鮸魚vibrio ponticus的分離鑒定【開題報告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　水產(chǎn)養(yǎng)殖</b></p><p>　　鮸魚Vibrio ponticus的分離鑒定</p><p>　　一、選題的背景與意義</p>

2、<p>　　鮸魚（音 miǎn），一作米魚，形似鱸魚，但肉質(zhì)略粗糙，體色發(fā)暗，灰褐并帶有紫綠色，腹部灰白。背鰭鰭棘上緣黑色，鰭條部中央有一縱行黑色條紋。胸鰭腋部上方有一晴斑。其余各鰭灰黑色。鮸魚體形為兩側(cè)扁平向后延長狀，背、腹部淺弧形。鮸魚分布于北太平洋西部，包括中國的渤海、黃海及東海，朝鮮和日本南部。中國沿海主要產(chǎn)鮸魚的漁場有：廣東潮汕魚場福建平潭島和兄弟島，浙江岱山和舟山群島，江蘇大沙漁場，山東沿海和渤海，尤以東海的舟山群

3、島產(chǎn)量最大，是寧波一帶的海漁特產(chǎn)之一。鮸魚的主要捕撈方法為底拖網(wǎng)或延繩釣，冬春之際產(chǎn)量較高。每年農(nóng)歷6一8月為舟山群島鮸魚的漁汛期，漁汛期鮸魚以春季生殖洄游和冬季越冬洄游為主，7月為旺汛。每逢大潮汛，漁船競相出海作業(yè)，晨出晚歸，捕獲甚豐。鮸魚肉味鮮美，為海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類之一，也是經(jīng)濟(jì)價值較高的魚類。除鮮食外，肉是作魚丸、敲魚面的上等原料，在溫州頗有盛名；全魚還可制作罐頭或加工成鮸魚鲞；魚鰾可制魚膠，有較高的藥用價值，具養(yǎng)血、補(bǔ)腎、潤肺健脾和

4、消炎作用；魚鱗可制鱗膠；內(nèi)臟、骨可制魚粉、魚油；耳石有清熱去瘀、利尿的作用。鮸魚還是我國的出口魚類品種，每年通過浙江、上海、江蘇、遼寧等出口口</p><p>　　Vibrio ponticus是弧菌屬的一員，2004年發(fā)現(xiàn)的一個新種。在魚類弧菌病前期研究中，溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鯊魚弧菌、哈維氏弧菌等是危害魚類生長的重要病原，主要導(dǎo)致魚體表潰瘍或是爛身、爛鰓。近2年出現(xiàn)的Vibrio ponticus病的主要癥狀

5、同以往不同，主要表現(xiàn)為：病魚離群獨(dú)游，體色發(fā)黑或體表粘附大量黃色物質(zhì)，體表正常，無潰爛癥，肝偏白，鰓偏白，有一定的失血癥狀，腸空，部分魚腸有膿液，無味。該菌可感染幼魚，也可感染2齡以上的魚，發(fā)病急，一般在1周內(nèi)死亡50－80％，死亡1周后魚死亡變緩，逐漸穩(wěn)定。發(fā)病一般在春、秋2季，水文變化較多的季節(jié)。Vibrio ponticus也可感染日本海鱸（Lateolabrax japonicus），但癥狀不同，可使日本海鱸體表潰瘍和肝損傷。&

6、lt;/p><p>　　治療：1、由于Vibrio ponticus病發(fā)生時，魚已拒食，可重點對尚可攝食的魚進(jìn)行重點預(yù)防，用終濃度0.2ppm的氟苯尼考或0.4ppm的恩諾沙星拌飼投喂，連用3天，有較好的預(yù)防效果。</p><p>　　意義：通過此次試驗，可以研究引起鮸魚病變的細(xì)菌并把它進(jìn)行分離鑒定，為下一步的治療等研究做準(zhǔn)備。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與

7、擬解決的主要問題：</p><p><b>　　研究的基本內(nèi)容：</b></p><p>　　本實驗主要是對引起鮸魚致病的病菌進(jìn)行分離，采用了TCBS平板分離優(yōu)勢菌；采用了回歸感染試驗確認(rèn)病原菌，采用改進(jìn)的寇氏法計算LD50;采用形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特征測定，細(xì)菌特異性引物PCR擴(kuò)增檢測及細(xì)菌16S rRNA序列分析鑒定細(xì)菌；采用藥敏試驗測定它對部分抗生素的敏感性。&

8、lt;/p><p><b>　　擬解決的問題：</b></p><p>　　研究引起鮸魚病變的細(xì)菌并把它進(jìn)行分離鑒定。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p><b>　?。ㄒ唬┭芯糠椒?lt;/b></p><p>　　本實驗主要是對引起鮸魚致病的病菌進(jìn)行分離

9、，采用了TCBS平板分離優(yōu)勢菌；采用了回歸感染試驗確認(rèn)病原菌，采用改進(jìn)的寇氏法計算LD50;采用形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特征測定，細(xì)菌特異性引物PCR擴(kuò)增檢測及細(xì)菌16S rRNA序列分析鑒定細(xì)菌；采用藥敏試驗測定它對部分抗生素的敏感性。</p><p><b>　　1.1材料</b></p><p>　　1.1 主要試劑和儀器：T4 DNA連接酶、pMD19-T載體和E

10、x Taq DNA聚合酶等均購自Takara公司； UNIQ-10柱式膠回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；其余藥品試劑均為進(jìn)口分析純。藥敏紙片購自杭州天河生物制藥廠。離心機(jī)（MICROCL 19型）購自Thermo Electron公司，PCR儀（Mastercycle pereonal型）購自Eppendorf公司，恒溫震蕩器（HZ-9211K型)購自太倉市科教器材廠。</p><p>　　1.2 樣品

