肝損傷相關(guān)基因表達(dá)的影響，選取濃度為5.6mgL-1的 TiO2培養(yǎng)斑馬魚(yú)，運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)分析相

84、關(guān)基因在不同處理時(shí)間（6h，12h，24h，48h，72h）的表達(dá)量。共檢測(cè)了HSP70（heat shock protein，熱休克蛋白）、HIF (hypoxia inducible factor，低氧誘導(dǎo)因子)、CTR1（copper transporter 1，銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）、MTF-1（metal-responsive transcription factor-1，金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子）、NKA（Na+-K+-ATPase，鈉鉀

85、ATP酶）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，納米Ti02對(duì)CTR1基因的表達(dá)影響不顯著，而對(duì)其他相關(guān)基因表達(dá)有著較明顯的影響，并且對(duì)不同基因的表達(dá)的影響呈多樣性。本研究旨為深入研究魚(yú)類基因表達(dá)與重金屬解毒分子機(jī)制間的關(guān)系，以及為研究納米材料毒理奠定基礎(chǔ)。</p><p>　　關(guān)鍵詞： 納米TiO2；肝損傷；基因表達(dá)</p><p>　　Abstract: To investigate the express

86、ion of zebra fish (Danio rerio) gene related to liver injury under the influence of Nano-TiO2 particles. Using Nano-TiO2 particles with concentration of 5.6mg·L-1 to feed zebra fish and Using Semi-quantitative RT-PC

87、R technology to analysis the expression of associated genes in different time (6h, 12, 24h, 48h, 72h). In total, HSP70 (heat shock protein), HIF (hypoxia inducible factor), CTR1 (copper transporter 1), MTF-1(metal-respon

88、sive transcription factor-1) </p><p>　　Keywords: Nano-TiO2; liver injury; gene expression</p><p><b>　　1 引言</b></p><p>　　納米是英文namometer的譯音，是一個(gè)物理學(xué)上的度量單位，1納米是1米的十億分之一，相當(dāng)于45

89、個(gè)原子排列起來(lái)的長(zhǎng)度。當(dāng)物質(zhì)到達(dá)納米尺度以后，大約是在1～100納米這個(gè)范圍內(nèi)，物質(zhì)的性能就會(huì)發(fā)生突變，出現(xiàn)特殊性能。這種具不同于原來(lái)組成的原子、分子，也不同于宏觀的物質(zhì)的特殊性能所構(gòu)成的材料，即為納米材料[1]。</p><p>　　納米TiO2（Nano-TiO2，簡(jiǎn)稱n-TiO2）作為應(yīng)用廣泛的納米材料之一，其應(yīng)用范圍從民眾日用品牙膏，防曬霜到工業(yè)品如油漆、涂料、傳感器以及污水處理等眾多領(lǐng)域[2]。納米Ti

90、O2的加入，對(duì)原物質(zhì)的理化性質(zhì)也會(huì)產(chǎn)生很大的影響[3]，所以，隨著對(duì)納米材料研究的深入，應(yīng)用范圍在不斷拓寬，對(duì)人類的影響也在日益擴(kuò)大。</p><p>　　隨著納米TiO2被不斷的應(yīng)用于相關(guān)產(chǎn)業(yè)，其對(duì)人類造成的危害也凸顯了出來(lái)。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，納米TiO2對(duì)生物肺上皮細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性影響是比較嚴(yán)重的，可以導(dǎo)致各種心血管與呼吸道疾病[4]。</p><p>　　斑馬魚(yú)（Danio re

91、rio）又名藍(lán)條魚(yú)、花條魚(yú)、斑馬擔(dān)尼魚(yú)，是一種熱帶觀賞魚(yú)，屬鯉科短擔(dān)尼爾屬。原產(chǎn)于印度、孟加拉國(guó)[5]。斑馬魚(yú)容易獲得，易于飼養(yǎng)，生殖周期短，繁殖能力強(qiáng)，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，基因組和其它許多方面都與人類有著極大的相似性。斑馬魚(yú)的特點(diǎn)使其在20世紀(jì)70年代開(kāi)始受到科學(xué)家們的關(guān)注，并成為最重要的模式脊椎動(dòng)物之一[6]。</p><p>　　目前對(duì)生物體內(nèi)組織損傷相關(guān)基因的研究取得了很大的進(jìn)展。如HSP70（heat shock

