魷魚肝水解工藝的優(yōu)化及水解液毒理研究【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　魷魚肝水解工藝的優(yōu)化及水解液毒理研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 生

2、物工程 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</b>

3、;</p><p>　　引言………………………………………………………………………………………………………………… 1</p><p>　　1 材料與方法……………………………………………………………………………………………………….1</p><p>　　1.1 材料………………………………………………………………………………………………………..1</p&

4、gt;<p>　　1.2 方法………………………………………………………………………………………………………..2</p><p>　　1.2.1 樣品處理…………………………………………………………………………………………...2</p><p>　　1.2.2 營養(yǎng)成分分析……………………………………………………………………………………...2</p>&l

5、t;p>　　1.2.3 無機(jī)元素含量測定………………………………………………………………………………...2</p><p>　　1.2.4 水解條件優(yōu)化……………………………………………………………………………………...2</p><p>　　1.2.4.1 酶的選取……………………………………………………………………………………2</p><p>　　1

6、.2.4.2 酶的單因素試驗(yàn)……………………………………………………………………………3</p><p>　　1.2.4.3響應(yīng)面設(shè)計(jì)………………………………………………………………….………………3</p><p>　　1.2.4.4 水解液中氨基酸的測定……………………………………………………………………3</p><p>　　1.2.5 急性毒理實(shí)驗(yàn)……………

7、………………………………………………………………………...3</p><p>　　1.2.5.1 劑量確定……………………………………………………………………………………3</p><p>　　1.2.5.2 毒理實(shí)驗(yàn)……………………………………………………………………………………3</p><p>　　1.2.5.3 指標(biāo)測定………………………………………………

8、……………………………………3</p><p>　　2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果………………………………………………………………………………………………………….3</p><p>　　2.1 基本營養(yǎng)成分……………………………………………………………………………………………..3</p><p>　　2.2 無機(jī)元素含量………………………………………………………………………………

9、……………..4</p><p>　　2.3 不同酶的水解度…………………………………………………………………………………………..4</p><p>　　2.4 酶濃度……………………………………………………………………………………………………..4</p><p>　　2.5 料液比……………………………………………………………………………………………………..

10、5</p><p>　　2.6 時(shí)間………………………………………………………………………………………………………..5</p><p>　　2.7 溫度………………………………………………………………………………………………………..6</p><p>　　2.8 pH…………………………………………………………………………………………………………..6</

11、p><p>　　2.9 響應(yīng)面設(shè)計(jì)………………………………………………………………………………………………..7</p><p>　　2.10水解液中氨基酸含量…………………………………………….……………………………………..10</p><p>　　2.11急性毒理實(shí)驗(yàn)結(jié)果…………….………………………………………………………………………..10</p>

12、<p>　　3 討論……………………………………………………………………………………………………………...11</p><p>　　4 結(jié)論……………………………………………………………………………………………………………...11</p><p>　　致謝………………………………………………………………………………………………………………...13</p>

13、<p>　　參考文獻(xiàn)…………………………………………………………………………………………………………...14</p><p>　　摘 要：對魷魚肝臟進(jìn)行營養(yǎng)成分的分析，并選取合適的酶對其進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)。以水解度為評價(jià)指標(biāo)，在溫度、時(shí)間、料液比等單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面技術(shù)對水解工藝進(jìn)一步優(yōu)化，確定了復(fù)合蛋白酶最佳水解條件：在pH=7.5，加酶量為5%，料液比為1:5.17，溫度67.2℃條件下，

14、水解104.8min。因?yàn)楦闻K在動物體內(nèi)起到排毒、解毒的作用，因此對其水解液內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)的組成及食用安全性進(jìn)行了探討，為進(jìn)一步對其進(jìn)行高值化利用提供了理論依據(jù)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：魷魚；內(nèi)臟；水解；氨基酸；毒理研究</p><p>　　Abstract: Analysing the nutrition composition of squid liver, and selecti

15、ng an appropriate enzyme for the hydrolysis experiment. The index for the evaluation is the degree of hydrolysis, on the basis of the temperature, time, ratio of material to water and some other single factor experiments

