nac對(duì)壇紫菜高溫脅迫下hsp70基因表達(dá)的影響【開題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報(bào)告</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　NAC對(duì)壇紫菜高溫脅迫下hsp70基因表達(dá)的影響</p><p>　　一、選題的背景與意義</p>

2、<p>　　紫菜，英文名：laver，是紅藻門(Rhodophyta)原紅藻綱(Protoflorideophyceae)紅毛菜目(Bangiales)紅毛菜科(Bangiaceae)紫菜屬(Porphyra)的統(tǒng)稱。紫菜營養(yǎng)價(jià)值高，是重要的食品、藥物、工業(yè)化工原料的來源。廣泛分布于世界各地，但以溫帶為主。自然生長(zhǎng)的紫菜數(shù)量有限，產(chǎn)量主要來自人工養(yǎng)殖。壇紫菜(Porphyra haitanensis)、條斑紫菜(P. ye

3、zoensis) 和甘紫菜(P. tenera)是主要的養(yǎng)殖種類。近年來由于環(huán)境惡化而導(dǎo)致的全球海洋溫度升高已經(jīng)嚴(yán)重威脅著藻類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。紫菜生活的特殊的環(huán)境使其有著獨(dú)特的抗逆機(jī)制。深入了解紫菜的抗逆機(jī)理對(duì)全面紫菜健康養(yǎng)殖并進(jìn)行紫菜抗逆品種培育有重要意義（楊銳等，2007）。另外，紫菜抗逆性的應(yīng)用研究也有待深入，開發(fā)和研制適用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的高效自由基清除劑，以減輕活性氧在逆境脅迫中對(duì)紫菜的傷害而提高其抗逆性，有著廣泛前景。</

4、p><p>　　環(huán)境脅迫能誘導(dǎo)植物抗逆蛋白：熱激蛋白、抗氧化酶等活性的變化，究其本質(zhì)是逆境誘導(dǎo)植物抗逆基因表達(dá)變化的結(jié)果，檢測(cè)不同環(huán)境脅迫導(dǎo)致不同的抗逆基因的表達(dá)有助于了解植物抗逆本質(zhì)。mRNA水平上的定量檢測(cè)是反映某個(gè)抗逆蛋白合成、調(diào)控的最直接可靠及靈敏的途徑，不但可彌補(bǔ)傳統(tǒng)酶活性測(cè)定精確度不高的缺陷，而且有助于準(zhǔn)確和全面了解其各種同工酶表達(dá)和發(fā)揮功能的差異。</p><p>　　以往的研究

5、中，檢測(cè)基因表達(dá)水平的方法有Northern雜交、RNase保護(hù)分析、原位雜交等多種方法，但這些方法無法對(duì)mRNA進(jìn)行精確定量，上世紀(jì)90年代中期誕生的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR）技術(shù)解決了這些問題，實(shí)現(xiàn)了mRNA從定性到定量的飛躍，使得從轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平上精確研究基因的表達(dá)成為了可能。并且以其定量準(zhǔn)確、檢測(cè)范圍寬（1～1011拷貝）、敏感度高（<5拷貝）、精確度

6、高（CV< 2%）、無PCR后處理步驟、產(chǎn)出率高、可進(jìn)行多重檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，使其在基礎(chǔ)研究和分子診斷領(lǐng)域廣受青睞。</p><p>　　N-乙酰半胱氨酸(N-acelylcysteine，NAC) 是L-半胱氨酸的乙?；衔铮且环N含巰基的廣譜型抗氧化物，在細(xì)胞內(nèi)去乙?；笊砂腚装彼?，提供合成細(xì)胞內(nèi)重要的非酶類抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽( GSH) 的底物，維持細(xì)胞內(nèi)GSH水平，穩(wěn)定細(xì)胞膜，保護(hù)細(xì)胞活性。NAC 也

7、可通過形成巰中心自由基及其后的繼發(fā)反應(yīng)，有效清除自由基，保護(hù)細(xì)胞免受ROS損害（于敏，李永春，2010）。此外，NAC由于在體內(nèi)能激活體內(nèi)鳥苷酸環(huán)化酶，升高血漿環(huán)磷酸鳥苷酸(cGMP)水平（潘紅英，2004），故能作為NO分子載體 增加體內(nèi)NO的生物利用度，發(fā)揮NO生理效應(yīng)，促進(jìn)收縮的微循環(huán)血管擴(kuò)張，有效增加血液對(duì)組織氧輸送和釋放，糾正組織缺氧，防止細(xì)胞進(jìn)一步壞死。目前，NAC在呼吸、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)和AIDS的臨床和實(shí)驗(yàn)研究中均有廣泛

