香魚apo ai原核表達(dá)及鑒定【開題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報(bào)告</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　香魚Apo AI原核表達(dá)及鑒定</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><p&g

2、t;　　香魚屬胡瓜魚目香魚科。地方又名香油魚、瓜魚、細(xì)鱗魚、海胎魚、秋生子，日本人稱為鲇魚。是一種中小型名貴魚類，曾被列入“雁蕩五珍”，在亞洲被譽(yù)為“魚中珍品”。因其脊背上有一條滿是香脂的腔道能散發(fā)出濃郁的芳香味而得名。香魚肉質(zhì)細(xì)嫩多脂，清香可口，無魚腥味，比一般魚類口感好，尤其是鳧溪香魚干，早在清代已遠(yuǎn)近聞名。香魚營(yíng)養(yǎng)豐富，其肌肉粗蛋白中含人體必需氨基酸含量高達(dá)68．85％，要比其他淡水魚高出許多。香魚為濾食性魚類，在自然條件下，魚苗

3、主要攝食浮游動(dòng)物和貝類幼體；長(zhǎng)大后以石礫上附生的硅藻、藍(lán)藻及綠藻類為食。人工養(yǎng)殖香魚，蠶蛹、螺肉、剁碎的鮮雜魚蝦及小麥粉、馬鈴薯、黃豆、米糠、青菜等均可作為餌料，也可使用香魚專用餌料或鰻餌料。香魚的分布范圍很廣，除我國(guó)外，日本、朝鮮也有分布。香魚的人工養(yǎng)殖始于日本，中國(guó)的浙江省已有試驗(yàn)，河北省已養(yǎng)殖成功，臺(tái)灣省則較為盛行。</p><p>　　Apo AI是高密度脂蛋白(HDL)的主要組成蛋白，它能與磷脂、多種血

4、漿因子及細(xì)胞受體結(jié)合，可以激活卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶，起著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的移出、酯化、轉(zhuǎn)移以及調(diào)節(jié)HDL代謝的作用。載脂蛋白在脂蛋白代謝中具有重要的生理功能。一般認(rèn)為載脂蛋白至少有下列五方面功能：與脂質(zhì)的親和作用，使脂質(zhì)溶于水性介質(zhì)中；運(yùn)輸膽固醇和甘油三酯；作為脂蛋白外殼的結(jié)構(gòu)成分，它能將各種脂質(zhì)成分（膽固醇、甘油三酯和磷脂）結(jié)合在一起形成一個(gè)整體，與脂蛋白外生物信息相聯(lián)系；以配體的形式作為脂蛋白與特異性受體的連接物；激活某些與血漿脂

5、蛋白代謝有關(guān)的酶類。Apo AI的臨床意義在于它的測(cè)定可以直接反映高密度脂蛋白膽固醇的水平，從而了解冠心病、糖尿病等疾病的嚴(yán)重程度。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p><b>　　研究的基本內(nèi)容：</b></p><p>　　本課題通過構(gòu)建香魚Apo A-I原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 pLys

6、 E進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，為進(jìn)一步基因功能研究奠定基礎(chǔ)。</p><p><b>　　擬解決的問題：</b></p><p>　　香魚Apo AI原核表達(dá)及鑒定。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p><b>　?。ㄒ唬┭芯糠椒?lt;/b></p><p&g

7、t;<b>　　1引物設(shè)計(jì)</b></p><p>　　根據(jù)已獲得香魚Apo A-I基因序列設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物：pApo A-I-1（+）：5'-CCATATGCGTACCTTGCAGGCTGATGA-3'；pApo A-I-1（-）：5'-GGAATTCTTATGCCTTAATGGACTCGCT-3'（下劃線為添加的限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ的識(shí)別序列）

8、。</p><p><b>　　2原核表達(dá)載體構(gòu)建</b></p><p>　　2.1 PCR產(chǎn)物切膠純化</p><p>　　以1.2.1中原核表達(dá)引物配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與10×Laoding Buffer混合，并在1%（w/v）瓊脂糖凝膠中電泳（120V），EB染色后漂洗，紫外燈下觀察，切下預(yù)期大小的目的片段，用E.Z