16、, using response surface to further optimize the hydrolysis technology, Determine the optimal hydrolysis conditions for protease: pH = 7.5, enzyme concentration is 5%, ratio of material to water is 1:5.17, a</p>&

17、lt;p>　　Keywords: Squid; Liver; Hydrolysis; Amino acids; Toxicological studies</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　魷魚是軟體動物門（Mollusca）、頭足綱（Cephalopoda）、鞘亞綱（Coleoidea)、十腕總目(Decapodiformes)、槍

18、形目(Teuthida)、柔魚科（Ommastrephidae）和槍形目、閉眼亞目(Myopsida)、槍烏賊科（Loliginidae）動物的俗稱[1]，亦稱柔魚。魷魚體扁長，頭腕似佛手狀，肉鰭緊附在尾部兩側(cè)，形似雙髻，全身均為淺粉色，表面有白霜。主要產(chǎn)于我國廣東、福建、浙江，產(chǎn)期為7-8月，日本、越南、朝鮮也產(chǎn)。魷魚是名貴的海產(chǎn)品，富含蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵等，并含有十分豐富的諸如硒、碘、錳、銅等微量元素的食物，對骨骼發(fā)育和造血十分有益

19、，可預(yù)防貧血。魷魚除了富含蛋白質(zhì)及人體所需的氨基酸外，還是含有大量牛磺酸的一種低熱量食品[2]。因此魷魚是一種優(yōu)質(zhì)的水產(chǎn)品加工原材料。</p><p>　　近10年來，隨著我國北太平洋的魷釣業(yè)規(guī)模不斷形成擴(kuò)大，魷魚的捕撈總量逐年提升，進(jìn)口量也逐年擴(kuò)大。浙江是魷魚加工大省，僅浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司2007年的魷魚加工量就將近20萬噸[3]。然而，我國魷魚目前的生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品層次比較低，主要從事簡單的來料加工，如魷魚絲、

20、魷魚片、魷魚段等。原料并未得到充分利用，附加值低，尤其是加工下腳料，多為內(nèi)臟、皮、魷魚嘴等，其占魷魚總量的15%-20%，大都加工成魚粉，部分甚至直接丟棄或掩埋，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。因此，有必要對魷魚下腳料進(jìn)行新一輪的研究，以提高其附加值，國內(nèi)外有不少科研院校和企業(yè)單位正在研究和開發(fā)魷魚加工下腳料中的功能活性物質(zhì)，一些新穎的水產(chǎn)加工廢棄物的資源再利用技術(shù)正在得到有效開發(fā)。</p><p>　　魷魚內(nèi)臟占魷魚濕

21、重的15%左右，其中大部分為肝臟，因其含有可以促進(jìn)魚蝦攝餌的氨基酸，所以一般加工成魚蝦飼料[4-5]，而并沒有充分利用。</p><p>　　魷魚肝臟含有20%-30%的粗脂肪，郭無瑕等[6] 系統(tǒng)的地研究了從魷魚肝臟中提取油脂與精煉魚油的方法，并證實(shí)精煉后的魷魚油澄清透明，略顯淡黃色，并有淡淡的魚腥味，其各項(xiàng)指標(biāo)均符合SC/T3502- 2000魚油一級標(biāo)準(zhǔn)。在此基礎(chǔ)上，其用氣相色譜/質(zhì)譜法分析了魷魚油中脂肪酸

22、的成分。結(jié)果表明，精煉魷魚油中多不飽和脂肪酸(PUFA)的含量較高(36.5%)，其中C20:5(EPA)和C22:6(DHA)的含量分別為13.1%和20.3%。這與王慶梅等[7]利用氣相色譜法分析魷魚中脂肪酸的成分得到的結(jié)論基本一致。可見，魷魚肝臟是提取EPA和DHA的良好原料。且魷魚肝臟油由于其不飽和脂肪酸含量高，而在10℃左右的室溫下不凝結(jié)，在醫(yī)藥和飼料工業(yè)中有較廣泛的利用前景 [8]。</p><p>