8、應(yīng)用（鮑紅榮，童立力，2008）。</p><p>　　已有研究報(bào)道，NAC作用于一些動(dòng)物組織或器官后能夠明顯增強(qiáng)其抗氧化能力，表現(xiàn)為體內(nèi)毒性物質(zhì)減少、SOD活性增強(qiáng)等?？梢栽O(shè)想，NAC作為一種廣譜型的抗氧化劑氧化作用的研究卻很少有報(bào)道，至于其作用機(jī)理及效果均未了解。</p><p>　　HSP70和SOD是重要的抗逆蛋白，重金屬（鎘和銅）、溫度、pH、光照、除草劑等都可能誘導(dǎo)它們差異的表

9、達(dá)，來適應(yīng)其環(huán)境條件的變化。在本研究中，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究NAC對(duì)壇紫菜高溫脅迫下hsp70或Mn-sod基因表達(dá)的影響，旨在為從分子水平上研究NAC對(duì)紫菜抗逆性的影響及作用機(jī)理，為進(jìn)一步研究紫菜耐高溫脅迫機(jī)理及NAC在紫菜養(yǎng)殖方面的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p><b>　　研究的基本內(nèi)容：</b>

10、</p><p>　　本課題擬應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究NAC對(duì)壇紫菜高溫脅迫下hsp70或Mn-sod基因表達(dá)的影響，從分子水平上探討NAC對(duì)紫菜抗逆性的影響及作用機(jī)理。</p><p><b>　　擬解決的主要問題：</b></p><p>　　實(shí)時(shí)定量PCR 條件優(yōu)化</p><p>　　NAC 對(duì)紫菜熱激條件

11、下hsp70或Mn-sod基因表達(dá)的影響</p><p><b>　　紫菜熱激條件</b></p><p>　　NAC 作用濃度篩選</p><p>　　NAC保護(hù)下hsp70或Mn-sod基因的表達(dá)</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p><b>　　（一）研究

12、方法：</b></p><p>　　采用試劑盒提取壇紫菜總RNA、RT-PCR成cDNA；</p><p>　　設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增目的基因并連接、轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，用PCR、測(cè)序等方法鑒定陽性克隆。</p><p>　　制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立SYBR Green Real Time PCR方法，優(yōu)化Real Time PCR條件。</p>&l

13、t;p>　　對(duì)壇紫菜進(jìn)行熱激（35℃）及NAC（濃度5mmol/L）處理后提取總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。</p><p>　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析hsp70或Mn-sod基因的相對(duì)表達(dá)及NAC作用結(jié)果。</p><p><b>　?。ǘ┘夹g(shù)路線：</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度：</p><

14、;p>　　2010.08-2010.09 查閱文獻(xiàn)，熟悉實(shí)驗(yàn)操作。進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　2010.10-2010.11 完成開題報(bào)告及任務(wù)書，制定具體研究計(jì)劃和試驗(yàn)方案。</p><p>　　2010.12-2011.02 建立SYBR Green Real Time PCR方法、提取各處理樣品總RNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。</p><p>

15、;　　2011.02-2011.03 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和材料整理、分析及對(duì)整個(gè)試驗(yàn)的補(bǔ)充、完善。</p><p>　　2011.04-2011.05 完成2篇外文翻譯，撰寫論文，結(jié)題、答辯。</p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] 鮑紅榮,童立力. N一乙酰半胱氨酸的藥理作用及其臨床應(yīng)用[J].浙江臨床醫(yī)學(xué)，

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28、anica ,2007 ,29 (3) :355-365. </p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　藻類耐高溫脅迫分子機(jī)理的研究進(jìn)展</p><p>　　摘要：藻類生活的特殊的水體環(huán)境使其有著獨(dú)特的抗逆機(jī)制。近年來由于

