靈芝發(fā)酵小麥的營養(yǎng)特性與抗氧化能力

1、<p>　　靈芝發(fā)酵小麥的營養(yǎng)特性與抗氧化能力</p><p>　　寇娟妮1 李松文1 辛寒曉2 劉麗英1 孫中濤1</p><p>　?。ㄉ綎|農(nóng)業(yè)大學生命科學學院1， 泰安 271018）</p><p>　?。ㄉ綎|佐田氏生物科技有限公司2，濟南 250000）</p><p>　　摘 要 采用靈芝對小麥進行固態(tài)發(fā)酵，并對發(fā)酵

2、前后小麥的營養(yǎng)成分和抗氧化能力進行了測定與比較。結果表明，小麥發(fā)酵后，蛋白質、粗脂肪、總可溶性物質、可溶性蛋白和可溶性糖的質量分數(shù)分別比發(fā)酵前提高8.1%、14.9%、837%、197%和537%，氨基酸組成與礦物質含量也發(fā)生了改變。小麥發(fā)酵后抗氧化能力顯著提高。靈芝發(fā)酵小麥水提物的DPPH·清除能力、羥基自由基清除率、鐵氰化鉀還原力和超氧陰離子自由基清除率均顯著高于小麥水提物（p﹤0.05）。灌胃靈芝發(fā)酵小麥水提物，可以提高

3、D-半乳糖致衰小鼠血清和肝臟中的SOD、GSH-Px等抗氧化酶活力，降低MDA含量，說明靈芝發(fā)酵小麥可提高小鼠對氧自由基的抵抗能力，降低氧自由基過氧化損傷，延緩D-半乳糖的致衰作用。</p><p>　　關鍵詞 小麥 靈芝 營養(yǎng)特性 抗氧化特性 氧自由基</p><p>　　中圖分類號：Q815 文獻標識碼：A 文章編號：1003-0174（ ） - - &

4、lt;/p><p>　　小麥是我國的主要糧食作物，研究提高其營養(yǎng)價值和保健功能的方法具有重要意義。微生物發(fā)酵是提高糧食和蔬菜營養(yǎng)和保健作用的有效方式，例如，通過發(fā)酵生產(chǎn)的納豆、泡菜等，均有很高營養(yǎng)價值和保健功效[1, 2]。發(fā)酵也可提高小麥的營養(yǎng)價值和保健功效，例如，張謹?shù)壤妹浊购秃谇箤π←溸M行發(fā)酵，提高了其還原糖、氨基酸、總酚、總黃酮的含量和抗氧化能力[3]；辛儒岱采用甜酒曲對小麥進行發(fā)酵，提高了其還原糖、游

5、離氨基酸和蛋白質的含量[4]。</p><p>　　靈芝(Ganoderma lucidum)是享有盛譽的藥食兩用真菌，富含靈芝多糖和靈芝三萜等功效成分，具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤等生理活性[5]。子實體是其傳統(tǒng)食用部位，但生產(chǎn)周期長，木質化程度高，味苦重，口感差，這限制了其在功能性食品領域的應用?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，靈芝菌絲體的營養(yǎng)成分和保健功效與子實體基本一致，但成本低，尚未木質化，苦味輕，已廣泛的應用于生

6、產(chǎn)功能性食品[6]。目前，靈芝菌絲體普遍采用液體發(fā)酵法生產(chǎn)，而固態(tài)發(fā)酵法因無法將靈芝菌絲體與培養(yǎng)基質分離，一般不用于靈芝菌絲體的生產(chǎn)。</p><p>　　本文以小麥為原料，采用靈芝進行固態(tài)發(fā)酵，使靈芝菌絲體在小麥籽粒中生長，以獲得含有大量靈芝菌絲體，具有靈芝的營養(yǎng)成分與保健功能的靈芝發(fā)酵小麥。同時，通過分析靈芝發(fā)酵小麥的營養(yǎng)成分，評測其體內外抗氧化活性，探討將其用作功能性食品生產(chǎn)原料的可行性。</p>

7、;<p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 材料與試劑</b></p><p>　　小麥： 山東省泰安市；泰山赤靈芝菌種（Ganoderma lucidum SN102 ）：山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院；DPPH·（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基）、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、鄰菲

8、羅啉、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、谷胱甘肽等: Sigma 公司；SOD、GSH-Px活力和MDA測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；過氧化氫、硫酸亞鐵、乙醚、三氯乙酸等均為國產(chǎn)分析純試劑。</p><p>　　1.2 靈芝發(fā)酵小麥的制備</p><p>　　選擇顆粒飽滿的小麥，用水沖洗2～3次，浸泡10～12h，使充分吸水。瀝干，裝入食用菌栽培瓶中，裝料系數(shù)80%。121℃滅菌60 min，冷卻