23、　　將魷魚肝臟中的大部分粗脂肪提取后的剩余部分，大約占魷魚肝臟濕重的55%-65%，如果將其丟棄，則會產(chǎn)生大量的二次廢棄物，而沒有實(shí)現(xiàn)對魷魚內(nèi)臟的充分利用。剩余的魷魚肝臟其基本營養(yǎng)成分是以蛋白質(zhì)為主，如可選取合適的酶將其水解，并對水解的條件優(yōu)化，對水解液進(jìn)一步分析利用，則會是一種方便、快捷且較實(shí)用的再利用方式。</p><p>　　本文對魷魚肝臟進(jìn)行營養(yǎng)成分的分析，并選取合適的酶對其進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)。在溫度、時(shí)間、料

24、液比等單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面技術(shù)對水解工藝進(jìn)一步優(yōu)化。因?yàn)楦闻K在動物體內(nèi)起到排毒、解毒的作用，因此對其水解液內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)的組成及食用安全性進(jìn)行了探討，為進(jìn)一步對其進(jìn)行高值化利用提供了理論依據(jù)。</p><p><b>　　材料與方法 </b></p><p><b>　　材料</b></p><p>　　ICR小鼠

25、，體重（20±2）g，購于浙江省動物實(shí)驗(yàn)中心。中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶購于廣西南寧龐博酶制劑有限公司，其它試劑均為分析純，購于寧波奧博儀器科技有限公司。</p><p>　　低速大容量離心機(jī)（LXJ-IIB，上海安亭科學(xué)儀器廠），可見分光光度計(jì)（T6新悅，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），電子天平（EL204 Mettler ToLeDo，梅特勒-托利多儀器上海有限公司），

26、電熱恒溫水浴鍋（DKS-26，寧波江南儀器廠），高效液相色譜儀（Agilent 1200，美國Agilent公司產(chǎn)品），MARS微波消解儀（Mars5，美國CEM公司產(chǎn)品），全譜直讀等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-AES） （IRIS Intrepid ⅡXSP，美國Thermo Elemental公司）。</p><p><b>　　方法</b></p><p><

27、;b>　　樣品處理</b></p><p>　　將提取出大量魷魚油的魷魚肝臟用組織搗碎機(jī)粉碎均勻，待用。</p><p><b>　　營養(yǎng)成分分析</b></p><p>　　粗蛋白質(zhì)－凱氏定氮法；粗脂肪含量測定－索氏提取法；水分含量測定-105℃恒溫干燥法；灰分－灼燒法[9]。</p><p><

28、;b>　　無機(jī)元素含量測定</b></p><p>　　消解：精確稱取1g樣品于四氟乙烯消解罐中，加入10mL濃HNO3進(jìn)行消解。消解程序?yàn)椋涸?50℃，600W功率下，消解10min，爬升時(shí)間為15min。</p><p>　　標(biāo)注溶液配置：取8種單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用硝酸（1+3）稀釋成多元素混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液后，再用硝酸（1＋19）配制成三個(gè)濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。為

29、避免元素間的化學(xué)干擾和光譜干擾，將8種無機(jī)元素分為兩組，各種濃度值見表1。</p><p><b>　　表1 混合標(biāo)準(zhǔn)系列</b></p><p>　　Tab.1 Mix reference material</p><p><b>　　水解條件優(yōu)化</b></p><p><b>　　酶

30、的選取</b></p><p>　　稱取一定量的樣品，在料液比為1:5，加酶量均在3%，及各種酶的最適溫度及最適pH的條件下水解360min。水解結(jié)束后85℃滅酶15min，4000r/min離心5min后取上清，取1 mL上清液定容到25 mL的容量瓶中，搖勻后測定其水解度。</p><p><b>　　水解度計(jì)算：</b></p><

31、;p>　　DH（%）=已水解的氨基酸態(tài)氮數(shù)/原料中總氮數(shù)×100%=B/A×100%</p><p>　　式中：A 為原料中總氮量（mg/100g），B 為水解后氨基氮量（mg/100g）。</p><p>　　水解后氨基氮量采用甲醛值法，原料中總氮量采用凱氏定氮法測定[9]。</p><p><b>　　酶的單因素試驗(yàn)</

32、b></p><p>　　選定合適的酶后，選取溫度、時(shí)間、pH、加酶量和料液比做單因素實(shí)驗(yàn)。</p><p><b>　　響應(yīng)面設(shè)計(jì)</b></p><p>　　在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取溫度、時(shí)間和料液比為三個(gè)主要因素的，根據(jù)Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，水解度為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析，依據(jù)回歸分析確定各工藝

