鮸魚(yú)vibrio ponticus的分離鑒定【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　鮸魚(yú)Vibrio ponticus的分離鑒定</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專(zhuān)業(yè)班級(jí)

2、 水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱(chēng) </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</

3、b></p><p><b>　　1 引言1</b></p><p>　　2材料與方法錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p><b>　　2.1材料1</b></p><p>　　2.2 病原菌的分離2</p><p>　　2.3 菌體形態(tài)觀察及常規(guī)生理生化鑒定2

4、</p><p>　　2.4 病原菌的回歸感染 2</p><p>　　2.5 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)2</p><p>　　2.6 細(xì)菌基因組序列擴(kuò)增，測(cè)序和分析2</p><p>　　2.6.1細(xì)菌基因組DNA提取2</p><p>　　2.6.2 PCR擴(kuò)增2</p><p>　　2.6

5、.3擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和克隆2</p><p>　　2.6.4序列分析2</p><p><b>　　3 結(jié)果和分析2</b></p><p>　　3.1形態(tài)觀察及常規(guī)生理生化鑒定2</p><p>　　3.2病原菌的回歸感染4</p><p>　　3.3藥物敏感性實(shí)驗(yàn)4</p>

6、;<p>　　3.4細(xì)菌基因組序列擴(kuò)增、測(cè)序和分析5</p><p><b>　　4討論5</b></p><p><b>　　5總結(jié)7</b></p><p><b>　　致謝7</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)8</b&g

7、t;</p><p>　　摘要：該論文主要是鑒定一株分離自鮸魚(yú)的菌株。主要采用了TCBS平板分離優(yōu)勢(shì)菌，形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特征測(cè)定，回歸感染試驗(yàn)，計(jì)算LD50，藥敏試驗(yàn)測(cè)定，16S rRNA序列分析鑒定細(xì)菌等鑒定此分離物。通過(guò)上述鑒定，該菌株Miiuy croaker –Y090909為革蘭氏陰性，直桿，在25℃下TCBS瓊脂上培養(yǎng)菌落呈黃色的。菌株能在無(wú)氣條件下發(fā)酵葡萄糖，氧化酶和過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性。它們生長(zhǎng)需鈉

8、離子，不能再不添加NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。能8%濃度NaCl下生長(zhǎng)，不能再10%濃度NaCl下生長(zhǎng)。16S rRNA序列表明與Vibrio ponticus形成一簇，親緣關(guān)系最近。本文主要就鮸魚(yú)Vibrio ponticus病菌的生理生化、藥敏實(shí)驗(yàn)及16S rRNA序列做了簡(jiǎn)單研究，希望能對(duì)將來(lái)的研究有參考價(jià)值。</p><p>　　關(guān)鍵詞：Vibrio ponticus；鮸魚(yú)；常規(guī)生理生化鑒定；藥物敏感性實(shí)驗(yàn)；

9、16S rRNA測(cè)序和分析</p><p>　　Abstract: To identify and characterization of a strain from the spleen of miiuy croaker. In this study, we used conventional biochemical identification, experimental infection, drug se

10、nsitivity tests, 16S rRNA sequencing and analysis, etc. This experiment used TCBS plate to isolate the dominant bacteria. The morphology is Gram-negative and straight rod. The colonies were yellow on TCBS in 25℃. Oxidase

11、 and Catalase were positve. It can grow on the plate with 8% NaCl, but not grow on the plate wi</p><p>　　Keywords: Vibrio ponticus; Miichthys miiuy Basilewsky; conventional biochemical identification; exper

12、imental infection; 16S rRNA sequencing and analysis 1 引言</p><p>　　鮸魚(yú)（Miichthys miiuy Basilewsky），一作米魚(yú)，形似鱸魚(yú)，但肉質(zhì)略粗糙，體色發(fā)暗，灰褐并帶有紫綠色，腹部灰白。背鰭鰭棘上緣黑色，鰭條部中央有一縱行黑色條紋。胸鰭腋部上方有一晴斑。其余各鰭灰黑色。鮸魚(yú)體形為兩側(cè)扁平向后延長(zhǎng)狀，背、腹部淺弧形。鮸魚(yú)分布于北太平洋