9、至室溫，接入靈芝液體菌種，接種量為5%（v/w），28℃培養(yǎng)15 d，麥粒表面長滿白色菌絲。取出培養(yǎng)物，于40℃干燥，然后粉碎至100目備用。靈芝液體菌種的制備采用馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基。</p><p>　　1.3 常規(guī)營養(yǎng)成分的測定</p><p>　　粗蛋白測定：GB5009.5－2016食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定；可溶性蛋白測定：福林-酚比色法[7]；粗脂肪測定：GB500

10、9.6－2016食品安全國家標準 食品中粗脂肪的測定；可溶性糖測定：3,5－二硝基水楊酸法[8]；水分測定: GB5009.3－2016 食品安全國家標準 食品中水分的測定；氨基酸測定：GB 5009.124－2016食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定；磷的測定：GB 5009.87－2016食品安全國家標準 食品中磷的測定；鉀的測定：GB/T 5009.91－2003食品安全國家標準 食品中鉀的測定；鈣、鎂等礦質元素的測定：GB/T

11、 14609－2008食品安全國家標準 食品中鈣、鎂等礦質元素測定。</p><p>　　1.4 體外抗氧化能力的測定</p><p>　　1.4.1 靈芝發(fā)酵小麥水提液的制備方法</p><p>　　稱取靈芝發(fā)酵小麥粉5 g，加入100 mL蒸餾水，煮沸30 min，然后6 000 r/min離心15 min，將上清液轉移至容量瓶，定容至100 mL，冷藏備用，即

12、為50 mg/mL的水提液。未發(fā)酵小麥的水提液以同樣方法制備。</p><p>　　1.4.2 DPPH·自由基清除能力</p><p>　　參考許效群[9]的方法并做改進。分別取2 mL稀釋至不同濃度的稀釋液（1.0～5.0 mg/mL），加入2 mL 0.1 mmol/L的DPPH·乙醇溶液，混勻，室溫靜置20 min，2 000 r/min 離心 15 min，于

13、波長517 nm處測定吸光值。對照組以等體積95%乙醇替代DPPH·溶液，空白組以等體積水代替樣品。DPPH·自由基清除率計算公式為：</p><p>　　注：A1為樣品組吸光值，A2為對照組吸光值，A3為空白組吸光值</p><p>　　1.4.3 羥基自由基清除能力</p><p>　　參考譚冰[10]的方法并做修改。取15 mL 具塞EP管

14、，依次加入1.5 mmol/L鄰菲羅啉1.0 mL、pH 7.4磷酸緩沖溶液2 mL、1.5 mmol/L硫酸亞鐵1.0 mL、0.03% H2O2 1.0 mL和1.0 mL稀釋至不同濃度的樣品溶液，于 37℃恒溫反應 60 min，然后在510 nm處測量吸光值。對照組以等體積水替代H2O2 ，空白組以等體積水代替樣品。羥基自由基清除率計算公式為：</p><p>　　注：A0 為對照組吸光值；A1 為空白組

15、吸光值；A2 為樣品組吸光值</p><p>　　1.4.4 對鐵氰化鉀的還原力</p><p>　　參考吳海濤[11]的方法并稍作修改。取1 mL稀釋至不同濃度的樣品，依次加入 0.1 mol/L pH 7.4的磷酸緩沖液和質量分數(shù)為1% 的鐵氰化鉀溶液各2.0 mL，充分混勻，50℃保溫20 min，再加入質量分數(shù)為10%的三氯乙酸2.0 mL，振蕩混合，4 500 r/min離心15

16、 min。取上清液2.0 mL，依次加入2 mL蒸餾水和1.0 mL質量分數(shù)為0.1% 的FeCl3 溶液，混勻，靜置10 min后體系溶液由黃色變?yōu)樗{色，于700 nm處測定吸光度,空白對照以蒸餾水代替樣品。</p><p>　　1.4.5 在鄰苯三酚體系中抗氧化性測定</p><p>　　參考文獻[12]方法略有修改。取1 mL 稀釋至不同濃度的樣品，加入5.0 mL Tris-HC

