假單胞菌的檢測(cè)方法研究進(jìn)展[文獻(xiàn)綜述]

1、<p>　　本科畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</p><p><b>　　環(huán)境科學(xué)</b></p><p>　　假單胞菌的檢測(cè)方法研究進(jìn)展</p><p>　　摘要：假單胞菌是醫(yī)院感染的主要病原菌，也是重要的食源性和水源性致病菌，對(duì)人類的健康產(chǎn)生了威脅。建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法迫在眉睫，對(duì)動(dòng)物和人類有著重大作用。本文對(duì)近年來(lái)假單胞菌的檢測(cè)方法

2、的進(jìn)展進(jìn)行了概述：從傳統(tǒng)的生化檢測(cè)方法到免疫學(xué)檢測(cè)方法，最后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槭褂梅肿由飳W(xué)檢測(cè)方法，其特異性越來(lái)越強(qiáng)、靈敏度越來(lái)越高、操作越來(lái)越簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間也越來(lái)越短。</p><p>　　關(guān)鍵詞：假單胞菌；檢測(cè)方法；進(jìn)展</p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　假單胞菌廣泛存在于土壤、淡水、海水以及生物體中，為革蘭氏陰性

3、桿菌，無(wú)芽孢、無(wú)莢膜，單鞭毛或多鞭毛，專性需氧，能產(chǎn)生水溶生長(zhǎng)性色素或者熒光，可從蔬菜、水果、植物、土壤自來(lái)水、蓄水池等水體中分離得到。陽(yáng)光富等[1]根據(jù)16S rRNA序列將假單胞菌被分為兩大類：第一類六個(gè)組包括丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)、綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluor

4、escens)、銅綠假單胞菌菌(Pseudomonas aeruginosa)和施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri )；第二類只有一個(gè)組，代表種為穿孔假單胞菌(Pseudomonas pertucinogena)。假單胞菌多為條件致病菌，是醫(yī)院感染的主要病原菌，銅綠假單胞菌為其代表菌種，它對(duì)清潔水源的污染也已經(jīng)引起了很多專家的特別關(guān)注。由于長(zhǎng)期以來(lái)的抗生素和殺菌劑等的大量使用，假單胞菌對(duì)消毒劑、干燥、紫外線等理化因素

5、具有很強(qiáng)的抵抗力，可引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥</p><p>　　2 假單胞菌的檢測(cè)方法</p><p>　　為了尋求快速、簡(jiǎn)便、有效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)外學(xué)著進(jìn)行了大量的研究，從以傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法為基礎(chǔ)發(fā)展到以免疫學(xué)、分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了假單胞菌的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，并在實(shí)踐中不斷取得新的進(jìn)展。</p><p>　　2.1 傳統(tǒng)的檢

6、測(cè)方法</p><p>　　國(guó)標(biāo)中對(duì)銅綠假單胞菌的檢測(cè)采用的是傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，該方法主要依靠假單胞菌的生物學(xué)特征，通過(guò)樣品前處理、增菌、分離培養(yǎng)，再對(duì)其生理生化特征進(jìn)行分析鑒定，根據(jù)不同的樣品采取不同的處理方式。傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法操作比較繁瑣復(fù)雜、耗時(shí)又費(fèi)力，至少需要3天才能得到明確的結(jié)果，而且檢測(cè)的靈敏度低，易受到各種因素的影響，假陰性率較高[2]。</p><p><b>　　2.2

7、 免疫學(xué)方法</b></p><p>　　免疫學(xué)技術(shù)是利用特異性抗原抗體反應(yīng)，觀察和研究組織細(xì)胞、特定抗原（抗體）的技術(shù)。為了顯示和觀察這種抗原抗體反應(yīng)，需要預(yù)先將某種標(biāo)記物結(jié)合到抗體上，借助標(biāo)記物的熒光或酶的有色反應(yīng)、放射性或高電子密度，在光鏡或電鏡下進(jìn)行定性、定位或定量的研究。</p><p>　　2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）</p><p

8、>　　酶聯(lián)免疫吸附法采用抗原與抗體的反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。該方法有三種必要的試劑：固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）、酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）、酶作用的底物（顯色劑）。由于該方法具有高度特異性和靈敏性，結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，廉價(jià)、方法操作簡(jiǎn)單，樣品處理量大等優(yōu)點(diǎn)，是目前最常用的免疫檢測(cè)方法之一。劉秀梅[3]等以椰毒假單胞菌種特異因子0-I McAb 對(duì)椰毒假單胞菌的抗體抗原進(jìn)行了分析，準(zhǔn)確