9、.N.A.TM Gel Extraction Kit（OMEGA）純化，具體方法如下：</p><p>　　1)手術(shù)刀切下含有目的片段的凝膠并置于Eppendorf管中，加300μl Binding Buffer后置55~60℃水浴10min，每隔2~3min顛倒混勻一次，至凝膠完全溶解；</p><p>　　2)將混合液混勻后轉(zhuǎn)入藍(lán)管，10000g離心1min；</p>&

10、lt;p>　　3)加300μl Binding Buffer，10000g離心1min；</p><p>　　4)棄濾液，加700μl Wash Buffer于藍(lán)管中，10000g離心1min；</p><p>　　5)棄濾液，另加700μl Wash Buffer于藍(lán)管中，10000g離心1min；</p><p>　　6)棄濾液，13000g離心2min，

11、徹底去除藍(lán)管中的Wash Buffer殘留；</p><p>　　7)加入30μl Elution Buffer于藍(lán)管，室溫靜置1min，13000g離心1min，收集產(chǎn)物-30℃保存。</p><p><b>　　2.2感受態(tài)制備</b></p><p>　　采用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞，具體方法如下：</p><p&g

12、t;　　1)接種-80℃長(zhǎng)期保存的大腸桿菌菌株到5ml LB（每升含10g Tryptone，5g Yeast Extract，10g NaCl，pH 7.0）液體培養(yǎng)基中，37℃搖床，200rpm，培養(yǎng)過夜（12h左右）；</p><p>　　2)按1:100比例取50μl母液稀釋到新鮮的5ml LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃搖床培養(yǎng)，200rpm，培養(yǎng)2 h；</p><p>　　3)取

13、出菌液置冰上冷卻10min，將冰冷的菌液1ml每管分裝到1.5mL的Eppendorf管，8000g離心1min，棄上清；</p><p>　　4)沉淀用200μl預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2懸浮，冰浴30min后，8000g離心1min，棄上清；</p><p>　　5)沉淀再用100μl 0.1mol/L CaCl2重懸浮，冰浴放置5~24h備用。</p><

14、p>　　2.3轉(zhuǎn)化和篩選克隆</p><p>　　1)將10μlPCR產(chǎn)物加到100μl感受態(tài)細(xì)胞中，移液槍輕輕吹打混勻冰浴放置30min；</p><p>　　2)在42℃水浴條件下熱激90s，立即轉(zhuǎn)移到冰上冷卻2min；</p><p>　　3)加入冰預(yù)冷的LB培養(yǎng)液總體積至1ml，37℃搖床低速（170~180rpm）培養(yǎng)1h；</p>&

15、lt;p>　　4)在預(yù)先均勻涂布X-gal和IPTG的LB平板上（液體LB培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂粉），取100μl轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)菌液，涂布于含氨卞青霉素（50μg/mL），37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜（10~14h）；</p><p>　　5)篩選白色菌落置5ml含氨卞青霉素（50μg/mL）的LB培養(yǎng)液，在37℃搖床，200rpm，培養(yǎng)8~12 h。</p><p><b>　　

16、2.4質(zhì)粒提取</b></p><p>　　根據(jù)質(zhì)粒在下游實(shí)驗(yàn)中用途不同，我們用不同的方法抽提質(zhì)粒，其中用于檢測(cè)和篩選陽(yáng)性克隆采用采用堿裂法小量抽提質(zhì)粒。用于雙酶切的質(zhì)粒采用E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I試劑盒（OMEGA）精抽純化。</p><p>　　裂解法（粗提質(zhì)粒）：</p><p>　　1)取1ml菌液于1.5ml的Epp

17、endorf管中，8000g離心1min，棄去上清；</p><p>　　2)加入溶液I（50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl pH 8.0）100μl，劇烈震蕩使細(xì)胞懸??；</p><p>　　3)加新配制的新鮮溶液II（0.2mol/L NaOH，1%SDS）200μl，輕柔顛倒數(shù)次，待菌懸浮液澄清；</p><p&g