11、：選取癥狀典型的瀕死病魚。</p><p>　　1.3 引物：采用已報道的細(xì)菌16SrRNA基因通用擴(kuò)增引物和部分弧菌科成員鑒定引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證。引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。</p><p><b>　　2．病原菌的分離：</b></p><p>　　無菌條件下取病魚體表潰瘍、肝、脾、腎等部位作為材料，用普通營養(yǎng)瓊脂和TCB

12、S平板做細(xì)菌分離，置28°C培養(yǎng)24 h。結(jié)果從被檢材料中分離到純度一致的菌株，命名為鮸魚病原菌,純培養(yǎng)后-70W保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　3．菌體形態(tài)觀察及常規(guī)生理生化鑒定</p><p>　　用普通光鏡和透射電鏡結(jié)合觀察分離細(xì)菌的形態(tài)、大小和鞭毛。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》 和《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》方法對其進(jìn)行生理生化特征測定。</p><p&g

13、t;　　4．病原菌的回歸感染</p><p>　　將鮸魚病原菌接種于普通營養(yǎng)肉湯中， 28°C恒溫過夜培養(yǎng)，用無菌生理鹽水稀釋至所需濃度(平板菌落計數(shù)法計算菌懸液濃度）。選擇無外傷、游動活潑，平均體重45 g左右的健康鮸魚作為供試魚。馴化7 d后，經(jīng)腹腔注射的方式進(jìn)行人工感染。實驗共分6個組，每組12尾魚，其中5個實驗組，1個對照組。實驗組每尾注射0.1 mL菌液， 對照組每尾注射等量的無菌生理鹽水。實

14、驗期間不投喂飼料，不間斷充氣，控制水溫為（20± 1)°C。感染開始后，記錄96 h內(nèi)發(fā)病癥狀和死亡情況，采用Aliu和Nmide改進(jìn)的寇氏法（Karber's method )計算半數(shù)致死劑量。對死亡魚體進(jìn)行解剖和病原菌的再分離，對優(yōu)勢菌株進(jìn)一歩完成生化特性的測定。</p><p><b>　　5．藥物敏感性實驗</b></p><p>

15、　　用藥敏紙片法在普通營養(yǎng)瓊脂平板上測定鮸魚病原菌對藥物的敏感性。28°C恒溫培養(yǎng)16 - 18 h，觀測抑菌圈直徑大小，根據(jù)說明書標(biāo)準(zhǔn)判斷藥物敏感和抗藥性。</p><p>　　6．細(xì)菌基因組序列擴(kuò)增、測序和分析</p><p>　　6.1 細(xì)菌基因組DNA提取：采用Wilson描述的方法提取鮸魚病原菌的基因組DNA作為模板。</p><p>　　6.2

16、 PCR擴(kuò)增：25 uL的PCR反應(yīng)體系中包括DNA模板0.5 uL， 10 * Ex PCR緩沖液2.5 uL， dNTP 混合物（各2.5 mol/L)2 ;iL,正向和反向引物（10 pmol/L)各1 fiL和Ex Taq DNA聚合酶1 U。 PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性2 min后以下列程序進(jìn)行30 個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性30 S, 55 – 60度 復(fù)性90 s，72度延伸30 s(16S

17、F/16SR引物擴(kuò)增時為90 S)，循環(huán)結(jié)束后72°C延伸10 min。</p><p>　　6.3擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測和克?。涵傊悄z檢測PCR產(chǎn)物，預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶回收后克隆至pMD19-T載體，序列測定由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。</p><p>　　6.4 序列分析：采用ClustalW程序進(jìn)行多重序列比對后，用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。</p>

18、<p><b>　?。ǘ┘夹g(shù)路線：</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度</p><p>　　2010.1-2010.3 畢業(yè)論文選題</p><p>　　2010.3-2010.7 進(jìn)行文獻(xiàn)查閱和資料收集，制定具體研究計劃和試驗方案。</p><p>　　2010.7-2010.8 試

19、驗相關(guān)儀器的采購和安裝</p><p>　　2010.8-2010.12 病原菌的分離和各方面試驗的進(jìn)行。</p><p>　　2011.1-2011.2 數(shù)據(jù)和材料整理、分析, 完成2篇外文翻譯。</p><p>　　2011.3-2011.4 論文撰寫、提交并答辯。</p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b

20、></p><p>　　[ 1 ]林克冰,周宸,劉家富,等. 海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖鮸魚弧菌病的病原菌[ J ]. 臺灣海峽, 1999, (3) : 342～345.</p><p>　　[ 2 ]王軍,蘇永全,張朝霞,等. 閩南地區(qū)養(yǎng)殖鮸魚細(xì)菌性疾病的病原生物學(xué)研究[ J ]. 廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版) , 2001, 40 (1) : 85～91.</p><p&g

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25、 J ]. 臺灣海峽, 2004, 23 (1) : 56～61.</p><p>　　[ 12 ]王軍,鄢慶枇,蘇永全,等. 養(yǎng)殖鮸魚副溶血弧菌的酶聯(lián)免疫吸附法研究[ J ]. 臺灣海峽, 2001, 20(3) : 346～350.</p><p>　　[ 13 ] Rivera IN G, L ipp E K, Gil A I, et al. Method ofDNA extract