9、的驗(yàn)證了0-I McAb 的種特異性，其陽(yáng)性檢出率為100%。王燕等[4]利用原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建并表達(dá)OprF蛋白后，采用雜交瘤技術(shù)制備抗OprF的特異性單克隆抗體(mAb)，并成功建立了一種檢測(cè)銅綠假單胞菌抗原的雙mAb 夾心ELISA 方法來(lái)檢測(cè)銅綠假單胞菌，不與其他細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)，可同時(shí)檢測(cè)大量樣本，有利于臨床使用。</p><p>　　2.2.2 KinExA檢測(cè)</p><p>

10、　　KinExA(Kinetic Exclusion Assay: 平衡棄除免疫測(cè)量法)是一種計(jì)算機(jī)控制的流式熒光計(jì)，用來(lái)進(jìn)行自由抗體、自由抗原和抗體-抗原復(fù)合物的快速分離和定量檢測(cè)。KinExA由毛細(xì)管流/觀察單元組成并配有多微孔篩，各種被測(cè)液能在負(fù)壓下通過(guò)篩孔。統(tǒng)一大小的小珠堆積在篩子上形成了一個(gè)填充床，其表面包被固化抗原[5]。</p><p>　　蘇鳳宜[6]用KinExA檢測(cè)銅綠假單胞菌，檢測(cè)的靈敏度和

11、定量范圍接近或優(yōu)于其他免疫檢測(cè)方法。作者將KinExA與ELISA 進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示 KinExA 的結(jié)果比ELISA的結(jié)果靈敏10~100倍，這充分體現(xiàn)了KinExA檢測(cè)細(xì)菌比常規(guī)手段具有明顯更高的靈敏度。而且KinExA的檢測(cè)數(shù)據(jù)重復(fù)性強(qiáng)、偏差小，具有很高的精確度。因此有望成為一種可靠的、具有潛在應(yīng)用前景的細(xì)菌免疫檢測(cè)方法。但是KinExA方法才剛起步，仍然存在很多限制因素，有待在不斷的研究中得到改進(jìn)和完善。</p>

12、<p>　　2.2.3 壓電免疫傳感器芯片技術(shù)</p><p>　　壓電免疫傳感器芯片技術(shù)，是將免疫反應(yīng)與石英質(zhì)量微天平（QCM）相結(jié)合的一種新型免疫傳感器應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)[7]。陳斌[7]將石英晶體綠膿桿菌微陣列免疫傳感器用于綠膿桿菌的分型檢測(cè)，觀察結(jié)果顯示，除該型特異性分型血清芯片和綠膿桿菌單克隆抗體包被的芯片發(fā)生明顯的頻率響應(yīng)外，其它各型芯片的頻率響應(yīng)均與傳感器的參比芯片噪聲信號(hào)無(wú)顯著性

13、差異。其靈敏度為91.9%，特異性為100%，假陽(yáng)性率為0%，假陰性率為8.1%，表明可用于綠膿桿菌的臨床檢測(cè)。但是由于各種因素的限制，還需進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。</p><p>　　2.3 分子生物學(xué)檢測(cè)</p><p>　　分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)與分子遺傳學(xué)取得巨大進(jìn)步的結(jié)晶，它是在人們對(duì)基因的結(jié)構(gòu)以及基因的表達(dá)和調(diào)控等生命本質(zhì)問(wèn)題的認(rèn)識(shí)日益加深的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。分子生物學(xué)的發(fā)

14、展使微生物的檢測(cè)從生化、免疫方法轉(zhuǎn)向基因水平的檢測(cè)，這些檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡(jiǎn)便、快速高效等特點(diǎn)。用于假單胞菌的檢測(cè)主要有PCR檢測(cè)、熒光實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)、LAMP檢測(cè)和全自動(dòng)菌種檢定系統(tǒng)檢測(cè)等。</p><p>　　2.3.1 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)</p><p>　　PCR 技術(shù)是一項(xiàng)體外酶促擴(kuò)增DNA技術(shù), 具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡(jiǎn)便、快速高效等特點(diǎn)，為最常