18、t;　　4)加入150μl溶液III（3mol/L Kac，2mol/L HAc），混勻后13000g離心10min；</p><p>　　5)將380μl上清轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf管中，加入異丙醇720μl，顛倒數(shù)次13000g離心10 min；</p><p>　　6)棄上清，沉淀經(jīng)自然干燥后加50μl無菌水溶解。</p><p>　　2.5重組質(zhì)粒的鑒定

19、</p><p>　　將堿裂法抽提的質(zhì)粒與10×上樣緩沖液混勻后，1%瓊脂糖凝膠電泳，選擇大小合適的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR檢測(cè)體系如前。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離。鑒定為目的重組質(zhì)粒后，將目的菌株的菌液加10%甘油混勻后置于-80℃保存。</p><p>　　2.6原核表達(dá)載體的克隆</p><p>　　1)按（1.2）步驟獲得含有目的基因

20、的克隆。</p><p>　　2)采用E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I試劑盒（OMEGA）分別純化質(zhì)粒pET-22b（+）和PCR產(chǎn)物。</p><p>　　3)對(duì)純化的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系如下：</p><p>　　4)切膠純化：酶切后產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切下目的條帶，用切膠純化試劑盒E.Z.N.A.TM Gel Extracti

21、on Kit（OMEGA）純化，步驟如前所述。</p><p>　　5)連接采用TaKaRa公司的DNA Ligation Kit ver.2，pET-22b（+）載體反應(yīng)體系如下：</p><p>　　6)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TG1菌株，涂于含氨芐青霉素（50μg/mL）的LB培養(yǎng)基上，篩選所需的克隆，經(jīng)PCR進(jìn)一步確定。</p><p>　　2.7Apo A-I-1

22、基因的原核表達(dá)和檢測(cè)</p><p>　　1)采用E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I試劑盒（OMEGA）純化目的質(zhì)粒。</p><p>　　2)轉(zhuǎn)化至BL21 pLys E菌株，涂于含氨芐青霉素（50μg/mL）的LB培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)（10~14h）。</p><p>　　3)誘導(dǎo)：挑選單個(gè)菌落接種于5ml LB培養(yǎng)液（含50 μg/mL氨芐青霉

23、素），37℃搖床培養(yǎng)過夜。取50μl按1:100比例稀釋接種LB培養(yǎng)液（含50μg/mL氨芐青霉素）5ml中，2h后，取1ml作為對(duì)照，其余培養(yǎng)液中加入IPTG（終濃度為0.4mmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)2h。</p><p>　　4)檢測(cè)：取1ml菌液于1.5ml的Eppendorf管，8000g離心1min，菌體加100μL 2×SDS-PAGE上樣緩沖液（50mmol/L Tris-HCl pH 6.

24、8，100mmol/L DTT，2%SDS，0.01%溴酚藍(lán)，20%甘油），煮沸5min，10000g離10min后，取上清20μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用未誘導(dǎo)的菌體和BL21 pLys E菌體蛋白作對(duì)照，進(jìn)行電泳。樣品在進(jìn)入分離膠前用80V，進(jìn)入分離膠后加至95V。</p><p>　　5)染色與脫色：電泳完成后，取出聚丙烯酰胺凝膠，切去濃縮膠，同時(shí)切一角作為方向標(biāo)記，蒸餾水沖洗。用考馬斯亮藍(lán)R-250（

25、0.25% Coomassie’s bright blue R-250）染色，室溫下，染色30min后轉(zhuǎn)至脫色液，漂洗至凝膠背景無顏色，蛋白條帶清晰，觀察是否表達(dá)。</p><p><b>　　（二）技術(shù)路線</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度</p><p>　　2010.9-2010.10 畢業(yè)論文選題</p>