92、 protein 70，熱休克蛋白70），它是一組廣泛存在于微生物和動(dòng)植物體內(nèi)的生物進(jìn)化中高度保守的多肽蛋白。由于此類蛋白的合成與熱休克反應(yīng)有關(guān)，所以命名為熱休克蛋白（heat shock protein）。除高熱之外，多種應(yīng)激原如重金屬、饑餓、缺氧缺血等都可以誘導(dǎo)HSP的表達(dá)[7]。</p><p>　　HIF (hypoxia inducible factor，低氧誘導(dǎo)因子)，是一種分布和作用十分廣泛的真核細(xì)

93、胞轉(zhuǎn)錄因子，可以被多種胞外刺激活化、上調(diào)影響細(xì)胞存活、生長(zhǎng)分化以及凋亡的基因表達(dá)，具有重要的生理和病理作用。今年來(lái)，由于人為地向水體中排放過(guò)量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)，水體富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重，導(dǎo)致缺氧現(xiàn)象頻繁發(fā)生。HIF作為低氧相關(guān)基因調(diào)控中重要的核心轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)成為相關(guān)研究中的重點(diǎn)[8]。</p><p>　　CTR1（copper transporter 1，銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），CTR1蛋白是銅離子攝入蛋白，是銅進(jìn)入細(xì)胞

94、的關(guān)鍵運(yùn)輸工具，其表達(dá)量的多少直接關(guān)系到機(jī)體銅代謝的平衡[9]。相關(guān)研究表明，CTR1可能與機(jī)體其他金屬代謝平衡有一定關(guān)系[10]。</p><p>　　此外，MTF-1（metal-responsive transcription factor-1，金屬反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子）和NKA（Na+-K+-ATPase，鈉鉀ATP酶）都是細(xì)胞損傷相關(guān)蛋白，在細(xì)胞損傷調(diào)控機(jī)制中有著很重要的地位[11]。</p>&

95、lt;p>　　盡管對(duì)魚(yú)類，人類腫瘤細(xì)胞中的相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控已經(jīng)有了深入的研究，證明了相關(guān)基因的重要作用及調(diào)控過(guò)程[12]。但是對(duì)于納米材料對(duì)生物組織損傷相關(guān)基因表達(dá)的報(bào)道尚不多。斑馬魚(yú)作為一種重要的模式生物，研究納米TiO2對(duì)其肝損傷相關(guān)基因的表達(dá)是有非常重要的意義的。本實(shí)驗(yàn)以藍(lán)色斑馬魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)材料，采用one-step RT-PCR技術(shù)檢測(cè)斑馬魚(yú)肝損傷相關(guān)基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不僅可以為斑馬魚(yú)肝損傷相關(guān)基因表達(dá)的分子機(jī)制提

96、供參考，還可以為納米材料對(duì)生物的傷害研究提供一定的依據(jù)，具有重要的理論和實(shí)際意義。</p><p><b>　　2 材料與方法 </b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　2.1.1 動(dòng)物材料</p><p>　　斑馬魚(yú)（Danio rerio），購(gòu)自寧波天勝

97、花鳥(niǎo)市場(chǎng)，體型大小相似，長(zhǎng)約3.5cm，健康，活力正常。</p><p>　　2.1.2 主要試劑</p><p>　　納米TiO2：購(gòu)于杭州大洋納米新材料有限公司；</p><p>　　Bizol RNA提取試劑盒：購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；</p><p><b>　　異丙醇；</b></p>

98、<p><b>　　氯仿（三氯甲烷）；</b></p><p><b>　　75%乙醇；</b></p><p>　　TaKaRa PrimeScript@ One Step RT-PCR Kit Ver.2: 購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；</p><p>　　Ribonuclease Inhibitor