15、用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。2005年，代艷杰等[8]用類鼻疽假單胞菌鞭毛蛋白的基因作引物，用PCR擴(kuò)增的方法檢測(cè)6種土壤中不同濃度的類鼻疽假單胞菌和3個(gè)假單胞菌屬的3種對(duì)照菌，結(jié)果顯示該法具有高靈敏度，對(duì)照菌為陰性。2004年，Scarpellini 等[9]針對(duì)16 S rRNA 基因設(shè)計(jì)了引物16SPSEfluF/R，目前常被應(yīng)用于檢測(cè)和鑒定熒光假單胞菌。2010年，鄧顯文等[10]依據(jù)16～23S rRNA基因間隔區(qū)序列建立PCR檢

16、測(cè)體系，診斷羅非魚(yú)的熒光假單胞菌病，但僅對(duì)4株熒光假單胞菌分離株進(jìn)行了驗(yàn)證。楊一林[9]等分別針對(duì)16～23S rRNA基因間隔區(qū)序列、gyrB基因以及通過(guò)生物信息學(xué)方法發(fā)掘到的4個(gè)種特異性基因，設(shè)計(jì)了6對(duì)檢測(cè)引物，通過(guò)初步特異性實(shí)驗(yàn)，篩選出一對(duì)種特異性最佳的引物，最終建立了以gyrB基因?yàn)闄z測(cè)靶點(diǎn)的PCR擴(kuò)增體系。該方法可特異檢測(cè)熒光假單胞菌的存在，純DNA的檢測(cè)靈敏度為14.9fg/μL (2～3 拷貝/μL)，純培養(yǎng)物的檢測(cè)靈敏度

17、為2.8×102cf</p><p>　　2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法</p><p>　　熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是一種快速、敏感、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)技術(shù)，而且自動(dòng)化程度高，大大降低了污染的可能性，能夠同時(shí)完成多種樣品的擴(kuò)增及定量，已成功應(yīng)用于各類致病菌的檢測(cè)。2006年，薛利軍等[13]將16S rDNA作為熒光定量PCR的靶基因檢測(cè)銅綠假單胞菌，結(jié)果顯示設(shè)計(jì)引物的靶向

18、序列，僅對(duì)假單胞菌的16S rDNA有高度同源性，該方法靈敏度達(dá)3.6pg/μL，并且具有很強(qiáng)的特異性。2007年，楊曼瓊 [14]以銅綠假單胞菌的oprI基因?yàn)槟康幕蜻M(jìn)行PCR擴(kuò)增，與傳統(tǒng)培養(yǎng)相比其特異性吻合率達(dá)100%，靈敏度可達(dá)到10-1/μl。因此該方法可以準(zhǔn)確快速的檢測(cè)銅綠假單胞菌，可望用于臨床銅綠假單胞菌感染的快速診斷。2008年，肖性龍等[15]將ETA基因作為熒光定量PCR靶基因設(shè)計(jì)TaqMan探針，建立熒光實(shí)時(shí)定量P

19、CR法快速檢測(cè)銅綠假單胞菌，相比傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有更高的靈敏度和更好的特異性。吳炳坤[16]等根據(jù)銅綠假單胞菌gyrB基因序列設(shè)計(jì)引物，采用一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)銅綠假單胞菌以及甄別死活狀態(tài)，僅有銅綠假單胞菌為陽(yáng)性擴(kuò)增，其余均為陰性，說(shuō)明具有較高的特異性，且其最</p><p>　　2.3.3 Riboprinter系統(tǒng)的檢測(cè)</p><p>　　Riboprinter 是一

20、種以DNA指紋為基礎(chǔ)的全自動(dòng)菌種鑒定系統(tǒng)，它通過(guò)16S-23S-5S rDNA探針與待測(cè)菌株酶切后染色體DNA的雜交圖譜，與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，然后進(jìn)行菌種鑒定，排除人工操作差異的干擾。姜艷彬等[2]通過(guò)Riboprinter 全自動(dòng)菌種鑒定系統(tǒng)分別對(duì)兩株樣品進(jìn)行了鑒定，并采用16S rDNA序列測(cè)定結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了對(duì)照，兩種檢測(cè)方法得了出相同結(jié)論，Riboprinter還可能進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)菌。但是這種方法只適用于細(xì)菌的分類鑒定，且數(shù)據(jù)

21、庫(kù)還有待完善。</p><p>　　2.3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增LAMP反應(yīng)檢測(cè)</p><p>　　環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)( loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一種利用能特異性結(jié)合于靶DNA上的6個(gè)特定區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下高效擴(kuò)增核酸，1 h 即可完成；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳呈階梯狀。該技術(shù)具