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37、lt;p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　水產(chǎn)養(yǎng)殖</b></p><p>　　魚類弧菌病檢測研究進(jìn)展</p><p>　　摘要: 養(yǎng)殖魚弧菌病發(fā)病率高、發(fā)病范圍廣，流行時間為6～10月，7～8月為高峰期,一般死亡率為30%～40%，最高可達(dá)80%以上，已成為制約養(yǎng)殖魚健康發(fā)展的主要

38、瓶頸之一。就國內(nèi)外研究發(fā)展動向,綜述了養(yǎng)殖魚弧菌病的主要檢測技術(shù)包括傳統(tǒng)的檢測技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)檢測技術(shù)等并詳細(xì)闡明了各個技術(shù)的原理、特點及應(yīng)用。</p><p>　　關(guān)鍵詞：魚；弧菌病；檢測</p><p>　　我國是養(yǎng)殖海水魚大國，養(yǎng)殖海水魚主要分布在我國黃海南部、東海、臺灣海峽以及南海。浙江省網(wǎng)箱養(yǎng)殖海水魚品種眾多。隨著魚類養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,由于養(yǎng)殖密度過高，養(yǎng)殖區(qū)域水質(zhì)

39、惡化嚴(yán)重，以及魚類經(jīng)過多代人工繁殖造成性狀退化，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降等原因,病害頻繁發(fā)生且日趨嚴(yán)重。近年流行的病害主要是細(xì)菌性疾病(弧菌病、腸炎病、爛鰓病等) 、寄生蟲病(纖毛蟲、指環(huán)蟲等) 、水霉病等。其中由弧菌屬細(xì)菌引起的疾病，危害最為嚴(yán)重，每年都給養(yǎng)殖從業(yè)者造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。</p><p>　　弧菌屬的多種弧菌均能引起養(yǎng)殖魚類弧菌病，癥狀表現(xiàn)為多種多樣：潰瘍、爛尾、腹水、爛眼等，其中潰瘍和爛尾是最常見的

40、癥狀1~4。這是一種病程短、范圍廣、死亡率高的疾病，流行時間為6～10月，7～8月為高峰期，一般死亡率為30% ～40% ，最高可達(dá)80%以上。在典型的發(fā)病網(wǎng)箱內(nèi)，從出現(xiàn)少量病魚到大部分發(fā)病死亡歷時約7d。致病菌的準(zhǔn)確快速鑒定是魚病防治的基礎(chǔ)，如何快速準(zhǔn)確檢測養(yǎng)殖魚類弧菌病，已成為當(dāng)前魚類養(yǎng)殖業(yè)十分重要而突出的問題。</p><p>　　1.魚類弧菌病病原種類</p><p>　　魚類弧菌

41、病的病原為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和哈氏弧菌(Vibrio harveyi) 。另具毛芝娟5、李清祿6等報道，副溶血弧菌(V. parahaemolyticus) ，鰻弧菌(V. parahaem olyticus)等均可引起魚類弧菌病。</p><p>　　1.1魚類溶藻弧菌病</p><p>　　1.1.1培養(yǎng)特性：</p><p>

42、　　溶藻弧菌為嗜溫菌，適宜生長溫度為17—35℃，溶藻弧菌通常在水溫5℃以上時才可從海水中分離到，溶藻弧菌是亞熱帶，熱帶暖水海區(qū)最為常見的條件致病菌，其致病性與魚體健康狀況及水環(huán)境的理化條件有關(guān)。</p><p>　　1.1.2 在魚類上癥狀反應(yīng)</p><p>　　目前，魚類弧菌病病原主要為溶藻弧菌。溶藻弧菌對溫度，鹽度及酸堿度的適應(yīng)范圍很廣。當(dāng)溶藻弧菌有較強(qiáng)活力時對宿主有較強(qiáng)粘附作用，

43、所以這可能是溶藻弧菌對魚類致病多發(fā)生在水溫較高的春夏季的原因之一。鰻弧菌及其胞外產(chǎn)物均有較強(qiáng)毒性，其外毒素中蛋白酶，磷脂酶，溶血素等有很強(qiáng)毒性，對魚類有很強(qiáng)致病和致死性?？赏茰y，大量溶藻弧菌及其胞外產(chǎn)物是魚類夏季弧菌病主要病因。</p><p>　　溶藻弧菌主要以特異性結(jié)合方式粘附于宿主表面，還可借助鈣等二價陽離子進(jìn)行粘附；魚類有可能通過改變粘液某些理化性質(zhì)抑制病原性溶藻弧菌的粘附，從而有利于保護(hù)自身免受病原菌的

44、侵害。</p><p>　　1.2魚類哈氏弧菌病</p><p>　　1.2.1培養(yǎng)特性：</p><p>　　哈維氏弧菌(y．harveyi)為短桿狀革蘭氏陰性條件致病，已逐漸成為水產(chǎn)動物，包括無脊椎動物(如蝦)和脊椎動物(如魚)養(yǎng)殖的一大殺手，給我國尖吻鱸(Bloch)、鱸魚(Lateo—labrax japonicus)、花鱸(Lateolabrax macu

45、latus)、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)、高體螄(Seriola dumerili)等海水魚類帶來嚴(yán)重的損失． </p><p>　　1.2.2 在魚類上癥狀反應(yīng)</p><p>　　哈維氏弧菌的感染不僅損傷患病魚類的皮膚，造成病魚外觀異樣影響其商品價值，造成經(jīng)濟(jì)損失，而且還嚴(yán)重?fù)p傷其內(nèi)臟及免疫器官，造成魚體自身生理代謝紊亂，免疫力和抗病力下降．很明顯重要臟腑受