99、（核糖核酸酶抑制劑）；</p><p><b>　　DEPC-H2O；</b></p><p>　　KMnO4（高錳酸鉀）；</p><p>　　DNA Marker，6×Loading Buffer：購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。</p><p>　　2.1.3 主要設(shè)備</p><p&

100、gt;　　SW-CJ-3FD型雙人單面凈化工作臺(tái)；</p><p>　　裝備控溫裝置及充氣的魚(yú)缸；</p><p>　　NEOFUGE-15R型高速冷凍離心機(jī)；</p><p>　　AB104-N型電子分析天平；</p><p><b>　　超聲波振蕩儀；</b></p><p>　　JunYi

101、600+雙控電泳儀；</p><p>　　PX2 Thermal Cycler PCR自動(dòng)分析儀；</p><p><b>　　液氮罐；</b></p><p>　　Alpha Imager 2200凝膠圖像處理系統(tǒng)；</p><p>　　Thermo nanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)。</p>

102、<p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 斑馬魚(yú)的馴養(yǎng)</p><p>　　將購(gòu)買來(lái)的斑馬魚(yú)在去氯離子水中馴養(yǎng)。調(diào)節(jié)魚(yú)缸內(nèi)溫度為28℃左右，于每天09:00和17:00按斑馬魚(yú)體重的5%-10%的量投放飼料。調(diào)節(jié)投放飼料量以使斑馬魚(yú)健康的生長(zhǎng)。2-3天換水一次，每次大約換去缸內(nèi)2/3的水。每天觀察并作記錄，檢查缸內(nèi)溫度及充

103、氣裝備是否正常，清潔魚(yú)缸。</p><p>　　2.2.2 斑馬魚(yú)的染毒處理</p><p>　　馴養(yǎng)兩周后，取25尾大小相似，身體健壯的斑馬魚(yú)，投放于放有20L去氯離子水的魚(yú)缸中飼養(yǎng)。稱取0.112g的納米TiO2顆粒，放于燒杯中。用200ml的去氯離子水溶解，置于超聲波振蕩儀中振蕩約30min后觀察。若TiO2顆粒均勻的分散于溶液中，溶液顏色均勻，燒杯底部無(wú)沉淀。將溶液倒入魚(yú)缸中，對(duì)斑

104、馬魚(yú)進(jìn)行染毒處理。染毒時(shí)間持續(xù)72h，在第6h，12h，24h，48h，72h各取5尾魚(yú)，提取斑馬魚(yú)肝放入液氮中凍存，備用。</p><p>　　2.2.3 斑馬魚(yú)總RNA的提取</p><p>　　2.2.3.1 使用Biozol試劑提取RNA</p><p>　　按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作：</p><p>　　將提取的肝組織在已用液氮

105、預(yù)冷的研缽中研磨，直至組織被研磨至粉末。將1ml的Bizol加入研缽中進(jìn)行裂解。</p><p>　　將裂解液靜置約30min，待裂解液完全溶化后，用RNA專用槍頭吸入EP管中，在室溫下放置15-20min。</p><p>　　加入200ul的氯仿，蓋緊管蓋，劇烈震蕩混勻30s。再于冰上孵育15min。臺(tái)式高度冷凍離心機(jī)上，于4℃，12000r/min條件下離心15min。RNA存在于離

106、心后混合物的上清層中。將上清液轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中，加入等體積冰浴的異丙醇，緩慢混勻，用以沉淀RNA。</p><p>　　將樣品在-20℃條件下孵育20min以上。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)上，以4℃，12000r/min條件離心10min。RNA沉淀膠狀形成于管底或者管壁上。</p><p>　　小心棄去上清液，防止RNA沉淀丟失。用冰浴的75%的乙醇洗滌兩次，顛倒洗滌管壁，漩渦振蕩樣品

107、。使RNA沉淀懸浮。4℃，12000r/min下離心5min，小心棄去上清液，防止RNA沉淀丟失。晾干RNA沉淀。</p><p>　　用50ul DEPC-H2O溶解沉淀，并加入0.5ul的RNA酶抑制劑。放于-40℃冰箱保存。</p><p>　　2.2.3.2 總RNA完整性檢測(cè)</p><p>　　采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性。取5ul已處理好的總R