13、西部，包括中國(guó)的渤海、黃海及東海，朝鮮和日本南部。中國(guó)沿海主要產(chǎn)鮸魚(yú)的漁場(chǎng)有：廣東潮汕魚(yú)場(chǎng)福建平潭島和兄弟島，浙江岱山和舟山群島，江蘇大沙漁場(chǎng)，山東沿海和渤海，尤以東海的舟山群島產(chǎn)量最大，是寧波一帶的海漁特產(chǎn)之一。鮸魚(yú)的主要捕撈方法為底拖網(wǎng)或延繩釣，冬春之際產(chǎn)量較高。每年農(nóng)歷6-8月為舟山群島鮸魚(yú)的漁汛期，漁汛期鮸魚(yú)以春季生殖洄游和冬季越冬洄游為主，7月為旺汛。每逢大潮汛，漁船競(jìng)相出海作業(yè)，晨出晚歸，捕獲甚豐。鮸魚(yú)肉味鮮美，為海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)

14、類(lèi)之一，也是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的魚(yú)類(lèi)。除鮮食外，肉是作魚(yú)丸、敲魚(yú)面的上等原料，在溫州頗有盛名；全魚(yú)還可制作罐頭或加工成鮸魚(yú)鲞；魚(yú)鰾可制魚(yú)膠，有較高的藥用價(jià)值，具養(yǎng)血、補(bǔ)腎、潤(rùn)肺健脾和消炎作用；魚(yú)鱗可制鱗膠；內(nèi)臟、骨可制魚(yú)粉、魚(yú)油；耳石有清熱去瘀、利尿的作用。鮸魚(yú)還是我]國(guó)的出口魚(yú)類(lèi)品</p><p>　　隨著鮸魚(yú)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，由于養(yǎng)殖密度過(guò)高，養(yǎng)殖區(qū)域水質(zhì)惡化嚴(yán)重，以及鮸魚(yú)經(jīng)過(guò)多代人工繁殖造成性狀退化，導(dǎo)致機(jī)體抵

15、抗力下降等原因,病害頻繁發(fā)生且日趨嚴(yán)重。近年流行的病害主要是細(xì)菌性疾病(弧菌病、腸炎病、爛鰓病等) 、寄生蟲(chóng)病(纖毛蟲(chóng)、指環(huán)蟲(chóng)等) 、水霉病等。其中由弧菌屬細(xì)菌引起的疾病，危害最為嚴(yán)重，每年都給養(yǎng)殖從業(yè)者造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失?；【∈且环N常見(jiàn)的水產(chǎn)動(dòng)物疾病，在世界各地具有較高的死亡率?；【鷮儆薪?0個(gè)種，包括副溶血性弧菌，霍亂弧菌，創(chuàng)傷弧菌和鰻弧菌。一些新的海洋病原弧菌屬，已在近幾年被報(bào)告。我們可以確定在不久的未來(lái)，隨著流行病學(xué)研究的不

16、斷發(fā)展，更多病菌很可能將更多的被發(fā)現(xiàn)和鑒定。</p><p>　　鮸魚(yú)弧菌病的病原主要為哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。弧菌屬的多種弧菌均能引起養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)弧菌病，癥狀表現(xiàn)為多種多樣：潰瘍、爛尾、腹水、爛眼等，其中潰瘍和爛尾是最常見(jiàn)的癥狀[1-3]。這是一種病程短、范圍廣、死亡率高的疾病，流行時(shí)間為6-10月，7-8月為高峰期，一般死亡率為30%-40% 最高可達(dá)80%以上。在典型的發(fā)病網(wǎng)箱內(nèi)，從出現(xiàn)少量病

17、魚(yú)到大部分發(fā)病死亡歷時(shí)約7d。致病菌的準(zhǔn)確快速鑒定是魚(yú)病防治的基礎(chǔ)，如何快速準(zhǔn)確檢測(cè)養(yǎng)殖鮸魚(yú)弧菌病，已成為當(dāng)前鮸魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)十分重要而突出的問(wèn)題。</p><p>　　Vibrio ponticus是弧菌屬的一員，2004年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新種。目前關(guān)于此類(lèi)鮸魚(yú)弧菌病的研究主要是對(duì)該菌的分離鑒定以及該菌的致病性還有一些基本的培養(yǎng)特性，其他方面如免疫學(xué)、病理學(xué)等方面很少涉及。然而作為新發(fā)現(xiàn)的海洋致病菌，對(duì)其的研究有著極其重要