29、環(huán)境惡化而導(dǎo)致的全球海洋溫度升高已經(jīng)嚴(yán)重威脅著藻類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本文從活性氧脅迫及抗氧化系統(tǒng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)和熱激蛋白三個(gè)方面對(duì)藻類耐高溫脅迫的分子機(jī)理做了綜述，并介紹了相關(guān)方面的最新研究成果，以期為今后關(guān)于這方面的研究提供參考。</p><p>　　關(guān)鍵詞：藻類；高溫脅迫；活性氧（ROS）；分子機(jī)理</p><p>　　以紫菜、海帶為代表的大型經(jīng)濟(jì)海藻不但維持著海洋生態(tài)系統(tǒng)的平衡，而且

30、是重要的食品、藥物、工業(yè)化工原料的來源，藻類栽培業(yè)作為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的支柱之一，近年來由于環(huán)境惡化而導(dǎo)致的全球海洋溫度升高已對(duì)其健康發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅。究其本質(zhì)，是由于高溫脅迫引發(fā)了藻類一系列生理生化變化，最后導(dǎo)致整個(gè)植株質(zhì)變，并走向死亡。深入了解藻類的耐高溫機(jī)理對(duì)全面藻類健康養(yǎng)殖并進(jìn)行抗逆品種培育有著重要意義。</p><p>　　在植物中的大量研究表明，活性氧脅迫及抗氧化系統(tǒng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、熱激蛋白等在植物高

31、溫脅迫應(yīng)答過程中起重要作用，藻類中也有相關(guān)研究報(bào)道，楊銳等（2007）研究了壇紫菜的耐高溫機(jī)理，推測(cè)其對(duì)熱脅迫應(yīng)答的可能模式為:熱脅迫→活性氧(ROS)上升→細(xì)胞感受到過量的ROS信號(hào)，并傳遞、轉(zhuǎn)導(dǎo)→滲透壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)和自由基清除非酶促保護(hù)系統(tǒng)迅速反應(yīng)，并伴隨hsp70等功能基因的表達(dá)。</p><p>　　1 活性氧脅迫及抗氧化系統(tǒng)</p><p>　　有氧代謝是大多數(shù)植物生存所必須的，植物

32、將氧氣還原成水，為植物的生長(zhǎng)和發(fā)育提供能量。但還原過程不完全時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生一類化學(xué)性質(zhì)活潑，氧化能力極強(qiáng)的含氧物質(zhì)：H2O2、單線態(tài)氧和羥自由基等，即通常說的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）。ROS是所有需氧生物代謝過程中不可避免的產(chǎn)物。在正常生長(zhǎng)條件下，植物細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)外界條件如溫度、鹽度等急劇變化時(shí)，這種平衡就會(huì)被破壞，致使活性氧自由基大量積累，進(jìn)一步形成氧化損傷，

33、隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，有可能導(dǎo)致植株死亡。從本質(zhì)上講，活性氧代謝的失調(diào)是植物逆境傷害的共同機(jī)理之一（Mahalingam and Fedoroff, 2003）。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，植物自身形成了一整套完備的ROS防護(hù)機(jī)制，從而免于被ROS傷害，這就是植物抗氧化系統(tǒng)，包括酶促和非酶促兩類。在植物的抗逆研究中，越來越多的學(xué)者將目光轉(zhuǎn)移到抗氧化系統(tǒng)的研究。</p><p>　　1.1 酶促抗氧化系統(tǒng)</p>

34、<p>　　植物體內(nèi)酶促抗氧化系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、還原型抗壞血酸過氧化物酶（ASP）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽還原酶（GR）等。SOD在ROS的清除系統(tǒng)中發(fā)揮著特別重要的作用，是植物體內(nèi)清除ROS系統(tǒng)的第一道防線，在保護(hù)系統(tǒng)中處于核心的地位（馬旭俊，朱大海，2003）。其主要功能是清除O2－，催化反應(yīng)為：2O2－+2H→ H2O2 +O2。CAT和PO

35、D清除生物體內(nèi)的H2O2，其催化反應(yīng)為：2 H2O2→2 H2O+O2。GPX構(gòu)成了利用谷胱甘肽來減少H2O2、脂質(zhì)氫過氧化物和其他氫過氧化物的另一個(gè)酶家族。抗壞血酸過氧化物酶（APX），脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reduce tase，MDAR），單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbate reductase，MDAR）和谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）