46、損，內(nèi)臟器官功能衰竭是造成感染哈維氏弧菌魚類病魚出現(xiàn)死亡的主要原因之一．但不論從顯微結(jié)構(gòu)還是超微結(jié)構(gòu)來看，患病魚類鰓組織的病變不明顯，也未觀察到哈維氏弧菌，鰓是否為哈維氏弧菌侵襲的主要器官，這還有待于進(jìn)一步研究論證．</p><p>　　1.3魚類副溶血弧菌病</p><p>　　1.3.1培養(yǎng)特性：</p><p>　　副溶血性弧菌(又稱嗜鹽菌, Vibrio P

47、arahaemolyticus)是革蘭氏陰性多形態(tài)桿菌或稍彎曲弧菌。本菌嗜鹽畏酸，在無鹽培養(yǎng)基上，不能生長，3%～6%食鹽水繁殖迅速，每8～9分鐘為1周期，低于0.5%或高于8%鹽水中停止生長。在食醋中1～3分鐘即死亡，加熱56℃5～10min滅活，在1%鹽酸中5分鐘死亡。</p><p>　　2. 魚類病原檢測方法</p><p>　　2.1　傳統(tǒng)方法檢測與診斷</p>&

48、lt;p>　　傳統(tǒng)方法檢測包括直接培養(yǎng)、生理生化方法、組織切片觀察法和超薄切片電鏡觀察法,是目前養(yǎng)殖魚類弧菌病診斷的主要方法。金珊4等對浙江省12個魚類養(yǎng)殖區(qū)所發(fā)生的弧菌病進(jìn)行病原菌的分離，從病魚的肝、腎、脾、血液等組織共獲得30多株細(xì)菌。經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、培養(yǎng)特征、生理生化特性試驗和人工感染試驗等研究，但從傳統(tǒng)的直接培養(yǎng)、生理生化方法、組織切片觀察法以及電鏡形態(tài)觀察檢測,都是從所表現(xiàn)的性狀來判斷的，從某種意義來講,不具有充分的說服

49、力，并且花費(fèi)時間長，而魚類弧菌病病程短，從少量發(fā)病到大部分發(fā)病死亡只有7d，可能會延誤了病情的診斷和治療。</p><p><b>　　免疫學(xué)檢測技術(shù)</b></p><p>　　免疫學(xué)技術(shù)是利用特異性抗原抗體反應(yīng),觀察和研究組織細(xì)胞特定抗原(或抗體)的定位和定量技術(shù)。具有高特異性、高靈敏性等特點，該技術(shù)將抗原、抗體的免疫反應(yīng)相結(jié)合,縮短了病原菌的檢測時間,提高了診斷

50、的準(zhǔn)確性，是目前養(yǎng)殖魚類弧菌病早期檢測技術(shù)中研究較為廣泛、深入的檢測技術(shù)。</p><p>　　2.2. 1　免疫熒光技術(shù)</p><p>　　熒光抗體技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，以熒光素作為標(biāo)記物，與已知的抗體結(jié)合(不影響其免疫特性)作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于鑒定未知的抗原，可在熒光顯微鏡下檢查呈現(xiàn)熒光的特異性抗原抗體復(fù)合物及其存在部位。此項技術(shù)是應(yīng)用免疫反應(yīng)的特異性與靈敏性，并與顯

51、微鏡的精確性相結(jié)合，成為現(xiàn)代免疫學(xué)研究中的標(biāo)記免疫檢測方法之一。王軍7 、鄢慶枇8等分別建立了檢測魚類溶藻弧菌,副溶血弧菌的間接熒光抗體快速檢測技術(shù)。免疫熒光技術(shù)不僅能快速檢測患病動物的病原，檢測的時間一般不超過3 h，為疾病的及時對癥治療贏得了寶貴的時間，而且該方法還能夠檢測到帶菌狀態(tài)或未發(fā)病的被感染個體。姚斐9等報道了利用間接免疫熒光技術(shù)還可檢出處于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)菌，由于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)菌仍具有毒性，并可在一定條件下復(fù)蘇造

52、成疾病的暴發(fā)流行，因此加強(qiáng)活的非可培養(yǎng)狀態(tài)病原菌的檢測在魚類弧菌病的預(yù)測預(yù)報上是很有意義的。</p><p>　　但免疫熒光技術(shù)的缺點是非特異性染色問題難以完全解決；操作程序較繁瑣;需要特殊的昂貴儀器(熒光顯微鏡) ；染色標(biāo)本不能長期保存等。</p><p>　　2.2. 2　免疫酶技術(shù)</p><p>　　免疫酶技術(shù)也是免疫學(xué)診斷的一條新途徑,與免疫熒光技術(shù)相比，

53、它只需普通光學(xué)顯微鏡即可進(jìn)行觀察。它利用了抗原- 抗體反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性，通過肉眼或顯微鏡觀察及分光光度計測定,達(dá)到在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的位置,以及對其進(jìn)行定量的目的。該方法具有高效、經(jīng)濟(jì)、方便等特點。按是否將抗原或抗體結(jié)合到固相載體上,免疫酶技術(shù)可分為固相、均相和雙抗體酶免疫測定技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗( EL ISA)是目前應(yīng)用最廣泛的固相免疫酶測定技術(shù)。楊鳶劼10等建立了檢測鰻弧菌的間接EL ISA