33、條件的主要影響因素，以水解度為響應(yīng)值做響應(yīng)面和等值線圖[10-11]。</p><p>　　水解液中氨基酸的測定</p><p>　　樣品用OPA-FMOC法進(jìn)行衍生化，檢測條件：Hypersil AA-ODS 2.1×200mm×5μm氨基酸柱，進(jìn)樣量2μL，流速為0.45 mL/min，柱溫40℃，后運(yùn)行時(shí)間為2min；流動相A為20mmol/L醋酸鈉溶液，pH=7

34、.20±0.05，流動相B為醋酸鈉，乙腈，甲醇混合液，體積比為100mmol/L醋酸鈉溶液：乙腈：甲醇=20：40：40，pH=7.20±0.05；FLD檢測器激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長450nm，VWD檢測器波長為338nm，運(yùn)行在線衍生自動進(jìn)樣程序和梯度洗脫。</p><p><b>　　急性毒理實(shí)驗(yàn)</b></p><p><b>

35、;　　劑量確定</b></p><p>　　為探討水解液的急性毒性，首先進(jìn)行了小鼠最大耐受量預(yù)實(shí)驗(yàn)，取ICR小鼠20只，體重20g±2g，雌雄各半，隨機(jī)分為2組即空白組及LD50組，空白組每天灌胃蒸餾水一次，每次按體重0.1mL/10g；LD50組小鼠每天灌胃一次水解液原液，每次按體重0.1mL/10g。兩組小數(shù)在灌胃前均禁食不禁水12h，灌胃后兩小時(shí)內(nèi)，觀察各組小鼠狀態(tài)變化，并做記錄。實(shí)驗(yàn)

36、進(jìn)行7d。</p><p><b>　　毒理實(shí)驗(yàn)</b></p><p>　　預(yù)實(shí)驗(yàn)如未測出LD50的情況下，進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。取ICR小鼠20只。體重20g±2g，雌雄各半，隨機(jī)分為兩組，即空白組、毒理組。因預(yù)實(shí)驗(yàn)未能測定出LD50，因此加大毒理組每天的灌胃劑量及灌胃次數(shù)?？瞻捉M每天兩次灌胃蒸餾水，每次按體重0.4mL/10g；毒理組小鼠每天灌胃兩次次水解液原液

37、，每次按體重0.4mL/10g。兩組小鼠在灌胃前均禁食不禁水12h，兩次灌胃時(shí)間間隔5h，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行14d[12-14]。</p><p><b>　　指標(biāo)測定</b></p><p>　　各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間同室分籠飼養(yǎng)，保持衛(wèi)生清潔，光照充足，自由采食飲水，室溫控制在25℃，濕度60%，晝夜交替。兩次實(shí)驗(yàn)均在灌胃后2h內(nèi)觀察狀態(tài)，并隨時(shí)記錄，每天稱量體重。如小鼠在實(shí)驗(yàn)期

38、間死亡，需立即對尸體進(jìn)行解剖，確定其死因。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食不禁水12h，將小鼠脫臼處死，摘取主要臟器，觀察臟器變化。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果</b></p><p><b>　　基本營養(yǎng)成分</b></p><p>　　魷魚肝臟的基本營養(yǎng)成分中粗蛋白、粗脂肪、灰分和水分含量分別為20.62%、16.99%、1

39、.37%和47.64%。其中粗脂肪含量最高。詳情見表2。</p><p>　　表2魷魚肝臟基本營養(yǎng)成分</p><p>　　Tab. 2 Nutrient content of squid liver</p><p><b>　　無機(jī)元素含量</b></p><p>　　魷魚肝臟中，無機(jī)元素的含量如表3所示。</p

40、><p>　　表3 魷魚肝臟無機(jī)元素含量</p><p>　　Tab. 3 Content of inorganic elements of squid liver</p><p><b>　　不同酶的水解度</b></p><p>　　由圖1可知，在所選取的6種酶（中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、