36、，以及2種小分子量的物質(zhì)（AsA和谷胱甘肽）共同組成葉綠體中的抗壞血酸（AsA）/谷胱甘肽循環(huán)，是清除活性氧的主要系統(tǒng)。此外，還有硫氧還蛋白和硫氧</p><p>　　1.2非酶促抗氧化系統(tǒng)</p><p>　　非酶促抗氧化系統(tǒng)主要是指植物體內(nèi)所含的抗氧化物質(zhì)。目前，發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)抗氧化物質(zhì)主要包括抗壞血酸（ASA），α-生育酚（VE）、維生素C、甘露醇、還原性谷胱甘肽（GSH）、類胡蘿卜素

37、等。這些物質(zhì)既可直接同ROS反應(yīng)，將其還原，又可作為酶的底物在ROS的清除中發(fā)揮重要作用（杜秀敏等，2001）?？箟难岷凸入赘孰膮⑴c了植物細(xì)胞中抗氧化劑的再生過程。還原型谷胱甘肽作為還原劑參與抗壞血酸的再生，產(chǎn)生的氧化型谷胱甘肽可以通過谷胱甘肽還原酶得到還原?？箟难釀t在α-生育酚和玉米黃質(zhì)的再生循環(huán)中充當(dāng)還原劑。維生素C能有效地清除O2H和H2O2，提高SOD和POD活性，類胡蘿卜素是植物體內(nèi)最重要的O2-猝滅劑，從而保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)

38、，特別是葉綠體光合膜系統(tǒng)。</p><p>　　1.3藻類抗氧化系統(tǒng)研究進(jìn)展</p><p>　　由于目前的研究多集中在高等植物上，對(duì)海藻的研究則相對(duì)較少，但是，藻類的活性氧清除機(jī)理和高等植物極其相似，因此，高等植物的抗氧化研究同樣適用于藻類。謝榮等（2001）檢測(cè)了ROS對(duì)3種海洋微藻生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度的ROS可以提高藻細(xì)胞的SOD活性，說明其可能試圖通過增加SOD等抗氧化系統(tǒng)成分來

39、削弱ROS的影響。王悠等（2005）比較了兩個(gè)海帶品系耐高溫海帶901和熱敏感海帶榮成1號(hào)的抗氧化系統(tǒng)與耐熱性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)901（耐高溫海帶）的抗氧化系統(tǒng)能對(duì)高溫脅迫做出積極響應(yīng)，從而提高其耐熱性。王榮等（2006）克隆了條斑紫菜Mn-SOD的cDNA和基因序列，經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)其與萊茵衣藻和海鏈藻的親緣關(guān)系較近，并推測(cè)其可能在紫菜抗逆過程中起重要作用。郝林華等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，南極冰藻Chlorophyceae L4在環(huán)境溫度高

40、于最適生長(zhǎng)溫度時(shí)各種與代謝相關(guān)的抗氧化酶系統(tǒng)的活性大幅度提高，顯示出較高的抗高溫脅迫能力。</p><p>　　2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與高溫脅迫</p><p>　　2.1 ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)</p><p>　　ROS除了導(dǎo)致細(xì)胞的傷害以外， 還可以在植物細(xì)胞中作為一種普遍存在的信號(hào)分子起作用。ROS信號(hào)傳遞是通過其產(chǎn)生和清除實(shí)現(xiàn)的。誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS的酶定位于細(xì)胞的不同區(qū)室，

41、而酶的激活由刺激物的特點(diǎn)及感知路線決定。ROS爆發(fā)的最初部位、持續(xù)時(shí)間及強(qiáng)度差異會(huì)導(dǎo)致次級(jí)信號(hào)的化學(xué)性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、壽命及強(qiáng)度的不同（Mahalingam and Fedoroff, 2003）。質(zhì)膜NADPH氧化酶(NADPH oxidase)被認(rèn)為是是植物產(chǎn)生ROS的關(guān)鍵酶。ROS作為一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，啟動(dòng)了ROS清除系統(tǒng)以及抗脅迫基因系統(tǒng)的表達(dá)（Xu等，2007）。研究表明，植物在熱脅迫下，ROS作為信號(hào)分子能夠誘導(dǎo)熱激蛋白（H

42、SP）的合成，但是ROS如何調(diào)控HSP的表達(dá)目前并不清楚（Sachin等，2007）。</p><p>　　ROS作為通用信號(hào)分子可能源于它們被用來感知脅迫。大部分生物及非生物脅迫擾亂了細(xì)胞中的代謝平衡，導(dǎo)致產(chǎn)生過量ROS。不同發(fā)育或是環(huán)境信號(hào)流入ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)并擾亂ROS的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。ROS信號(hào)的改變被各種蛋白質(zhì)、酶或受體感知，進(jìn)而調(diào)節(jié)相應(yīng)的發(fā)育、代謝及防御途徑。近年來，對(duì)擬南芥的研究揭示了ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中