54、技術(shù)，其檢測的敏感性閾值為1 ×105 個/mL。鄢慶枇11、王軍12分別改良了間接EL ISA 法檢測魚類溶藻弧菌和副溶血弧菌，其最低檢測極限分別為為9. 7 ×104 cfu /mL和5. 0 ×104 cfu /mL。酶聯(lián)免疫吸附試驗( EL ISA)不僅可以用于患病魚類的診斷，也可以用于無病癥帶菌魚類的檢測,結(jié)果可多次重復(fù)，穩(wěn)定，底物顯色清晰，不需特殊儀器用肉眼即可觀察，快速，并同時可測大量的樣品。

55、為了更好地將這種快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測方法應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐，必須要在縮短檢測時間、提高檢測</p><p>　　免疫學(xué)方法雖比傳統(tǒng)方法在許多方面有了較大進(jìn)步，也存在不少問題?？贵w在體內(nèi)的形成往往需要一段時間，而且抗體一旦產(chǎn)生,即使病愈后還可能長時間存在,陽性結(jié)果還不能做出確診。酶聯(lián)免疫吸附實驗具備免疫學(xué)方法的長處，靈敏度高，但操作麻煩，除了對抗血清要求嚴(yán)格外，還可能存在一定程度的交叉反應(yīng)，并且其結(jié)果受樣品濃度影

56、響，易出現(xiàn)假陽性或微陽性。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和分子雜交等手段為魚類弧菌病檢測提供了新N的研究思路。</p><p>　　2.3　分子生物學(xué)檢測技術(shù)</p><p>　　2.3. 1　PCR及其衍生技術(shù)</p><p>　　酶鏈反應(yīng)技術(shù)( PCR)是指在引物的作用下,體外酶促反應(yīng)，迅速擴(kuò)增DNA片段的一種方法。該技術(shù)具有特異性好、對感染早

57、期診斷非常有效、檢測速度快且靈敏等優(yōu)點。國內(nèi)外關(guān)于弧菌的分子檢測主要集中在霍亂弧菌，副溶血弧菌的研究上,偏重于醫(yī)學(xué)、食品安全和水域環(huán)境方向13,14 ，但對養(yǎng)殖魚類弧菌病早期檢測具有很強(qiáng)的借鑒意義，是未來魚類弧菌病檢測發(fā)展的主流。Kim，Lee等針對副溶血弧菌部分toxR基因，直接溶血素基因, pR72H片段分別建立了多種特異性PCR 檢測方法15~18。Conejero和L Pang針對哈維氏弧菌的部分toxR基因和溶血素基因分別建立

58、了特異性PCR 檢測技19~21。常規(guī)的PCR檢測法為單對引物擴(kuò)增一種病原體DNA，一次只能檢測一種病原體或一個基因型別，基因型別和混合感染的檢測顯得操作煩瑣，費(fèi)時且成本高，而且容易產(chǎn)生漏診。而養(yǎng)殖魚類可能致病性弧菌種類多，病癥表現(xiàn)多樣，難以用一種方法進(jìn)行確診。多重PCR技術(shù)是將多對引物混合后于一個反應(yīng)管中同時進(jìn)行多種病原體擴(kuò)增,能有效地解決上述問題,一種方法能檢出多種致病性弧菌,使得診斷及分型變得簡捷。Di Pinto A22根據(jù)膠原

59、酶基</p><p>　　2.3. 2　PCR與分子雜交聯(lián)用技術(shù)</p><p>　　國內(nèi)外構(gòu)建弧菌的基因文庫或部分基因文庫的研究工作并不算多，對于一些弧菌的特異性核酸探針的制備尚有較大困難。另外，分子雜交檢測靈敏度要比PCR方法低，分子雜交聯(lián)用法來檢測病原可以提高靈敏度。蔣魯巖23等在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，合成探針，應(yīng)用D IG標(biāo)記試劑盒對特異擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記探針可與副溶血弧菌DNA的

60、TDH基因特異性地雜交，從而建立了副溶血弧菌的斑點雜交檢測方法。可以同時處理數(shù)百甚至上千份樣品,適于大批量標(biāo)本檢測，同時應(yīng)用非放射性探針，快速簡便且對操作者健康無害。副溶血弧菌也是魚類弧菌病的可能致病菌之一，將之進(jìn)行改良制成試劑盒也可應(yīng)用于魚類弧菌病的檢測中。</p><p>　　2.4　16S rRNA和熱激蛋白基因檢測技術(shù)</p><p>　　16S rRNA為所有生物體生存所必需的基

61、因序列并且也是較保守的序列之一。16S rRNA的序列檢測已被成功地建立為一種鑒定微生物種、屬、家族種類的標(biāo)準(zhǔn)方法。</p><p>　　目前，16S rRNA檢測技術(shù)在人醫(yī)及獸醫(yī)開始得到廣泛應(yīng)用，在水產(chǎn)病害方面也開始運(yùn)用。但由于16S rRNA的進(jìn)化速度非常慢，即太保守,無法區(qū)分某些種系非常接近的菌種及同一菌種的不同菌株。而熱激蛋白(Heat shockp rotein, HSP)是另一類常用于生物進(jìn)化和分類研

62、究的大分子物質(zhì)。廣泛存在于細(xì)菌及真核生物細(xì)胞中。其主要功能是作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)肽鏈折疊和組裝。進(jìn)化速度比16S rRNA快,攜帶更多的多態(tài)信息。我們對養(yǎng)殖魚類多種致病性弧菌分別進(jìn)行16S rRNA和HSP分子鑒定，發(fā)現(xiàn)HSP60基因更適合用于研究海洋弧菌系統(tǒng)分類鑒定，以HSP60基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹在置信度上普遍明顯高于16S rRNA 基因。這與李寧求24、張偉妮25、Kwok26等的研究結(jié)論一致。</p><p&