26、;<p>　　2010.10-2010.12 進(jìn)行文獻(xiàn)查閱和資料收集，.完成開題報(bào)告及任務(wù)書，制定具體研究計(jì)劃和試驗(yàn)方案。</p><p>　　2010.12-2010.12 試驗(yàn)相關(guān)試劑的準(zhǔn)備。</p><p>　　2010.12-2011.1 構(gòu)建香魚Apo AI原核表達(dá)載體和香魚Apo AI的原核表達(dá)及鑒定。</p><p>　　2011.1

27、-2011.2 數(shù)據(jù)和材料整理、分析。</p><p>　　2011.2-2011.3 完成2篇外文翻譯，論文撰寫、提交并答辯。</p><p>　　2011.4-2011.4 開題答辯與綜述。</p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] Maciejko JJ, Holme

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48、t;<p>　　Apo AI基因的研究進(jìn)展</p><p>　　摘要 Apo AI是細(xì)胞膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的特殊重要因素，它能與磷脂、細(xì)胞受體及多種血漿因子結(jié)合，可以激活卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的移出、酯化、轉(zhuǎn)移以及調(diào)節(jié)HDL代謝有促進(jìn)作用。因此，本文對(duì)Apo AI基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究進(jìn)展進(jìn)行概述。 </p><p>　　關(guān)鍵詞 載脂蛋白 載脂蛋白基因 冠心病

49、糖尿病 膽固醇</p><p>　　Apo AI是高密度脂蛋白(HDL)的主要組成蛋白，Apo AI主要由肝臟合成，小腸也可合成，占高密度脂蛋白膽固醇（HDL-CHOL）總蛋白的60%～70%，Apo AI的測(cè)定可直接反映HDL-CHOL的水平。大量的研究已證明，Apo AI在血清中的濃度與冠心病及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病都存在某種關(guān)系(Maciejko JJ，Holmes DR，Kottke BA，等，1983；Ko

50、ttke BA，Zinsmeister AR，Holmes DR Jr，等，1986)。因此關(guān)于Apo AI的研究巳逐漸成為冠心病等醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要課題。</p><p>　　1、Apo AI的結(jié)構(gòu)</p><p>　　1．1 Apo AI的一級(jí)結(jié)構(gòu)</p><p>　　Apo AI是一條由243個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽鏈。Brewer等人（Brewer HB，19

51、78）早在1978年就測(cè)定了Apo AI的一級(jí)結(jié)構(gòu)。Apo AI分子中含有較多的極性氨基酸，不含有半胱氨酸和異亮氨酸，并且在Apo AI分子中有許多由22個(gè)氨基酸殘基形成的重復(fù)序列，這些序列都多以脯氨酸作為第一個(gè)氨基酸（徐勇霞，付明德，2002）。每一個(gè)重復(fù)均可形成雙性α-螺旋（amphipathic helix， AH）結(jié)構(gòu)。被稱為脂質(zhì)結(jié)合區(qū)。</p><p>　　1．2 Apo AI的空間結(jié)構(gòu)</p&g

52、t;<p>　　Apo A1分子中的重復(fù)序列可以形成雙性螺旋的結(jié)構(gòu)。由于一級(jí)結(jié)構(gòu)中極性氨基酸殘基多以相反離子對(duì)的形式排列，非極性氨基酸殘基分布在極性氨基酸殘基的周圍。Apo AI在水溶液中呈扁長(zhǎng)的橢球形。肽鏈的N端由4個(gè)a螺旋形成一個(gè)螺旋束。螺旋束是未與脂質(zhì)結(jié)合的Apo AI結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及水溶性的主要因素。肽鏈的C端只有少量的螺旋，主要是無序的結(jié)構(gòu)（Davidson WS，William WM，Haziett T，等，199

53、6）。Apo AI與磷脂結(jié)合后，C端的α螺旋含量顯著增加，并成為穩(wěn)定Apo AI分子的主要區(qū)域，N端的α螺旋也相應(yīng)發(fā)生重排，但總的含量不會(huì)改變(Davidson WS，1999)。Marcel及其同事（Brewer HB，Bronzert TJ，Houser A，1995）利用抗原決定簇圖譜發(fā)現(xiàn)，Apo AI分子的N端和中心區(qū)域存在許多不連續(xù)的抗原決定簇，說明肽鏈的中心區(qū)域和N端在二級(jí)結(jié)構(gòu)上非常接近。Apo AI三級(jí)結(jié)構(gòu)的研究主要是是兩