18、的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。本文主要通過(guò)傳統(tǒng)方法及16S rRNA序列分析的方法鑒定分離自鮸魚(yú)的細(xì)菌，分別從生理生化、藥敏實(shí)驗(yàn)和16S rRNA序列分析等方面鑒定該菌株為V.ponticus。</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.1主要試劑和儀器</p><p>　　離心機(jī)和超低溫冰柜均購(gòu)自德國(guó)Thermo公司，

19、恒溫振蕩器購(gòu)自江蘇省華利達(dá)試驗(yàn)設(shè)備公司，電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自日本EYELA公司，高壓蒸汽滅菌鍋購(gòu)自日本ALP公司， PCR儀購(gòu)自美國(guó)BIO -RAD公司；普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和TCBS培養(yǎng)基、藥敏紙片（鏈霉素、新生霉素、氯霉素、四環(huán)素、青霉素G、先鋒霉素V、頭咆哌酮、羧芐青霉素和氨芐青霉素共10種）（杭州天河微生物試劑有限公司）和細(xì)菌微量生化反應(yīng)管（乳糖、木糖、肌醇、V-P試驗(yàn) 、MR試驗(yàn) 、靛基質(zhì)試驗(yàn)、蔗糖、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、賴(lài)氨酸脫羧酶等共38種

20、）均購(gòu)置杭州天河微生物試劑有限公司；T4 DNA連接酶、pMD19-T載體和Ex Taq聚合酶等均購(gòu)自Takara公司。</p><p><b>　　2.2病原菌的分離</b></p><p>　　樣品：選取癥狀典型的瀕死病魚(yú)。</p><p>　　無(wú)菌條件下取病魚(yú)體表潰瘍、肝、脾、腎等部位作為材料，用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和TCBS平板做細(xì)菌分離，置2

21、8°C培養(yǎng)24 h。結(jié)果從被檢材料中分離到純度一致的菌株，命名為Miiuy croaker –Y090909，純培養(yǎng)后-70°C保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　2.3菌體形態(tài)觀察及常規(guī)生理生化鑒定</p><p>　　用普通光鏡觀察分離細(xì)菌的形態(tài)。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》 和《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》方法對(duì)其進(jìn)行生理生化特征測(cè)定。取分離的純培養(yǎng)菌，接種于普通液體培養(yǎng)基

22、中，并放置于28℃的搖床中培養(yǎng)24h，使用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管測(cè)定鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、賴(lài)氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、β-半乳糖苷（ONPG）、氧化酶、接觸酶、乳糖、木糖、蔗糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、麥芽糖、阿拉伯糖、蜜二糖、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、丙二鹽酸、明膠、硫化氫、尿素、七葉苷、水楊素、葡萄糖（產(chǎn)氣）、葡萄糖磷酸鹽(V-P試驗(yàn))、蛋白胨水（靛基質(zhì)）、葡萄糖磷酸鹽（M-R試驗(yàn)）、葡萄糖酸鹽、西蒙氏枸櫞酸鹽的生理生化特性測(cè)定，以及分離

23、病原菌在無(wú)鹽胨水、3%氯化鈉胨水、6%氯化鈉胨水、8%氯化鈉胨水、10%氯化鈉胨水的生長(zhǎng)狀況。</p><p>　　2.4病原菌的回歸感染</p><p>　　選擇無(wú)外傷、游動(dòng)活潑，重量在200g左右的健康鮸魚(yú)作為供試魚(yú)，將鮸魚(yú)置于塑料桶中暫養(yǎng)1周，穩(wěn)定后隨機(jī)分組進(jìn)行試驗(yàn)，每4尾魚(yú)為1組。試驗(yàn)用水為天然海水，水溫為20(±1)℃ 。分別取0．1 mL菌懸液，對(duì)試驗(yàn)組魚(yú)進(jìn)行腹腔注射

24、感染，同時(shí)給對(duì)照組魚(yú)腹腔注射無(wú)菌生理鹽水0．1 mL。試驗(yàn)期間連續(xù)充氣，每天換水1次，投餌1次。人工感染后連續(xù)觀察7d，連續(xù)觀察魚(yú)的體色、活動(dòng)力、攝食、發(fā)病癥狀和死亡情況。用酒精棉球?qū)Σ◆~(yú)的體表消毒，對(duì)瀕死病魚(yú)進(jìn)行病理變化檢驗(yàn)，然后在無(wú)菌條件下取下肌肉、腎、肝和脾等部位的組織小塊劃線接種于TCBS培養(yǎng)基平板，在28℃下恒溫倒置培養(yǎng)24 h。挑取平板中形態(tài)特征一致的優(yōu)勢(shì)菌，接種于TCBS培養(yǎng)及平板，在28℃下恒溫倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落