63、gt;<b>　　3.　總結(jié)</b></p><p>　　魚類細(xì)菌病的診斷包括對患病魚的癥狀、組織病理、疾病發(fā)生的環(huán)境條件甚至用藥情況的觀察分析，最后尚須經(jīng)過致病菌分離與鑒定過程以達(dá)到確診。對于魚類弧菌病的檢測,最早也是采用這種方法，但由于傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定進(jìn)行生理生化特征的試驗分析費(fèi)時長，工作量大，且準(zhǔn)確性也不是很高，不利于魚病的及時醫(yī)治。養(yǎng)殖魚類的弧菌病研究大多集中在疾病描述、流行病學(xué)、病原

64、鑒定、致病機(jī)理、防治方法等方面。而關(guān)于魚類弧菌病的檢測研究主要集中在免疫學(xué)方法上。免疫學(xué)方法不僅可以檢測發(fā)病魚，還可以檢測潛伏期的帶菌個體，是目前國內(nèi)外關(guān)于魚類弧菌病的早期檢測中研究最廣泛最成熟的技術(shù)，但每次只能檢測出一種病原菌，難以用抗血清分辨相關(guān)菌群且敏感性較低，并且離應(yīng)用到基層生產(chǎn)實踐還有一定的距離。而養(yǎng)殖魚類可能致病性弧菌種類多，病癥表現(xiàn)多種多樣，難以用一種方法進(jìn)行確診。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為養(yǎng)殖魚類弧菌病的檢測提供了新的研究思

65、路，尤其是多重PCR技術(shù)，可以在基本不增加費(fèi)用和工作量的前提下，及時檢出致病性弧菌，能有效地減少漏診率，提高檢測效率，方便、準(zhǔn)確,更適宜于生產(chǎn)實踐的普及推廣及流行病學(xué)調(diào)查，是一種較為經(jīng)濟(jì)、實用的檢測手段。</p><p>　　目前關(guān)于魚類弧菌病的研究主要是對該菌的分離鑒定以及該菌的致病性還有一些基本的培養(yǎng)特性，其他方面如免疫學(xué)、病理學(xué)等方面很少涉及。然而作為重要的海洋致病菌，對其的研究有著極其重要的經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)

66、價值。本綜述就魚類弧菌病做了簡單闡述，希望能對將來的研究有參考價值。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn):</b></p><p>　　[1] 林克冰,周宸,劉家富,等. 海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類弧菌病的病原菌[ J ]. 臺灣海峽, 1999, 12(3) : 342～345.</p><p>　　[2] 王軍,蘇永全,張朝霞,等. 閩南地區(qū)養(yǎng)殖魚

67、類細(xì)菌性疾病的病原生物學(xué)研究[ J ]. 廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版) , 2001, 40 (1) : 85～91.</p><p>　　[3] 金珊,蔡完其,王國良,等. 養(yǎng)殖魚類細(xì)菌性疾病的病原研究[ J ]. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版) ,2002, 21 (3) : 225 - 230.</p><p>　　[4] 金珊,王國良. 海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類弧菌病的流行病學(xué)研究[ J ]

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72、 and application of multiplex polymerase chain reaction to detect toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 from aquatic ecosystems [ J ]. Environ Microbiol, 2003, 5 (7) : 599～606.</p><p>　　[14] Donovan T J and

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76、1994, 32 (5) : 103～112.</p><p>　　[17] Lee C Y, Pan S F , Chen C H. Sequence of a cloned pR72H fragment and its use for detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish with the PCR [ J ]. Appl Environ Micro

77、b, 1995, 61 (4) : 1 311～1 317.</p><p>　　[18] Tada J , Ohash T, Nishimura N, et al. Comparison of molecular methods for typing Vibrioparahaemolyticus [ J ]. J Clin Microbiol, 1999, 37 (8) : 2 473～2 478.</p

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81、into A, Ciccarese G, FontanarosaM, et al. Detection of Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus in shellfish samples using collagenase-targeted multiplex-PCR [ J ]. Journal of Food Safety, 2006, 26 (2) : 150～159.

82、</p><p>　　[23] 蔣魯巖,陳光哲,祝長青,等. 應(yīng)用地高辛標(biāo)記的寡聚核酸探針檢測副溶血弧菌[ J ]. 檢驗檢疫科學(xué),2002, 12 (4) : 11～12.</p><p>　　[24] 李寧求,白俊杰,吳淑勤,等. 斜帶石斑魚3種致病弧菌的分子生物學(xué)鑒定[ J ]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2005, 29(3) : 356～361.</p><p>　　[

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84、ed on partial Hsp60 gene sequences[ J ]. Can J Microbiol, 2002 , 48 ( 10 ) : 903 ～910.</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　鮸魚Vibrio pont

85、icus的分離鑒定</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 引言1</b></p><p>　　2材料與方法錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　2.1材料1</b></p><p>　　2.2 病原菌

86、的分離2</p><p>　　2.3 菌體形態(tài)觀察及常規(guī)生理生化鑒定2</p><p>　　2.4 病原菌的回歸感染 2</p><p>　　2.5 藥物敏感性實驗2</p><p>　　2.6 細(xì)菌基因組序列擴(kuò)增，測序和分析2</p><p>　　2.6.1細(xì)菌基因組DNA提取2</p>&