54、分子Apo AI與脂質(zhì)結(jié)合后形成的新生盤狀HDL，目前認(rèn)為主要有兩種模型:（1）柵欄模型，Apo AI環(huán)繞盤狀脂質(zhì)分子，其分子內(nèi)8個(gè)α螺旋反向平行排列</p><p>　　2、Apo AI的生物學(xué)功能</p><p>　　2．1 Apo AI與細(xì)胞膽固醇的移出</p><p>　　細(xì)胞膽固醇的移出可以通過擴(kuò)散、特異性位點(diǎn)結(jié)合、非特異性位點(diǎn)結(jié)合3種方式。擴(kuò)散途徑是以膽

55、固醇濃度差作為動(dòng)力、膽固醇從細(xì)胞膜上脫離，通過擴(kuò)散作用與球形HDL結(jié)合。特異性結(jié)合是指在前β-HDL中，Apo AI分子中的雙性a螺旋并未完全與磷脂結(jié)合，而可以與細(xì)胞膜上特殊的脂表面或者特異性的蛋白受體作用，從而使細(xì)胞膜上膽固醇和磷脂同時(shí)溶解移出(Gillotte KL，Phillips MC，Davidson WS，等，1998)。Davidson WS等(Davidson WS，Johnson WJ，Anantharamaiah G

56、M，等，1994)利用人工合成Apo AI肽段研究發(fā)現(xiàn)，Apo AI能與細(xì)胞膜上雙層磷脂發(fā)生短暫作用，破壞細(xì)胞膜上磷脂與膽固醇的結(jié)合，使膽固醇從細(xì)胞膜上解離的更容易。這種結(jié)合不需要特異性位點(diǎn)的參與，稱之為非特異性的結(jié)合。</p><p>　　2.2 Apo AI與LCAT的激活</p><p>　　LCAT介導(dǎo)盤狀HDL即preβ-HDL中膽固醇的酯化形成球狀HDL。研究表明preβ-HD

57、L是膽固醇良好的接受體（von Eckardstein et al，2000）。LCAT可催化新生HDL表層的膽固醇酯化，而Apo AI是LCAT的激活劑，新生HDL在LCAT、Apo AI及其它轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與下變?yōu)槌墒斓腍DL。</p><p>　　2.3 Apo AI與其它血漿園子的結(jié)合</p><p>　　與CETP相互作用將CE呈遞給VLDL或LDL。成熟的球狀HDL膽固醇的酯化能

58、力降低，CETP通過其C-端的α-螺旋將HDL中的CE呈遞給CM殘粒、VLDL及LDL，CM及VLDL表面的PL則向HDL轉(zhuǎn)移。Pussien等(Pussinen PJ，Jauhiainen M，Metso J，等，1998)發(fā)現(xiàn)，Apo AI的N一端能與PLTP結(jié)合，結(jié)合的區(qū)域限定在Apo AI分子的殘基27—141之間。另外，Apo AI能與肝細(xì)胞膜表面的清道夫受體BI(SR—B</p><p>　　I)，介

59、導(dǎo)HDL中的膽固酵酯的轉(zhuǎn)移。Williams等（Williams DL，Thuahnai ST，Connelly MA，等，2000）研究發(fā)現(xiàn)Apo AI分子C端及N端的A類α螺旋是SR—BI識(shí)別的位點(diǎn)。最近提出，當(dāng)HDL與SR—BI結(jié)合后，HDL中的膽固醇酯通過非水相的通道轉(zhuǎn)移到肝細(xì)胞膜上。另一方面，Apo AI可與VLDL結(jié)合，從而減少HL與VLDL的結(jié)合，Apo AI又可抑制HI對(duì)極低密度脂蛋白(VLDL)的水解作用。</p