25、形態(tài)。</p><p>　　2.5藥物敏感性實(shí)驗(yàn)</p><p>　　用藥敏紙片法在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上測(cè)定鮸魚(yú)病原菌對(duì)藥物的敏感性。在28℃恒溫培養(yǎng)24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑大小。再根據(jù)紙片法藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)得出對(duì)各種抗菌藥物的敏感性。</p><p>　　2.6細(xì)菌基因組序列擴(kuò)增、測(cè)序和分析</p><p>　　2.6.1 細(xì)菌基

26、因組DNA提?。?lt;/p><p>　　采用Wilson描述的方法提取鮸魚(yú)病原菌的基因組DNA作為模板。</p><p>　　2.6.2 PCR擴(kuò)增：</p><p>　　16S rRNA基因PCR擴(kuò)增所需要的兩個(gè)引物為16S（+）：5'-AGA GTT TGA TCATGG CTC AG-3' 、16S（-）：5'-GGT TAC CTT G

27、TT ACG ACT T-3'。 在20μL的PCR反應(yīng)體系中含有：引物各0.2μL，模板DNA1μL，2.5U/μL的Taq DNA聚合酶0.2μL ，4×dNTP混合物0.4μL，1×PCR緩沖液2μL，無(wú)菌蒸餾水14.4μL，1.5mmol/L MgCl2 1.6μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min，接著94℃變性30s、55℃復(fù)性1min和72℃延伸2min如此30個(gè)循環(huán)后，72℃溫育6min

28、。</p><p>　　2.6.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和克?。?lt;/p><p>　　瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶回收后克隆至pMD19-T載體，序列測(cè)定由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。</p><p>　　2.6.4 序列分析：</p><p>　　采用ClustalW程序進(jìn)行多重序列比對(duì)后，用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

29、</p><p><b>　　3結(jié)果及分析</b></p><p>　　3.1 形態(tài)觀察及常規(guī)生理生化鑒定</p><p>　　菌株為革蘭氏陰性菌（見(jiàn)圖1），直桿，長(zhǎng)度約3.0μm，寬度約1.5μm，有1-2根極生鞭毛。菌落光滑，圓形，無(wú)色素，不發(fā)光，不泳動(dòng)。它們培養(yǎng)基上培養(yǎng)在25℃下，經(jīng)48 小時(shí)，長(zhǎng)出的菌落為2-3mm。在25℃下TCBS瓊

30、脂上培養(yǎng)48小時(shí)后是黃色的。菌株生長(zhǎng)需要Na+。能在8%Nacl條件下能生長(zhǎng)，不能在10%Nacl中生長(zhǎng)。在4℃、40℃下不生長(zhǎng)。</p><p>　　圖1 優(yōu)勢(shì)菌革蘭氏染色(100 x)</p><p>　　Fig.1 Gram stain of The dominant bacteria (100 x)</p><p>　　生理生化特征：對(duì)半乳糖，甘露糖，甘露醇

31、，麥芽糖，葡萄糖磷酸鹽（MR），賴(lài)氨酸脫羧酶，賴(lài)氨酸脫羧酶，精氨酸雙水解酶，氧化酶，接觸酶等顯陽(yáng)性；對(duì)乳糖，木糖，肌醇，蔗糖，山梨醇，鼠李糖，丙二鹽酸，阿拉伯糖，明膠，蜜二糖，硫化氫，葡萄糖磷酸鹽(VP)，西蒙氏枸櫞酸鹽，蛋白胨水（靛基質(zhì)），β-半乳糖苷（ONPG），尿素，七葉苷，水楊素等顯陰性（見(jiàn)表1）。</p><p>　　表1 Vibro ponticus常規(guī)生理生化鑒定</p><p&

32、gt;　　Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of isolates</p><p><b>　　3.2回歸感染實(shí)驗(yàn)</b></p><p>　　注射無(wú)菌的對(duì)照組安然無(wú)恙。對(duì)魚(yú)進(jìn)行腹腔注射，在感染后的3天，不同程度呈現(xiàn)出潰瘍及皮下出血癥狀。該菌株可重新從死魚(yú)腎臟中分離得到。</p>&l