41、風(fēng)味蛋白酶）各自最合適的水解條件下[15-16]，復(fù)合蛋白酶的水解度最高，達(dá)到60.75%，因此選取復(fù)合蛋白酶繼續(xù)進(jìn)行稍后的水解單因素實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　圖1 不同種酶的水解度</p><p>　　Fig.1 Degree of hydrolysis of different enzymes</p><p><b>　　酶濃度</b>&

42、lt;/p><p>　　在料液比為1:5，溫度50℃，pH=7.0，時(shí)間為180min的條件下，通過改變酶的不同濃度，測定其對水解度的影響，結(jié)果如圖2所示，隨著加酶量的不斷添加，水解度不斷增加，當(dāng)達(dá)到5%時(shí)達(dá)到最大的水解度54.66%，稍后隨著加酶量的增加，水解度并沒有變大的趨勢，這主要因?yàn)榈孜锏牧坎辉黾?，而僅僅隨著加酶量的增加，導(dǎo)致酶不能與底物結(jié)合，從而導(dǎo)致水解度不增加，不能起到繼續(xù)催化的作用，因此選取加酶量為5%

43、為最適加酶量。</p><p>　　圖2 酶量對水解度的影響</p><p>　　Fig.2 Effect of enzyme concentrations on degree of hydrolysis</p><p><b>　　料液比</b></p><p>　　在溫度50℃，pH=7.0，加酶量為5%，時(shí)間為18

44、0min的條件下，通過改變料液比來觀察此種因素對水解度的影響，結(jié)果如圖3所示，在最初隨著料液比的不斷加大的過程中，水解度也是在不斷加大，但是趨勢不是很明顯，在1:5時(shí)，達(dá)到最大的水解度55.62%。加大料液比是為了是酶可以更好的接觸底物，從而是酶促反應(yīng)更加安全，但是隨著料液比超過最佳值，酶與底物濃度的接觸也超過最優(yōu)化，從而使水解度不能不斷增大，因此選擇1:5的料液比為最佳條件。</p><p>　　圖3 料液比對

45、水解度的影響</p><p>　　Fig.3 Effect of ratio of material to water on degree of hydrolysis</p><p><b>　　時(shí)間</b></p><p>　　由圖4可知，在料液比1:5，酶濃度5%，pH＝7.0，溫度50℃的條件下，分別水解40min、60 min、80 m

46、in、100 min、120 min、140 min，測定水解度。其結(jié)果如圖9所示，在60min時(shí)水解度達(dá)到57.54%，隨著水解時(shí)間的增長，水解度并沒有顯著的增加?？赡苁菚r(shí)間的增加使酶失去活性或水解已達(dá)到最大值，從而導(dǎo)致水解度一直保持在相同的水平上。所以本實(shí)驗(yàn)選擇60min為最佳水解時(shí)間。</p><p>　　圖4 時(shí)間對水解度的影響</p><p>　　Fig.9 Effect of

47、time on degree of hydrolysis</p><p><b>　　溫度</b></p><p>　　在料液比1:5，酶濃度5%，pH＝7.0，水解時(shí)間為60min的條件下，分別在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃下水解，測定不同溫度點(diǎn)的水解度，其結(jié)果如圖5所示，隨著溫度的升高，酶在前期仍可以保持較好的活性，酶促反應(yīng)隨著溫度的升高

48、而加快，當(dāng)溫度達(dá)到65℃時(shí)，得出的最高水解度最高為62.48%，隨后隨著溫度的升高，水解度反而下降，可能是隨著溫度的升高，已經(jīng)使酶失去了活性，酶促反應(yīng)開始減弱的結(jié)果，因此水解度下降。</p><p>　　圖5 溫度對水解度的影響</p><p>　　Fig.5 Effect of temperature on degree of hydrolysis</p><p>

49、;<b>　　pH</b></p><p>　　在料液比1:5，酶濃度5%，溫度65℃，水解時(shí)間60min的條件下，變化不同的pH值，觀察其對水解度的影響，結(jié)果如圖6所示，隨著pH值的不斷加大，水解度也不斷加大，當(dāng)pH達(dá)到7.5時(shí)，達(dá)到最大的的水解度68.95%，當(dāng)pH繼續(xù)增大時(shí)，水解度呈現(xiàn)下降的趨勢。因?yàn)槊缸陨碛衅渥钸m的水解pH值，但當(dāng)?shù)孜镒兓瘯r(shí)，不同的底物會對環(huán)境pH有所影響，從而導(dǎo)致酶