60、><p>　　3、Apo AI的醫(yī)學(xué)功能</p><p>　　3.1 Apo AI與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病疾病的關(guān)系</p><p>　　Apo AI在脂蛋白代謝中具有重要的生理功能，能激活某些與血漿脂蛋白代謝有關(guān)的酶類，構(gòu)成并穩(wěn)定脂蛋白的結(jié)構(gòu)。載脂蛋白A1是高密度脂蛋白(HDL)與細(xì)胞膜上的HDL受體結(jié)合的載體，同時(shí)具有維持HDL的結(jié)構(gòu)，并參與膽固醇逆轉(zhuǎn)的抗動(dòng)脈粥樣

61、硬化因子。許多研究表明，HDL對(duì)動(dòng)脈血管壁有直接的保護(hù)作用（E Navab M，Van Lenten BJ，Reddy S T，等，2000），并能使動(dòng)脈粥樣硬化病變消退（Rong JX，Li J，Reis ED，等，2001）。目前認(rèn)為HDL抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的一個(gè)重要機(jī)制就是它介導(dǎo)了膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)（Lin G，2002）。HDL還能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮NO的生成和活性，改善血管內(nèi)皮功能（Shaul PW，2003）。因此，HDL膽固醇下降時(shí)動(dòng)

62、脈粥樣硬化的危險(xiǎn)性增加。載脂蛋白AI為HDL的主要蛋白質(zhì)，載脂蛋白AI的含量反映了HDL的水平，后者有轉(zhuǎn)運(yùn)周圍組織的膽固醇及肝臟進(jìn)行代謝處理的抗動(dòng)脈粥樣硬化的功能。HDL膽固醇濃度增高可使血管壁減少與有致粥樣硬化潛力顆粒的接觸（Patsch JR，1994），與冠心病的發(fā)病率呈逆相關(guān)。</p><p>　　3.2 Apo AI與糖尿病的關(guān)系</p><p>　　糖尿病是21世紀(jì)的常見病、多

63、發(fā)病，嚴(yán)重威脅人類健康我國(guó)糖尿病的患病率迅速增長(zhǎng)，其中90%以上屬II型糖尿病。糖尿病除糖代謝紊亂外，還有明顯脂類代謝異常，大量國(guó)內(nèi)外研究已證實(shí)，血脂代謝異常是糖尿病患者出現(xiàn)血管并發(fā)癥的重要危險(xiǎn)因素（莫蔚林，2004；趙水平，2002）。袁美玲，倪紅兵（袁美玲，倪紅兵，2009)將II型糖尿病組和正常對(duì)照組利用氧化酶法、直接一步法與比濁法，證明Apo AI/Apo B100比值的降低與合并血管并發(fā)癥的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。他還認(rèn)為定期對(duì)糖尿病患

64、者檢查血脂尤其是Apo B100和Apo AI/Apo B100，作為糖尿病患者是否有心血管并發(fā)癥的發(fā)生以及并發(fā)癥嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)。</p><p>　　3.3 Apo AI與丙型肝炎的關(guān)系</p><p>　　丙型肝炎病毒(HCV)的感染，不僅能夠引起急慢性病毒性肝炎，而且能夠引起肝纖維化和肝細(xì)胞癌，嚴(yán)重危害人民的生命健康。HCV感染具有較高的慢性化比例，有時(shí)高達(dá)80％以上。我國(guó)目前一般人

65、群的感染率達(dá)3．2％，因而具有更大的危害性（成車，朱傳琳，2000）。不同的研究證明，感染HCV后患者發(fā)生脂肪變的幾率在60—80％（鄧子德，庚惠鴻，何達(dá)秋，1996），肝臟脂肪變的主要原因是脂肪代謝障礙。張健，成軍等（張健，成軍，李莉，2002）對(duì)HCV陽(yáng)性患者和健康者進(jìn)行免疫比濁法、雙試劑，得出HCV與Apo AI 及Apo AII存在著密切聯(lián)系，且影響其在血清中的代謝。Giorgioetal曾報(bào)道，應(yīng)用僅一干擾素(IFN一僅)治療