33、t;p>　　3.3藥物敏感性實(shí)驗(yàn)</p><p>　　用紙片法測(cè)定了具有代表性的12種抗菌藥物對(duì)菌株Miiuy croaker –Y090909的抑制作用，結(jié)果表明該菌對(duì)鏈霉素，四環(huán)素，氨芐青霉素，丁胺卡那，青霉素G等藥物表現(xiàn)為中敏；而對(duì)頭咆哌酮，羧芐青霉素，新生霉素，氯霉素，先鋒霉素V，O/129診斷試紙等藥物表現(xiàn)為高敏(見(jiàn)表2)。</p><p>　　表2 ：Vibro pont

34、icus藥物敏感性實(shí)驗(yàn)</p><p>　　Tab.2 pharmic sensitivity of isolates </p><p>　　注：“-”表示無(wú)抑菌圈，“S”表示敏感，“I”表示中介，“R”表示耐藥。</p><p>　　Note：“-”：no zone of inhibition around disk；

35、“S” =sensitive；“I”= interim；“R”=resistant．</p><p>　　3.4細(xì)菌基因組序列擴(kuò)增、測(cè)序和分析</p><p>　　菌株Miiuy croaker –Y090909的16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，分別克隆并測(cè)定序列。細(xì)菌16S rRNA基因1513個(gè)核苷酸序列比較表明，Miiuy croaker –Y090909與Vibro ponti

36、cus核苷酸序列同源性最高，為99.4%~99.5%[4]。16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，Miiuy croaker –Y090909與Vibro ponticus系統(tǒng)進(jìn)化相關(guān)性最高，與同科的弧菌屬成員進(jìn)化相關(guān)性次之，但與同屬其他兩個(gè)成員進(jìn)化相關(guān)性較遠(yuǎn)（圖2）。序列分析結(jié)果揭示，菌株Miiuy croaker –Y090909與Vibro ponticus是一個(gè)分離物[5]。</p><p>　　圖2

37、部分弧菌科成員16S rRNA基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析</p><p>　　Fig:2 Members of Vibrionaceae nucleotide sequences of 16S rRNA gene phylogenetic analysis</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　V.ponticu

38、s是弧菌屬的一員，2004年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新種。目前關(guān)于此類(lèi)弧菌病的研究主要是對(duì)該菌的分離鑒定以及該菌的致病性還有一些基本的培養(yǎng)特性，其他方面如免疫學(xué)、病理學(xué)等方面很少涉及。然而作為新發(fā)現(xiàn)的海洋致病菌，對(duì)其的研究有著極其重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。本文主要通過(guò)傳統(tǒng)方法鑒定該菌。分別從生理生化、藥敏實(shí)驗(yàn)和16S rRNA序列分析等方面來(lái)鑒定菌株，得出分離出的細(xì)菌為V.ponticus。</p><p>　　本次對(duì)V. p

39、onticus的菌種判定，是通過(guò)比較系統(tǒng)的表觀生物學(xué)分類(lèi)指征檢驗(yàn)與16S rRNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析相結(jié)合在一起進(jìn)行的。就個(gè)別的生理生化特性指標(biāo)來(lái)講，該分離菌與記載的生化性質(zhì)存在著一些差異。這些表明在對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種的鑒定時(shí)不能僅僅依賴(lài)于生化指標(biāo)的完全一致性，從不同地方分離而來(lái)的同種菌株間可能存在著個(gè)別生理生化特性的差異。藥敏測(cè)定結(jié)果顯示，在所測(cè)得10種藥物中，結(jié)果表明該菌對(duì)鏈霉素，四環(huán)素，氨芐青霉素，丁胺卡那，青霉素G等藥物表現(xiàn)

40、為中敏；而對(duì)頭咆哌酮，羧芐青霉素，新生霉素，氯霉素，先鋒霉素V，O/129診斷試紙等藥物表現(xiàn)為高敏?？赡芤?yàn)樵摼隇樾滦妥儺惖木?，?duì)藥物的敏感性還較高。但是我們?cè)谄綍r(shí)的用藥過(guò)程中還是要注意適度原則，避免使該菌株出現(xiàn)對(duì)大量的藥物耐藥的現(xiàn)象?？傊緦?shí)驗(yàn)對(duì)分離菌株進(jìn)行了較為系統(tǒng)的生理生化特性的檢驗(yàn)，相對(duì)地豐富了V. ponticus的一些生物學(xué)性狀內(nèi)容，將可能有益于對(duì)該菌的分離與鑒定。</p><p>　　V.po