50、對最適酶促反應(yīng)的pH有所變化。因此本實(shí)驗(yàn)選取的最適pH值為7.5。</p><p>　　圖6 pH對水解度的影響</p><p>　　Fig.6 Effect of pH on degree of hydrolysis</p><p><b>　　響應(yīng)面設(shè)計(jì)</b></p><p>　　由單因素實(shí)驗(yàn)我們可以看出，影響魷魚

51、肝臟水解度的因素有很多，其中溫度、時(shí)間和料液比是三個(gè)主要因素。溫度對水解度的影響在10%以上，時(shí)間對水解度的影響在7%左右，料液比對水解度的影響在9%左右，而其它因素對水解度的影響相對這三個(gè)因素較小。因此據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，選取溫度、時(shí)間、液料比三個(gè)因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法[17]，因素水平設(shè)計(jì)表見表4。</p><p>　　表4 響應(yīng)面分析因素與

52、水平</p><p>　　Tab.4 Factors and levels of test</p><p>　　對魷魚肝臟水解條件進(jìn)行響應(yīng)面分析，其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表5。</p><p>　　表5 響應(yīng)面分析及結(jié)果</p><p>　　Tab.5 Design scheme and results of test</p><

53、p>　　各因素經(jīng)回歸擬合后，解得回歸方程為：Y=56.74+0.6A+0.5B+0.33C+0.44AB+0.73AC+0.72BC-0.95A2-0.26B2-1.21C2，式中Y為水解度。</p><p>　　從表6中我們可以得出，Prob > F值為0.0187，小于0.05，表明該模型顯著，說明此實(shí)驗(yàn)方法可靠，使用該方程模擬真實(shí)的以溫度、時(shí)間和料液比三因素三水平實(shí)驗(yàn)分析可行。從模型ABC的P值

54、我們可以得出，對水解度影響最大的是料液比，其次是時(shí)間，最后是溫度。從表6中我們也可以得出，這三個(gè)因素對水解度的影響不是簡單的線性關(guān)系，而是存在交互作用。</p><p>　　表6 水解參數(shù)數(shù)學(xué)回歸分析結(jié)果</p><p>　　Tab.6 Results of regression analysis of test</p><p>　　從圖7我們可知，當(dāng)時(shí)間不變時(shí)，隨

55、著料液比的增加水解度升高，但隨著料液比的不斷增大，水解度稍有下降；當(dāng)料液比不變時(shí)，隨著時(shí)間的增加，水解度變大，但隨著時(shí)間的再次增加，水解度稍有下降，結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)基本相似，當(dāng)時(shí)間為100min左右，料液比為1:5時(shí)達(dá)到最大水解度，且兩因素有交互關(guān)系。原因可能是隨著料液比及時(shí)間的不斷增加，酶與底物接觸先達(dá)到最大值，但隨著料液比的不斷增加，酶與底物濃度不能充分接觸，從而導(dǎo)致酶促反應(yīng)降低，以至水解度的下降。</p><p

56、>　　圖7 時(shí)間和料液比對水解度的影響</p><p>　　Fig.7 Response surface plot of time and ratio of material to watertime on DH</p><p>　　由圖8可知，當(dāng)溫度不變的情況下，隨著料液比的增加，水解度也隨著加大，但隨著料液比的不斷加大，水解度反而有所下降；當(dāng)料液比不變時(shí)，隨著溫度的增高，水解度隨

57、著變大，但隨著溫度的不斷增高，水解度反而下降。這與所做的單因素實(shí)驗(yàn)相似，當(dāng)溫度65℃，料液比為1:5達(dá)到最大水解度，且兩個(gè)因素有交互關(guān)系。原因可能是隨著溫度的不斷增加，料液比的不斷加大，酶易失去本身活性，且與底物濃度接觸不夠充分，從而使酶促反應(yīng)先增強(qiáng)后減弱，出現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。</p><p>　　圖8 溫度和料液比對水解度的影響</p><p>　　Fig.8 Response surfa