66、丙型肝炎Soardo G，Pirisi M，F(xiàn)onda M，等，1995；Naeem M，Bacon BR，Mistry B，等，2001)，發(fā)現(xiàn)HCV受體可結(jié)合Apo AI及Apo AII，從而影響其功能。</p><p>　　4、Apo AI基因多態(tài)性的研究</p><p>　　多態(tài)性是指在一個(gè)生物群體中，同時(shí)和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型或等位基因，亦稱遺傳多態(tài)性或基因多

67、態(tài)性。Apo AI基因突變可導(dǎo)致異常的Apo AI蛋白質(zhì)的合成。有些異常的Apo AI影響HDL的代謝。已報(bào)道的阻礙Apo AI合成的基因突變有重排、缺失、無義突變等方式。目前已發(fā)現(xiàn)至少有20種不同的Apo AI結(jié)構(gòu)基因的點(diǎn)突變導(dǎo)致氨基酸轉(zhuǎn)換。鄒陽(yáng)春，胡大一等（鄒陽(yáng)春，胡大一，楊新春，等，2003）認(rèn)為載脂蛋白A1基因M1及M2位點(diǎn)MspI酶切長(zhǎng)度多態(tài)性改變通過影響高密度脂蛋白膽固醇及載脂蛋白A1血漿水平而與冠心病的發(fā)生發(fā)展存在著某種意

68、義上的內(nèi)在聯(lián)系。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1]Maciejko JJ, Holmes DR, Kottke BA, et al.Apolipoprotein A-I as a marker of angiographically assessed coronary-artery disease [J]. N Engl J M

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85、gt;<p>　　[23]張健, 成軍, 李莉. 丙型肝炎病毒感染者血清載脂蛋白AI及AII水平的研究[J].世界華人消化雜志, 2002, 10(9): 1015-1017</p><p>　　[24]Soardo G, Pirisi M, Fonda M, et al. Changes in blood lipid composition and response to interferon t

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88、<p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　香魚Apo AI原核表達(dá)及鑒定</p><p><b>　　目錄</b></p><p>　　摘要（Abstract）

89、 </p><p>　　1.引言..........................................................................................................................................................................1</p>

90、<p>　　2.實(shí)驗(yàn)材料與方法......................................................................................................................................................2</p><p>　　2.1原料、儀器和試劑.............

91、..................................................................................................................................2</p><p>　　2.1.1 原料與試劑.......................................................

92、................................................................................................2</p><p>　　2.1.2 主要儀器..........................................................................................

93、.................................................................4</p><p>　　2.1.3主要試劑及其配制......................................................................................................................

94、......................4</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法..............................................................................................................................................................4</p&

95、gt;<p>　　2.2.1引物設(shè)計(jì)............................................................................................................................................................4</p><p>　　2.2.2 PCR產(chǎn)物切膠純化

96、............................................................................................................................................4</p><p>　　2.2.3原核表達(dá)載體的克隆..........................................

97、..............................................................................................4</p><p>　　2.2.4感受態(tài)的制備...........................................................................................

98、.........................................................5</p><p>　　2.2.5轉(zhuǎn)化與篩選克隆...............................................................................................................................

99、.................5</p><p>　　2.2.6質(zhì)粒提取............................................................................................................................................................5</p>&

100、lt;p>　　2.2.7重組質(zhì)粒的鑒定................................................................................................................................................6</p><p>　　2.2.8 Apo AI基因的原核表達(dá)和檢測(cè)........

101、................................................................................................................6</p><p>　　3.結(jié)果................................................................................

102、..........................................................................................6</p><p>　　3.1 Apo AI的PCR擴(kuò)增..........................................................................................

103、...................................................6</p><p>　　3.2目的片段的酶切結(jié)果.....................................................................................................................................

104、......7</p><p>　　3.3 pET-22b（+）質(zhì)粒的雙酶切...............................................................................................................................7</p><p>　　3.4重組質(zhì)粒的檢測(cè).........