41、nticus研究報(bào)道較少。最早在2004年，Macia'n等首次分離自在西班牙海水中貽貝和病變鯛（金頭鯛）。其研究發(fā)現(xiàn)，四個(gè)V.ponticus株（AJ630103，AJ630102，AJ630202，AJ630203）和河流弧菌和V. furnissii 在16 rDNA序列上有高度同源（大于97％），但吲哚和賴(lài)氨酸脫羧酶基因處有所不同，這兩個(gè)酶與表型功能密切相關(guān)。此外，河流弧菌和V. furnissii在40℃均能生長(zhǎng)，并且

42、能水解明膠，但V.ponticus卻不能。Xie 等研究中還利用了UPPCR - DGGE技術(shù)迅速檢測(cè)細(xì)菌病原體，在DGGE模式研究的基礎(chǔ)上，鑒定結(jié)果所有分離出的V.ponticus菌株是同一種類(lèi)。這證明V.ponticus是廣東流行的日本鱸魚(yú)的病原。</p><p>　　傳統(tǒng)方法檢測(cè)包括直接培養(yǎng)、生理生化方法、組織切片觀察法和超薄切片電鏡觀察法，是目前養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)弧菌病診斷的主要方法。另外，關(guān)于魚(yú)類(lèi)弧菌病的檢測(cè)方法

43、，還有一種先進(jìn)的比較常用的技術(shù)——免疫學(xué)技術(shù)。免疫學(xué)技術(shù)是利用特異性抗原抗體反應(yīng),觀察和研究組織細(xì)胞特定抗原(或抗體)的定位和定量技術(shù)。具有高特異性、高靈敏性等特點(diǎn)，該技術(shù)將抗原、抗體的免疫反應(yīng)相結(jié)合，縮短了病原菌的檢測(cè)時(shí)間,提高了診斷的準(zhǔn)確性，是目前養(yǎng)殖鮸魚(yú)弧菌病早期檢測(cè)技術(shù)中研究較為廣泛深入的檢測(cè)技術(shù)。</p><p>　　熒光抗體技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，以熒光素作為標(biāo)記物，與已知的抗體結(jié)合(

44、不影響其免疫特性)作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于鑒定未知的抗原，可在熒光顯微鏡下檢查呈現(xiàn)熒光的特異性抗原抗體復(fù)合物及其存在部位。此項(xiàng)技術(shù)是應(yīng)用免疫反應(yīng)的特異性與靈敏性，并與顯微鏡的精確性相結(jié)合，成為現(xiàn)代免疫學(xué)研究中的標(biāo)記免疫檢測(cè)方法之一。王軍[6]、鄢慶枇[7]等分別建立了檢測(cè)鮸魚(yú)溶藻弧菌,副溶血弧菌的間接熒光抗體快速檢測(cè)技術(shù)。免疫熒光技術(shù)不僅能快速檢測(cè)患病動(dòng)物的病原，檢測(cè)的時(shí)間一般不超過(guò)3h，為疾病的及時(shí)對(duì)癥治療贏得了寶貴的時(shí)間，而且該方法還能夠

45、檢測(cè)到帶菌狀態(tài)或未發(fā)病的被感染個(gè)體。姚斐[8]等報(bào)道了利用間接免疫熒光技術(shù)還可檢出處于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)菌，由于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)菌仍具有毒性，并可在一定條件下復(fù)蘇造成疾病的暴發(fā)流行，因此加強(qiáng)活的非可培養(yǎng)狀態(tài)病原菌的檢測(cè)在鮸魚(yú)弧菌病的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)上是很有意義的。但免疫熒光技術(shù)的缺點(diǎn)是非特異性染色問(wèn)題難以完全解決；操作程序較繁瑣;需要特殊的昂貴儀器(熒光顯微鏡)；染色標(biāo)本不能長(zhǎng)期保存等。</p><p>　　免疫酶

46、技術(shù)也是免疫學(xué)診斷的一條新途徑,與免疫熒光技術(shù)相比，它只需普通光學(xué)顯微鏡即可進(jìn)行觀察。它利用了抗原- 抗體反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性，通過(guò)肉眼或顯微鏡觀察及分光光度計(jì)測(cè)定,達(dá)到在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的位置,以及對(duì)其進(jìn)行定量的目的。該方法具有高效、經(jīng)濟(jì)、方便等特點(diǎn)。按是否將抗原或抗體結(jié)合到固相載體上,免疫酶技術(shù)可分為固相、均相和雙抗體酶免疫測(cè)定技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( EL ISA)是目前應(yīng)用最廣泛的固相免疫酶測(cè)定