58、ce plot of temperature and ratio of material to water time on DH</p><p>　　由圖9我們可知，當(dāng)溫度不變時(shí)，隨著時(shí)間的增加，水解度基本沒有變化；隨著溫度的增加，水解度先增高，超過65℃時(shí)，水解度隨著溫度的升高而降低，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，當(dāng)溫度為65℃，時(shí)間為100min時(shí)達(dá)到最大水解度，且兩因素有交互作用。其原因可能是，酶促反應(yīng)在合適的時(shí)

59、間已經(jīng)達(dá)到峰值，而時(shí)間的延長并沒有使酶促反應(yīng)加強(qiáng)，隨著溫度的身高，一部分酶相繼失活，從而水解度開始下降。</p><p>　　圖9 溫度和時(shí)間對水解度的影響</p><p>　　Fig.9 Response surface plot of temperature and time on DH</p><p><b>　　水解液中氨基酸含量</b>

60、;</p><p>　　水解中氨基酸含量豐富，具體見表7。其包含人體所必需的8種必需氨基酸。</p><p>　　表7 氨基酸含量（mg/L）</p><p>　　Tab.7 Composition of amino acids (mg/L)</p><p>　　注：*必需氨基酸；TEAA：總必須氨基酸量；TAA：總氨基酸量</p>

61、;<p>　　Note：*essential amino acid；TEAA：total essential amino acids； TAA：total amino acids</p><p><b>　　急性毒理實(shí)驗(yàn)</b></p><p>　　通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，并每次給藥后觀察發(fā)現(xiàn)，在預(yù)實(shí)驗(yàn)期間，實(shí)驗(yàn)組的小鼠沒有死亡，亦未出現(xiàn)任何中毒現(xiàn)象，說明在預(yù)實(shí)驗(yàn)的

62、劑量下，水解液計(jì)量是安全計(jì)量，并未測出LD50，因此，在此劑量下加大計(jì)量和灌胃次數(shù)進(jìn)行急性毒理實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　急性毒理實(shí)驗(yàn)過程中，連續(xù)觀察14d，小鼠未出現(xiàn)體征異常，并無一例死亡情況發(fā)生，亦未出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后脫臼處死，主要的臟器，心、肝、腎、肺、脾均無特殊改變及病變。表明由于水解液毒性低，安全性高。</p><p><b>　　討論</b><

63、/p><p>　　魷魚肝臟主要是作為提取魷魚油的物質(zhì)，其相關(guān)研究[18]主要集中在其提取的油脂類的工藝改良及提取出的魚油中相關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)的研究，而對其產(chǎn)生的剩余廢棄物的相關(guān)報(bào)道較少，如果將剩余的魷魚肝臟丟棄則會產(chǎn)生二次廢棄物，不僅污染環(huán)境，也未使魷魚肝臟得到充分的開發(fā)利用，而魷魚肝臟經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)大約占魷魚肝臟總重的50%-60%。其成分中蛋白質(zhì)占20.62%，而粗脂肪依然含有16.99%，說明在剩余部分中還含有一定量的油

64、脂類，可選用其它方法進(jìn)一步提取。魷魚肝臟油的提取工藝需進(jìn)一步改進(jìn)。通過ICP方法測定了其中8種無機(jī)元素的含量，其中Na和K的含量最多。而在常規(guī)魚油提取的過程中水解法常使用的NaOH和KOH，這樣難免會使魷魚肝臟中Na和K的含量進(jìn)一步升高，因此在實(shí)驗(yàn)中使用蒸煮法或其它提取方法，可以避免淡堿水解法加工過程中廢棄夜及魷魚肝臟中鹽類的升高。</p><p>　　通過實(shí)驗(yàn)證明復(fù)合蛋白酶在其最適的水解條件下，水解魷魚肝臟的水

65、解度最高。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了溫度、時(shí)間、料液比、pH和加酶量的最佳水解條件，且其中時(shí)間、溫度和料液是對水解度影響最大的三個(gè)因素，在此基礎(chǔ)上依據(jù)Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行了三因素三水平的實(shí)驗(yàn)，得出了相應(yīng)的擬合方程，證明了模型的可行性及三個(gè)因素之間的相互交互作用，得到復(fù)合蛋白酶水解魷魚肝臟的最佳條件為：在pH=7.5，加酶量為5%，料液比為1:5.17，溫度67.2℃條件下水解104.8min。在優(yōu)化條件下進(jìn)行的