43、的一些關(guān)鍵組分。雖然目前感知ROS的受體尚未發(fā)現(xiàn)，但人們推測(cè)植物細(xì)胞至少存在三種不同的機(jī)制感知并轉(zhuǎn)導(dǎo)ROS信號(hào)：（i）未被鑒定的受體蛋白；（ii）對(duì)氧化還原反應(yīng)敏感的轉(zhuǎn)錄因子，例如NPR1或者HSFs；（iii）被ROS直接抑制的磷酸酶。（Mittler等，2004；Apel and Hirt, 2004）。藥理學(xué)及遺傳學(xué)研究表明，ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中可能存在另一條由NADPH氧化酶介導(dǎo)的正放大回路（Dat等，2003）。這一回路可被低水平

44、的ROS激活，導(dǎo)致細(xì)胞特定部位ROS信號(hào)的產(chǎn)生和放大；而細(xì)胞中ROS過量積累又會(huì)激活ROS清除路徑，從而降低細(xì)胞特定部位或整個(gè)細(xì)胞的ROS水平，這是一條反饋抑制回路。目前對(duì)ROS信號(hào)途徑的了解還很有限，也是研究熱點(diǎn)。</p><p>　　2.2 Ca2 +信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)</p><p>　　Ca2 + 是植物細(xì)胞中的主要胞內(nèi)信使，許多外界信號(hào)(包括各種環(huán)境刺激、胞間化學(xué)信號(hào)、物理信號(hào)等) 經(jīng)其受

45、體進(jìn)行跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)， 調(diào)節(jié)Ca2 + 的分布及其在特定部位的瞬間變化而產(chǎn)生鈣離子信號(hào)，鈣離子信號(hào)進(jìn)而影響其靶蛋白活性，從而調(diào)控基因表達(dá)及生理反應(yīng)（林忠平，2000）。Torrecilla等（2000）檢測(cè)了魚腥藻( Anabaena sp . PCC7120) 細(xì)胞內(nèi)的游離Ca2 + 濃度，發(fā)現(xiàn)熱激20 min細(xì)胞內(nèi)的游離Ca2 + 濃度達(dá)到最大值，升高的Ca2 + 既來自于細(xì)胞外又來自于細(xì)胞內(nèi)。CaM 是植物細(xì)胞中Ca2 +最重要的受

46、體蛋白，是Ca2 + 參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要成員。CaM結(jié)合Ca2 +后分子構(gòu)象發(fā)生改變，其疏水區(qū)呈激活態(tài)后能與多種靶蛋白結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶蛋白的活性。CaM在具有高度保守性，目前已鑒定的植物鈣調(diào)素與藻類的相似性為84 %～100 %（夏快飛，梁承鄴，葉秀粦，2005） 。 </p><p>　　2.3 HSF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)</p><p>　　熱激轉(zhuǎn)錄因子( HSF) 是細(xì)胞內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

47、因子，在熱激條件下可以激活熱激基因的表達(dá)。HSF在本質(zhì)上是具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的蛋白質(zhì)，其在熱應(yīng)激反應(yīng)中的主要功能，是在熱激基因的表達(dá)過程中與相應(yīng)啟動(dòng)子結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過程，最終促進(jìn)熱激蛋白(HSP)的表達(dá)。在熱激基因的啟動(dòng)子中有一小段特異的DNA識(shí)別序列，它是HSF的結(jié)合位點(diǎn)，被稱為熱激元件( HSE)，HSF被激活后與HSE結(jié)合會(huì)啟動(dòng)熱激基因的表達(dá)。HSE是一種順式元件，包括TATA盒近端HSE和TATA盒遠(yuǎn)端的HSE。實(shí)驗(yàn)表明，不

48、同種類的HSF受到激活的信號(hào)不同，但其中的機(jī)制還有待研究。植物中存在多種HSF，在藻類中，發(fā)現(xiàn)綠藻Ostreococcus tauri 中有1種HSF，萊茵衣藻中有2種HSF，單細(xì)胞紅藻Cyanidioschyzon merolae中有3種HSF，其中萊茵衣藻中的HSF1已被證實(shí)受高溫誘導(dǎo)，通過RNAi抑制HSF1基因的藻株對(duì)熱敏感，而且熱激蛋白HSP70、HSP90、 HSP100等的表達(dá)都受到抑制（Schulz-Raffelt等，2