22、有高特異性、快速、靈敏、高效，操作簡(jiǎn)便，不需要特殊儀器，僅簡(jiǎn)單的恒溫水浴鍋就能完成等特點(diǎn)?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于病毒及微生物的快速檢測(cè)[17]。目前環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果判定的主要方法有直接電泳、直接觀察擴(kuò)增管的濁度和加入染料用肉眼判定結(jié)果這三種方法。2010年，張淑紅 [18]等以銅綠假單胞菌ecfX為特異性靶基因進(jìn)行LAMP檢測(cè)，結(jié)果只有銅綠假單胞菌為陽(yáng)性，其他均為陰性，其最低檢測(cè)限為1.57×101cfu/mL—1.57×

23、102cfu/mL。張淑紅[12]等對(duì)傳統(tǒng)檢測(cè)方法、PCR方法和LAMP方法進(jìn)行了比較，顯示了LAMP方法操作更簡(jiǎn)單，不需昂貴儀器，僅水浴鍋就可以完成；結(jié)果可用肉眼直接觀察；而且其靈敏度和特異性也優(yōu)于常規(guī)PCR法。</p><p><b>　　2.4 其他方法</b></p><p>　　2.4.1 API系列試劑條</p><p>　　近年來(lái)

24、，陳冠武等[19]用法國(guó)生物梅里埃推出的API系列試劑條檢測(cè)銅綠假單胞菌。通過(guò)與傳統(tǒng)檢測(cè)方法比較發(fā)現(xiàn)，API系列試劑條可得出具體的種屬名稱及鑒定分析，而傳統(tǒng)的檢測(cè)方法只能得出是或否的結(jié)論，API系列試劑條已在各檢測(cè)機(jī)構(gòu)得到廣泛應(yīng)用。陳求歡等[20]采用API20NE生化鑒定試劑條對(duì)飲用天然礦泉水中的銅綠假單胞菌進(jìn)行鑒定，并與國(guó)標(biāo)GB/T8538-2008方法比較，結(jié)果證明API20NE生化鑒定試劑條更加快速、方便、準(zhǔn)確可靠。但是API試

25、劑條的使用基于平板培養(yǎng)，所以具有較大的人為和系統(tǒng)誤差，因而這種方法也有待改進(jìn)。</p><p>　　2.4.2 應(yīng)用氣味指紋技術(shù)檢測(cè)豬肉假單胞菌</p><p>　　胡惠平等[21]利用頂空- 固相微萃取- 氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HSSPME-GC-MS)結(jié)合電子鼻技術(shù)分析從豬肉中分離的假單胞菌純培養(yǎng)后的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物氣味指紋，快速的將假單胞菌進(jìn)行區(qū)分和鑒別，表明該技術(shù)可以應(yīng)用于假單胞

26、菌等食品中微生物的快速無(wú)損檢測(cè)。</p><p><b>　　3 小結(jié)和展望</b></p><p>　　傳統(tǒng)方法歷史悠久，由于形態(tài)學(xué)和理化特性的檢測(cè)可以提供菌種特性的直觀數(shù)據(jù)，將會(huì)繼續(xù)與分子生物學(xué)技術(shù)共同應(yīng)用于微生物檢測(cè)領(lǐng)域。但是，相比較而言，分子生物學(xué)技術(shù)不但不需要預(yù)培養(yǎng)，而且具有更高的準(zhǔn)確度、靈敏度和特異性，因而被越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于微生物學(xué)的檢測(cè)。其中，PCR是

27、現(xiàn)代生物技術(shù)的核心技術(shù)，也是最為廣泛應(yīng)用的方法之一，但該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求相對(duì)較高，而且具有一定的假陽(yáng)性率，不適用于基層實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)工作。同樣作為一種基于核酸擴(kuò)增的檢測(cè)技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)因?yàn)槠涓哽`敏度、高特異性、快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)獲得飛速發(fā)展，在包括病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物性寄生蟲(chóng)等各種各樣病原檢測(cè)中發(fā)揮了良好的效果。隨著LAMP技術(shù)的改良和發(fā)展，目前不開(kāi)蓋的LAMP檢測(cè)技術(shù)獲得了很多重視和應(yīng)用，克服了早期LAMP

28、易引起交叉污染的最大不足，可以預(yù)期，LAMP有可能與PCR一樣，將會(huì)在各個(gè)微生物學(xué)領(lǐng)域獲得長(zhǎng)足應(yīng)用和發(fā)展。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 楊光富,魏云林.假單胞菌研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J].生物技術(shù)通報(bào),2011,(1):37-39.</p><p>　　[2] 姜艷彬,王海,侯東軍等.兩種快速細(xì)菌菌種

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