87、lt;p>　　2.6.2 PCR擴(kuò)增2</p><p>　　2.6.3擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測和克隆2</p><p>　　2.6.4序列分析2</p><p><b>　　3 結(jié)果和分析2</b></p><p>　　3.1形態(tài)觀察及常規(guī)生理生化鑒定2</p><p>　　3.2病原菌的回

88、歸感染4</p><p>　　3.3藥物敏感性實驗4</p><p>　　3.4細(xì)菌基因組序列擴(kuò)增、測序和分析5</p><p><b>　　4討論5</b></p><p><b>　　5總結(jié)7</b></p><p><b>　　致謝7</b&

89、gt;</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)8</b></p><p>　　摘要：該論文主要是鑒定一株分離自鮸魚的菌株。主要采用了TCBS平板分離優(yōu)勢菌，形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特征測定，回歸感染試驗，計算LD50，藥敏試驗測定，16S rRNA序列分析鑒定細(xì)菌等鑒定此分離物。通過上述鑒定，該菌株Miiuy croaker –Y090909為革蘭氏陰性，直桿，在25℃下

90、TCBS瓊脂上培養(yǎng)菌落呈黃色的。菌株能在無氣條件下發(fā)酵葡萄糖，氧化酶和過氧化氫酶陽性。它們生長需鈉離子，不能再不添加NaCl的培養(yǎng)基上生長。能8%濃度NaCl下生長，不能再10%濃度NaCl下生長。16S rRNA序列表明與Vibrio ponticus形成一簇，親緣關(guān)系最近。本文主要就鮸魚Vibrio ponticus病菌的生理生化、藥敏實驗及16S rRNA序列做了簡單研究，希望能對將來的研究有參考價值。</p>&l

91、t;p>　　關(guān)鍵詞：Vibrio ponticus；鮸魚；常規(guī)生理生化鑒定；藥物敏感性實驗；16S rRNA測序和分析</p><p>　　Abstract: To identify and characterization of a strain from the spleen of miiuy croaker. In this study, we used conventional biochemica

92、l identification, experimental infection, drug sensitivity tests, 16S rRNA sequencing and analysis, etc. This experiment used TCBS plate to isolate the dominant bacteria. The morphology is Gram-negative and straight rod.

93、 The colonies were yellow on TCBS in 25℃. Oxidase and Catalase were positve. It can grow on the plate with 8% NaCl, but not grow on the plate wi</p><p>　　Keywords: Vibrio ponticus; Miichthys miiuy Basilewsk

94、y; conventional biochemical identification; experimental infection; 16S rRNA sequencing and analysis </p><p><b>　　1 引言</b></p><p>　　鮸魚（Miichthys miiuy Basilewsky），一作米魚，形似鱸魚，但肉質(zhì)略粗糙，體色

95、發(fā)暗，灰褐并帶有紫綠色，腹部灰白。背鰭鰭棘上緣黑色，鰭條部中央有一縱行黑色條紋。胸鰭腋部上方有一晴斑。其余各鰭灰黑色。鮸魚體形為兩側(cè)扁平向后延長狀，背、腹部淺弧形。鮸魚分布于北太平洋西部，包括中國的渤海、黃海及東海，朝鮮和日本南部。中國沿海主要產(chǎn)鮸魚的漁場有：廣東潮汕魚場福建平潭島和兄弟島，浙江岱山和舟山群島，江蘇大沙漁場，山東沿海和渤海，尤以東海的舟山群島產(chǎn)量最大，是寧波一帶的海漁特產(chǎn)之一。鮸魚的主要捕撈方法為底拖網(wǎng)或延繩釣，冬春之際

96、產(chǎn)量較高。每年農(nóng)歷6-8月為舟山群島鮸魚的漁汛期，漁汛期鮸魚以春季生殖洄游和冬季越冬洄游為主，7月為旺汛。每逢大潮汛，漁船競相出海作業(yè)，晨出晚歸，捕獲甚豐。鮸魚肉味鮮美，為海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類之一，也是經(jīng)濟(jì)價值較高的魚類。除鮮食外，肉是作魚丸、敲魚面的上等原料，在溫州頗有盛名；全魚還可制作罐頭或加工成鮸魚鲞；魚鰾可制魚膠，有較高的藥用價值，具養(yǎng)血、補(bǔ)腎、潤肺健脾和消炎作用；魚鱗可制鱗膠；內(nèi)臟、骨可制魚粉、魚油；耳石有清熱去瘀、利尿的作用。鮸魚還

97、是我]國的出口魚類品</p><p>　　隨著鮸魚養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，由于養(yǎng)殖密度過高，養(yǎng)殖區(qū)域水質(zhì)惡化嚴(yán)重，以及鮸魚經(jīng)過多代人工繁殖造成性狀退化，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降等原因,病害頻繁發(fā)生且日趨嚴(yán)重。近年流行的病害主要是細(xì)菌性疾病(弧菌病、腸炎病、爛鰓病等) 、寄生蟲病(纖毛蟲、指環(huán)蟲等) 、水霉病等。其中由弧菌屬細(xì)菌引起的疾病，危害最為嚴(yán)重，每年都給養(yǎng)殖從業(yè)者造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失?；【∈且环N常見的水產(chǎn)動物疾病，