49、007）。</p><p>　　2.4 MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)</p><p>　　蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化過程是包括植物在內(nèi)的生物體中普遍存在的一種重要調(diào)節(jié)機(jī)制。幾乎涉及所有的生理和病理過程，它在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。MAPKs (mitogen-activited protein kinases) 是一類存在于各種真核生物體中的絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，它與MAPKK (mitogen

50、-activated protein kinase kinase,MAPKK)和MAPKKK (mitogen-activated protein kinase kinase kinase. MAPKKK)組成MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，接受外界刺激信號(hào)，將信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，影響特定基因的表達(dá)，從而影響植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和凋亡等多方面生理過程。當(dāng)生物體遭遇脅迫(如高溫、鹽堿等) 時(shí)，MAPK會(huì)被上游信號(hào)分子激活，再通過對(duì)下游分子絲氨酸、蘇氨

51、酸殘基部位的磷酸化作用，將外界信號(hào)傳遞給細(xì)胞核，調(diào)節(jié)特異基因的表達(dá)（Kovtun等，2000）。Jiménez 等（2004）從高溫、高滲透壓等脅迫條件下的杜氏藻Dunaliella viridis 中分離到了一種大小為57×103的蛋白，經(jīng)驗(yàn)證為</p><p>　　3 熱激蛋白與高溫脅迫</p><p>　　熱激蛋白HSP(Heat Shock Proteins)，

52、最初被定義為是生物有機(jī)體受熱脅迫下誘導(dǎo)合成的一類應(yīng)激蛋白（Sachin等，2007）。當(dāng)生物體受到高溫脅迫時(shí)，會(huì)新合成或增強(qiáng)合成熱激蛋白，參與生物體內(nèi)新生肽的運(yùn)輸、折疊、組裝、定位以及變性蛋白的復(fù)性和降解，緩解高溫脅迫造成的傷害，產(chǎn)生抗熱性。近年來的研究表明：除高溫外，其他環(huán)境脅迫（如低溫、干旱、高滲透壓及重金屬等環(huán)境因素）也可以誘導(dǎo)HSP的產(chǎn)生。HSPs 超家族包括在各種生物中大量不同分子量的HSPs : HSP100(Clp) 、H

53、SP90 、HSP70 (Dna K) 、HSP60 ( Gro EL) ，還有一組分子量在16000 ～ 40000之間的小HSPs。另外，正常條件下生活的細(xì)胞中也有HSP，這類HSP是組成型表達(dá)的，稱為HSC(Heat Shock Cognate Protein)。</p><p>　　Furuki 等（1996）在聚球藻Synechococcus vulcanus 中克隆到了HSP60（gro EL）基因，

54、在熱激條件下，該基因的轉(zhuǎn)錄數(shù)可增長(zhǎng)幾倍。Bierkens等（1998）證明環(huán)境中不同的pH、溫度、胡敏酸（humic acid）、硝酸鹽、磷酸鹽等都會(huì)誘導(dǎo)藻（Raphidocelis subcapitata）hsp70的瞬時(shí)表達(dá)，其中溫度、pH刺激可能會(huì)提高該藻的抗逆性。藍(lán)藻中的Dna K蛋白與植物中的線粒體和質(zhì)體的HSP70同源性較高，Nimura等（2001）發(fā)現(xiàn)聚球藻Synechococcus sp . PCC7942. 中的Dn

55、a K蛋白家族有三種蛋白Dna K1，Dna K2和Dna K3，其中Dna K2對(duì)熱脅迫反應(yīng)敏感，而Dna K1和Dna K3在熱脅迫下無轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)的現(xiàn)象，推測(cè)Dna K2可能與熱應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。Ireland等（2004）發(fā)現(xiàn)高溫42℃的脅迫下，2h時(shí)墨角藻（Fucus serra tus）hsp70表達(dá)量最大，4h時(shí)浮萍（Lemna minor）hsp70表達(dá)最豐富。姜國忠等（2005）從鹽藻(Dunaliella salina)&l