66、驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，回歸方程與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的誤差為1.87%，在誤差允許范圍內(nèi)，說明響應(yīng)面法在酶解率的回歸模型較可靠。</p><p>　　動物的肝臟中血液含量豐富，且形態(tài)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，使其的生理活動十分活躍，其不僅僅在糖類、蛋白質(zhì)、脂肪、微生物代謝起關(guān)鍵作用，更是生物分泌、排泄和生物轉(zhuǎn)化起重要作用，它也是重金屬的解毒，排毒的重要器官[19]。急性毒理實(shí)驗(yàn)證明了魷魚肝臟水解液的食用安全性，其在預(yù)實(shí)驗(yàn)及急性毒理實(shí)驗(yàn)中并沒有導(dǎo)致小

67、鼠有明顯的中毒現(xiàn)象及任何小鼠的猝死。小鼠在灌胃實(shí)驗(yàn)過程中其狀態(tài)、食物利用率和體重等指標(biāo)均未見異常[20]。但水解液遺傳毒性及長期食用是否對小鼠或人體有一定的影響需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的證明[21]。</p><p>　　利用高效液相色譜技術(shù)檢測魷魚肝臟水解液中的氨基酸含量證明，水解液中含有人體所需的8種必需氨基酸，且含量都很高，其中蘇氨酸含量最高為1004.69mg/L，蘇氨酸具有抗疲勞，促進(jìn)生長發(fā)育的功效，而蘇氨酸在食

68、品中主要作為飼料用氨基酸，它在飼料中主要是調(diào)節(jié)氨基酸平衡，促進(jìn)生長，改善肉質(zhì)及降低成本的作用。其次是苯丙氨酸，含量為764.37 mg/L，苯丙氨酸在食品中主要是添加在焙烤食品中，增加香味，補(bǔ)充人體的氨基酸。這兩種氨基酸分別是促進(jìn)飲食和增加香味的，可以為進(jìn)一步將水解液加工成誘食飼料等提供了理論依據(jù)。非必需氨基酸中，天冬氨酸的含量最高，為1038.07 mg/L，天冬氨酸可改善心肌功能，亦可降低血液中氮和二氧化碳的含量，從而起到保護(hù)肝臟，

69、增強(qiáng)肝臟功能，消除疲勞的效果。第二位的是谷氨酸，其含量為1014.85 mg/L，谷氨酸具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，可作為能源參與機(jī)體的代謝，用于醫(yī)藥可治療肝昏迷，保護(hù)肝臟，在治療肝臟疾病中起到輔助作用，起作為大腦皮質(zhì)及神經(jīng)中樞的補(bǔ)劑，對一些腦部損傷，腦震蕩，癲癇及弱智兒童有一定的療效。食品中，谷氨酸及其鈉鹽是味精的主要成分。組氨酸含量第三，為1000.03 m</p><p><b>　　結(jié)論</b&g

70、t;</p><p>　　本章對魷魚肝臟首先進(jìn)行營養(yǎng)成分的測定，結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)含量達(dá)到20%左右，并選取了不同的酶對其進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)，在各自酶合適的條件下，證實(shí)了復(fù)合蛋白酶對其水解效果最好，并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用單因素實(shí)驗(yàn)確定溫度、時(shí)間等因素對水解度的影響，并選取了最佳的水解條件，再利用響應(yīng)面技術(shù)優(yōu)化了水解工藝，證實(shí)了三個(gè)主要因素在水解過程中的交互作用，最終確定了最佳水解條件。并以ICR小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)行急性毒理實(shí)驗(yàn)

71、，證明了水解液的食用安全性，為進(jìn)一步的長期安全性及遺傳毒性實(shí)驗(yàn)做了前期準(zhǔn)備。并利用高效液相色譜技術(shù)分析了水解液中氨基酸的組成及含量。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1]董正之. 世界大洋經(jīng)濟(jì)頭足類生物學(xué)[M]. 濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社, 1991:82-195.</p><p>　　[2]宋慶武, 丁

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