98、在世界各地具有較高的死亡率。弧菌屬有近20個種，包括副溶血性弧菌，霍亂弧菌，創(chuàng)傷弧菌和鰻弧菌。一些新的海洋病原弧菌屬，已在近幾年被報告。我們可以確定在不久的未來，隨著流行病學(xué)研究的不斷發(fā)展，更多病菌很可能將更多的被發(fā)現(xiàn)和鑒定。</p><p>　　鮸魚弧菌病的病原主要為哈氏弧菌(Vibrio harveyi)?；【鷮俚亩喾N弧菌均能引起養(yǎng)殖魚類弧菌病，癥狀表現(xiàn)為多種多樣：潰瘍、爛尾、腹水、爛眼等，其中潰瘍和爛尾是最

99、常見的癥狀[1-3]。這是一種病程短、范圍廣、死亡率高的疾病，流行時間為6-10月，7-8月為高峰期，一般死亡率為30%-40% 最高可達(dá)80%以上。在典型的發(fā)病網(wǎng)箱內(nèi)，從出現(xiàn)少量病魚到大部分發(fā)病死亡歷時約7d。致病菌的準(zhǔn)確快速鑒定是魚病防治的基礎(chǔ)，如何快速準(zhǔn)確檢測養(yǎng)殖鮸魚弧菌病，已成為當(dāng)前鮸魚養(yǎng)殖業(yè)十分重要而突出的問題。</p><p>　　Vibrio ponticus是弧菌屬的一員，2004年發(fā)現(xiàn)的一個新種

100、。目前關(guān)于此類鮸魚弧菌病的研究主要是對該菌的分離鑒定以及該菌的致病性還有一些基本的培養(yǎng)特性，其他方面如免疫學(xué)、病理學(xué)等方面很少涉及。然而作為新發(fā)現(xiàn)的海洋致病菌，對其的研究有著極其重要的經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)價值。本文主要通過傳統(tǒng)方法及16S rRNA序列分析的方法鑒定分離自鮸魚的細(xì)菌，分別從生理生化、藥敏實驗和16S rRNA序列分析等方面鑒定該菌株為V.ponticus。</p><p><b>　　2 實驗

101、方法</b></p><p>　　2.1主要試劑和儀器</p><p>　　離心機(jī)和超低溫冰柜均購自德國Thermo公司，恒溫振蕩器購自江蘇省華利達(dá)試驗設(shè)備公司，電熱恒溫培養(yǎng)箱購自日本EYELA公司，高壓蒸汽滅菌鍋購自日本ALP公司， PCR儀購自美國BIO -RAD公司；普通營養(yǎng)瓊脂和TCBS培養(yǎng)基、藥敏紙片（鏈霉素、新生霉素、氯霉素、四環(huán)素、青霉素G、先鋒霉素V、頭咆哌酮、

102、羧芐青霉素和氨芐青霉素共10種）（杭州天河微生物試劑有限公司）和細(xì)菌微量生化反應(yīng)管（乳糖、木糖、肌醇、V-P試驗 、MR試驗 、靛基質(zhì)試驗、蔗糖、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶等共38種）均購置杭州天河微生物試劑有限公司；T4 DNA連接酶、pMD19-T載體和Ex Taq聚合酶等均購自Takara公司。</p><p><b>　　2.2病原菌的分離</b></p><p&

103、gt;　　樣品：選取癥狀典型的瀕死病魚。</p><p>　　無菌條件下取病魚體表潰瘍、肝、脾、腎等部位作為材料，用普通營養(yǎng)瓊脂和TCBS平板做細(xì)菌分離，置28°C培養(yǎng)24 h。結(jié)果從被檢材料中分離到純度一致的菌株，命名為Miiuy croaker –Y090909，純培養(yǎng)后-70°C保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　2.3菌體形態(tài)觀察及常規(guī)生理生化鑒定</p>

104、;<p>　　用普通光鏡觀察分離細(xì)菌的形態(tài)。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》 和《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》方法對其進(jìn)行生理生化特征測定。取分離的純培養(yǎng)菌，接種于普通液體培養(yǎng)基中，并放置于28℃的搖床中培養(yǎng)24h，使用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管測定鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、β-半乳糖苷（ONPG）、氧化酶、接觸酶、乳糖、木糖、蔗糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、麥芽糖、阿拉伯糖、蜜二糖、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、丙二鹽酸、

105、明膠、硫化氫、尿素、七葉苷、水楊素、葡萄糖（產(chǎn)氣）、葡萄糖磷酸鹽(V-P試驗)、蛋白胨水（靛基質(zhì)）、葡萄糖磷酸鹽（M-R試驗）、葡萄糖酸鹽、西蒙氏枸櫞酸鹽的生理生化特性測定，以及分離病原菌在無鹽胨水、3%氯化鈉胨水、6%氯化鈉胨水、8%氯化鈉胨水、10%氯化鈉胨水的生長狀況。</p><p>　　2.4病原菌的回歸感染</p><p>　　選擇無外傷、游動活潑，重量在200g左右的健康鮸魚

106、作為供試魚，將鮸魚置于塑料桶中暫養(yǎng)1周，穩(wěn)定后隨機(jī)分組進(jìn)行試驗，每4尾魚為1組。試驗用水為天然海水，水溫為20(±1)℃ 。分別取0．1 mL菌懸液，對試驗組魚進(jìn)行腹腔注射感染，同時給對照組魚腹腔注射無菌生理鹽水0．1 mL。試驗期間連續(xù)充氣，每天換水1次，投餌1次。人工感染后連續(xù)觀察7d，連續(xù)觀察魚的體色、活動力、攝食、發(fā)病癥狀和死亡情況。用酒精棉球?qū)Σ◆~的體表消毒，對瀕死病魚進(jìn)行病理變化檢驗，然后在無菌條件下取下肌肉、腎、