47、技術(shù)。楊鳶劼[9]等建立了檢測(cè)鰻弧菌的間接EL ISA技術(shù)，其檢測(cè)的敏感性閾值為1 ×105 個(gè)/mL。鄢慶枇[10]、王軍[11]分別改良了間接EL ISA 法檢測(cè)鮸魚(yú)溶藻弧菌和副溶血弧菌，其最低檢測(cè)極限分別為為9. 7 ×104 cfu /mL和5. 0 ×104 cfu /mL。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)不僅可以用于患病鮸魚(yú)的診斷，也可以用于無(wú)病癥帶菌鮸魚(yú)的檢測(cè),結(jié)果可多次重復(fù)，穩(wěn)定，底物顯色清晰

48、，不需特殊儀器用肉眼即可觀察，快速，并同時(shí)可測(cè)大量的樣品。為了更好地將這種快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐，必須要在縮短檢測(cè)時(shí)間、提</p><p>　　免疫學(xué)方法雖比傳統(tǒng)方法在許多方面有了較大進(jìn)步，也存在不少問(wèn)題?？贵w在體內(nèi)的形成往往需要一段時(shí)間，而且抗體一旦產(chǎn)生,即使病愈后還可能長(zhǎng)時(shí)間存在，陽(yáng)性結(jié)果還不能做出確診。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)具備免疫學(xué)方法的長(zhǎng)處，靈敏度高，但操作麻煩，除了對(duì)抗血清要求嚴(yán)格外，

49、還可能存在一定程度的交叉反應(yīng)，并且其結(jié)果受樣品濃度影響，易出現(xiàn)假陽(yáng)性或微陽(yáng)性。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和分子雜交等手段為鮸魚(yú)弧菌病檢測(cè)提供了新N的研究思路。</p><p>　　分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)是最近新流行的一種檢測(cè)方法，它包括PCR及其衍生技術(shù)，PCR與分子雜交聯(lián)用技術(shù)和16S rRNA和熱激蛋白基因檢測(cè)技術(shù)</p><p>　　PCR及其衍生技術(shù)即酶鏈反應(yīng)技術(shù)

50、( PCR)，是指在引物的作用下,體外酶促反應(yīng)，迅速擴(kuò)增DNA片段的一種方法。該技術(shù)具有特異性好、對(duì)感染早期診斷非常有效、檢測(cè)速度快且靈敏等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外關(guān)于弧菌的分子檢測(cè)主要集中在霍亂弧菌，副溶血弧菌的研究上,偏重于醫(yī)學(xué)、食品安全和水域環(huán)境方向[12,13] ，但對(duì)養(yǎng)殖鮸魚(yú)弧菌病早期檢測(cè)具有很強(qiáng)的借鑒意義，是未來(lái)鮸魚(yú)弧菌病檢測(cè)發(fā)展的主流。Kim，Lee等針對(duì)副溶血弧菌部分toxR基因，直接溶血素基因, pR72H片段分別建立了多種特異性

51、PCR 檢測(cè)方法[14~17]。Conejero和L Pang針對(duì)哈維氏弧菌的部分toxR基因和溶血素基因分別建立了特異性PCR 檢測(cè)技[18~20]。常規(guī)的PCR檢測(cè)法為單對(duì)引物擴(kuò)增一種病原體DNA，一次只能檢測(cè)一種病原體或一個(gè)基因型別，基因型別和混合感染的檢測(cè)顯得操作煩瑣，費(fèi)時(shí)且成本高，而且容易產(chǎn)生漏診。而養(yǎng)殖鮸魚(yú)可能致病性弧菌種類(lèi)多，病癥表現(xiàn)多樣，難以用一種方法進(jìn)行確診。多重PCR技術(shù)是將多對(duì)引物混合后于一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)進(jìn)行多種病

52、原體擴(kuò)增,能有效地解決上述問(wèn)題,一種方法能檢出多種致病性弧菌,使得診斷及分型變得簡(jiǎn)捷。D</p><p>　　PCR與分子雜交聯(lián)用技術(shù)在國(guó)內(nèi)外構(gòu)建弧菌的基因文庫(kù)或部分基因文庫(kù)的研究工作并不算多，對(duì)于一些弧菌的特異性核酸探針的制備尚有較大困難。另外，分子雜交檢測(cè)靈敏度要比PCR方法低，分子雜交聯(lián)用法來(lái)檢測(cè)病原可以提高靈敏度。蔣魯巖[22]等在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，合成探針，應(yīng)用D IG標(biāo)記試劑盒對(duì)特異擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，