56、t;/p><p><b>　　4 結(jié)語</b></p><p>　　藻類生活的特殊的水體環(huán)境使其必然具有一些不同于陸生植物的特殊功能蛋白、功能因子、信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控機(jī)制等，但是我們目前對(duì)此認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，尤其對(duì)于藻類細(xì)胞如何感受脅迫、如何將脅迫信號(hào)傳遞到細(xì)胞中誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)并調(diào)控下游功能基因的表達(dá)等一系列的分子機(jī)理都還知之甚少。深入研究藻類高溫脅迫的應(yīng)答機(jī)制，了解其

57、耐高溫機(jī)理，對(duì)于促進(jìn)藻類的健康養(yǎng)殖和耐高溫品種選育等都具有重要意義。另外，藻類抗逆性的應(yīng)用研究也有待深入，應(yīng)盡快研制適用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的高效自由基清除劑，以減輕活性氧在逆境脅迫中對(duì)藻類的傷害，從而提高海藻的抗逆性。</p><p>　　隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，關(guān)于植物逆境脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)的基因、信號(hào)的傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控、逆境脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及抗逆脅迫的基因工程研究已經(jīng)越來越深入，為了解植物對(duì)不同逆境響應(yīng)的分子機(jī)理

58、及研究人工調(diào)控生物技術(shù)等方面展示出良好的前景。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 杜秀敏，殷文璇，趙彥修等. 植物中活性氧的產(chǎn)生及清除機(jī)制[J]. 生物工程學(xué)，2001，3： 121-125.</p><p>　　[2] 郝林華，孫丕喜，王能飛等. 南極冰藻Chlorophyceae L4 抗氧化酶活性對(duì)

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79、 Acta Botanica Yunnanica, 2007, 29 (3): 355-365.</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　NAC對(duì)壇紫菜高溫脅迫下hsp70基因表達(dá)的影響</p><p><b&

80、gt;　　目錄</b></p><p>　　1 引言……………………………………………….....……………………………………...................………… 1</p><p>　　2 材料與方法……………………………………………......……………………...................……………...…… 2</p><p>　

81、　2.1 實(shí)驗(yàn)材料………………………………………..............................……...................…………………….... 2</p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品…………...……………………..……………………………...................…………………2</p><p>　　2.1.2 菌株和載體…………………..

82、.………………........………………………...................……………. 2</p><p>　　2.1.3 試劑和試劑盒………………...………………………………...................…………………………. 2</p><p>　　2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器………………………...…………………………………...................…………

83、…………. 2</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法………………………………………………………...........…………......................…………… 2</p><p>　　2.2.1 壇紫菜總RNA的提取…………………………………………...……….…...................…………. 2</p><p>　　2.2.2

84、 第一鏈cDNA的合成………………………………………….............……...................….………. 3</p><p>　　2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)……………………………………..............……...................…… 3</p><p>　　2.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建…………………………

85、………..……….…...................……3</p><p>　　2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)樣品…………………………………………..………...................….……4</p><p>　　3 結(jié)果與分析………………………………………………………………...................………….......………….. 5</p>

86、;<p>　　3.1 組織RNA提取和目的基因片段的制備…………...………………………...................…....…………… 5</p><p>　　3.2 重組質(zhì)粒的鑒定……………………....…………………...............................................................….……. 6</p><

87、;p>　　3.3 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的熒光定量PCR檢測(cè)…….……...…………………...……….................................…...…… 6</p><p>　　3.3.1 擴(kuò)增曲線分析…………....…………………………..…...................................................................... 6<

88、;/p><p>　　3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析…………………………………………...................................................................... 7</p><p>　　3.3.3 溶解曲線分析………………………………………….................................................

89、..................... 8</p><p>　　3.3.4 重復(fù)性檢測(cè)………………………………………….......................................................................... 10</p><p>　　3.4 hsp70基因的差異表達(dá)檢測(cè)結(jié)果…………………..………………….……………....