53、標(biāo)記探針可與副溶血弧菌DNA的TDH基因特異性地雜交，從而建立了副溶血弧菌的斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法?？梢酝瑫r(shí)處理數(shù)百甚至上千份樣品,適于大批量標(biāo)本檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用非放射性探針，快速簡(jiǎn)便且對(duì)操作者健康無(wú)害。副溶血弧菌也是鮸魚(yú)弧菌病的可能致病菌之一，將之進(jìn)行改良制成試劑盒也可應(yīng)用于鮸魚(yú)弧菌病的檢測(cè)中。</p><p>　　16S rRNA為所有生物體生存所必需的基因序列并且也是較保守的序列之一。16S rRNA的序列檢測(cè)已被

54、成功地建立為一種鑒定微生物種、屬、家族種類(lèi)的標(biāo)準(zhǔn)方法。</p><p>　　目前，16S rRNA檢測(cè)技術(shù)在人醫(yī)及獸醫(yī)開(kāi)始得到廣泛應(yīng)用，在水產(chǎn)病害方面也開(kāi)始運(yùn)用。但由于16S rRNA的進(jìn)化速度非常慢，即太保守，無(wú)法區(qū)分某些種系非常接近的菌種及同一菌種的不同菌株。而熱激蛋白(Heat shockp rotein, HSP)是另一類(lèi)常用于生物進(jìn)化和分類(lèi)研究的大分子物質(zhì)。廣泛存在于細(xì)菌及真核生物細(xì)胞中。其主要功能是作

55、為分子伴侶參與蛋白質(zhì)肽鏈折疊和組裝。進(jìn)化速度比16S rRNA快,攜帶更多的多態(tài)信息。我們對(duì)養(yǎng)殖鮸魚(yú)多種致病性弧菌分別進(jìn)行16S rRNA和HSP分子鑒定，發(fā)現(xiàn)HSP60基因更適合用于研究海洋弧菌系統(tǒng)分類(lèi)鑒定，以HSP60基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)在置信度上普遍明顯高于16S rRNA 基因。這與李寧求[23]、張偉妮[24]、Kwok[25]等的研究結(jié)論一致。</p><p><b>　　5 總 結(jié)</b

56、></p><p>　　本次對(duì)V.ponticus的菌種判定，是通過(guò)比較系統(tǒng)的表觀生物學(xué)分類(lèi)指征檢驗(yàn)與16S rRNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析相結(jié)合在一起進(jìn)行的。就個(gè)別的生理生化特性指標(biāo)來(lái)講，該分離菌與記載的生化性質(zhì)存在著一些差異。這些表明在對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種的鑒定時(shí)不能僅僅依賴(lài)于生化指標(biāo)的完全一致性，從不同地方分離而來(lái)的同種菌株間可能存在著個(gè)別生理生化特性的差異。藥敏測(cè)定結(jié)果顯示，在所測(cè)得10種藥物中，結(jié)果

57、表明該菌對(duì)鏈霉素，四環(huán)素，氨芐青霉素，丁胺卡那，青霉素G等藥物表現(xiàn)為中敏；而對(duì)頭咆哌酮，羧芐青霉素，新生霉素，氯霉素，先鋒霉素V，O/129診斷試紙等藥物表現(xiàn)為高敏?？赡芤?yàn)樵摼隇樾滦妥儺惖木辏瑢?duì)藥物的敏感性還較高。但是我們?cè)谄綍r(shí)的用藥過(guò)程中還是要注意適度原則，避免使該菌株出現(xiàn)對(duì)大量的藥物耐藥的現(xiàn)象?？傊?，本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離菌株進(jìn)行了較為系統(tǒng)的生理生化特性的檢驗(yàn)，相對(duì)地豐富了V.ponticus的一些生物學(xué)性狀內(nèi)容，將可能有益于對(duì)該菌的分

58、離與鑒定。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 林克冰,周宸,劉家富,等. 海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖鮸魚(yú)弧菌病的病原菌[J].臺(tái)灣海峽,1999, 12(3):342～345.</p><p>　　[2] 王軍,蘇永全,張朝霞,等. 閩南地區(qū)養(yǎng)殖鮸魚(yú)細(xì)菌性疾病的病原生物學(xué)研究[J].廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2001

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