90、...............………11</p><p>　　3.4.1 實(shí)驗(yàn)樣品擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)參數(shù)…………...….............…………….……………...................………11</p><p>　　3.4.2 不同處理?xiàng)l件下的樣品拷貝數(shù)…….............………...….............……………...................……

91、…12</p><p>　　3.4.3 不同處理?xiàng)l件下hsp70基因的相對(duì)表達(dá)...………..….............……………......................………13</p><p>　　4 討論……………………………………………………………...................………………......………………. 15</p><p>　　4

92、.1 溫度脅迫與hsp70基因的表達(dá)……………………....…...………………....…...……...................…….. 15</p><p>　　4.2 NAC干預(yù)與hsp70基因的表達(dá)…………………………....………………....................................…… 16</p><p>　　4.3 不同處理?xiàng)l件下hsp70

93、基因表達(dá)的相似性………………...………………...............................………. 16</p><p>　　5 結(jié)論……………………………………………………………………………..............................…………… 17</p><p>　　致謝………………………………………………………………………………….......……

94、…...................…… 18</p><p>　　參考文獻(xiàn)……………………………………………………………………………......…...................…………. 18</p><p>　　附錄………………………………………………………………………………...................…….......………… 19</p><

95、;p>　　附錄1：紫菜葉狀體總RNA的提取………………...…...........................…………...........................……… 19</p><p>　　附錄2：DH5α大腸桿菌感受態(tài)的制備……………….......…………......………........................................... 19</p>

96、;<p>　　附錄3：PCR產(chǎn)物的回收……………………………….………………………...…..........................…...…. 19</p><p>　　附錄4：PCR膠回收產(chǎn)物與克隆載體的連接與轉(zhuǎn)化………………………….…......................……....…… 20</p><p>　　附錄5：重組質(zhì)粒的抽提………………..

97、..…………………………………................................................... 20</p><p>　　附錄6：陽性質(zhì)粒的篩選與PCR鑒定………….………………..…………………..............................…..... 20</p><p>　　摘要：活性氧（ROS）代謝的失調(diào)是植物逆境傷害的共同機(jī)理之

98、一。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，以18s為內(nèi)源特異參照基因，對(duì)壇紫菜hsp70基因在高溫脅迫及活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）干預(yù)下的相對(duì)表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：在35℃熱脅迫及5mmol/L NAC處理短時(shí)間（5min）內(nèi)，壇紫菜hsp70基因的表達(dá)都會(huì)迅速升高，隨后繼續(xù)逐漸上升，且都在12小時(shí)時(shí)達(dá)到頂峰，然后又急劇下降；NAC干預(yù)下hsp70基因表達(dá)的上升幅度較熱脅迫大，熱脅迫+NAC干預(yù)下上升幅度最大。該結(jié)果提示5m

99、mol/L NAC可能對(duì)壇紫菜耐高溫脅迫并沒有保護(hù)作用，對(duì)正常壇紫菜細(xì)胞也有一定的毒害作用，而且較熱脅迫要強(qiáng)烈，這可能與外源藥物NAC破壞了正常細(xì)胞內(nèi)的ROS穩(wěn)態(tài)有關(guān)。這種傷害是否由高濃度的NAC引起或者低濃度的NAC是否能保護(hù)壇紫菜細(xì)胞免受ROS損害需要更進(jìn)一步的研究。</p><p>　　關(guān)鍵詞：高溫脅迫；hsp70；N-乙酰半胱氨酸（NAC）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；ROS</p><p&g

100、t;　　Abstract：The imbalance of reactive oxygen species (ROS) metabolism is one of the common reasons for stress injury in plants. In the present study, the expression of hsp70 gene of Porphyra haitanensis under high tempe

101、rature stress and the ROS remover N-acetylcysteine (NAC) treatment were detected by the real-time quantitative PCR technique . The result showed that the level of mRNA expression of hsp70 gene increased rapidly after a s

102、hort period of heat shock (35℃, 5min), so that in the experiment</p><p>　　Keywords: high temperature stress; hsp70; N-acetylcysteine (NAC); real-time quantitative PCR; ROS</p><p><b>　　1 引言

103、</b></p><p>　　壇紫菜（Porphyra haitanensis）是我國最重要的經(jīng)濟(jì)藻種之一，為潮間帶大型藻類的典型代表，生活環(huán)境復(fù)雜多變，具有特殊的抗逆應(yīng)答機(jī)制，是研究藻類抗逆機(jī)理的良好材料。近年來由于海水養(yǎng)殖無節(jié)制擴(kuò)大和工業(yè)發(fā)展造成海水污染以及全球氣候變化等自然和人為因素的影響，越來越多海區(qū)環(huán)境日益惡化，成為逆境，嚴(yán)重威脅著藻類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。深入了解紫菜的抗逆機(jī)理對(duì)全面紫菜健康養(yǎng)