17、l 緩沖液（50 mmol/ L，pH 8.2），25℃保溫 20 min，再加入0.5 mL預溫至25℃的2.5 mmol/ L鄰苯三酚，混勻，迅速轉入干燥的比色皿中，于 320 nm 波長處每隔0.5 min測定一次吸光度。以10 mmol/L HCl 0.5mL代替鄰苯三酚為空白調零，對照組以蒸餾水代替樣品。以時間為自變量，以吸光度為因變量，進行回歸分析，所得回歸方程的斜率即為鄰苯三酚的自氧化速率 V。O 2-·清除率計

18、算公式為：</p><p>　　注：V樣品為樣品組鄰苯三酚自氧化速率(ΔOD/min)；V對照為對照組鄰苯三酚自氧化速率(ΔOD/min)。 </p><p>　　1.5 體內抗氧化能力測定</p><p>　　稱取靈芝發(fā)酵小麥粉1 000 g，加入10 L蒸餾水，煮沸30 min，溫度降至70℃左右時，真空抽濾，獲得澄清濾液，采用真空旋轉蒸發(fā)器濃縮至體積為1 00

19、0 mL，即為靈芝發(fā)酵小麥水提物，作為受試物密封低溫保存?zhèn)溆谩Ｐ←溗嵛镆酝瑯拥姆椒ㄖ苽?。實驗動物采用SPF級KM種系雄性小鼠，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，體重20±2 g。小鼠共90只，飼養(yǎng)于溫度18～22℃、濕度50%～60%的動物房，適應性喂養(yǎng)一周后隨機分為9組，每組10只小鼠。小鼠的分組與給藥情況如表1所示，每天灌胃1次。正常對照組每天頸背部皮下注射生理鹽水，其他注射50 mg/mL的D-半乳糖，持續(xù)45 d。小

20、鼠按常規(guī)方式飼養(yǎng)，自由飲水取食，每日定時灌胃給藥一次，持續(xù)45 d。最后一次灌胃后，禁食，不禁水，16 h后，處死小鼠，摘眼球取血，室溫靜置2 h，5 000 r/min離心10 min，取上清液，測定 MDA、SOD和GSH-Px 。取小鼠肝臟0.2 g，加1.8 mL生理鹽水，于玻璃均漿器中均漿，制成10% 的肝組織均漿液，5 000 r/min離心10 min，取上清液，測定 MDA、SOD和GSH-Px</p>&

21、lt;p>　　表1 各組小鼠的給藥管理</p><p>　　1.6 數(shù)據(jù)處理與分析 </p><p>　　實驗重復3次，采用SPSS 17.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Duncan檢驗判定數(shù)據(jù)間差異的顯著性。</p><p><b>　　2 結果與分析</b></p><p>　　2.1 常規(guī)營養(yǎng)成分分析&

22、lt;/p><p>　　發(fā)酵前后小麥營養(yǎng)成分的變化如表2與表3所示。小麥發(fā)酵后，粗蛋白、磷、鈣的質量分數(shù)提高顯著（P＜0.05），粗脂肪、總可溶性物質、可溶性蛋白和可溶性糖的質量分數(shù)提高極顯著（P＜0.01），但鉀、鎂和鐵的質量分數(shù)略有下降（P＞0.05）?？偘被豳|量分數(shù)提高，氨基酸組成也發(fā)生了變化。必需氨基酸中，Thr質量分數(shù)顯著增加（P＜0.01），但Met質量分數(shù)顯著下降（P＜0.01）；非必需氨基酸中，Gl

23、y、Ala和His的質量分數(shù)增加最為顯著（P＜0.01）。小麥發(fā)酵后營養(yǎng)成分發(fā)生變化的原因是多方面的，其一是靈芝菌絲在小麥組織中生長，將小麥的營養(yǎng)成分轉化為靈芝菌絲的營養(yǎng)成分，導致營養(yǎng)成分發(fā)生變化；其二是小麥在發(fā)酵過程中，一部分纖維素和半纖維素等被靈芝菌絲做為能源利用，分解為CO2和H2O，小麥的千粒重由47.9 g下降至43.3 g，減輕了9.6%（P＜0.01），產(chǎn)生“濃縮效應”，這也是導致發(fā)酵后小麥的蛋白質和粗脂肪質量分數(shù)升高的原

24、因之一。靈芝菌絲生長的過程中，會產(chǎn)生大量的水解酶，包括纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶等，可將小麥中的纖維素、半纖維素、淀粉和蛋白質等大分子物質分解為小分子物質</p><p>　　表2 靈芝發(fā)酵小麥的營養(yǎng)成分</p><p>　　表3 靈芝發(fā)酵小麥的氨基酸組成</p><p>　　2.2 體外抗氧化能力</p><p>　　小麥發(fā)酵前

25、后體外抗氧化能力的變化如圖1所示?？寡趸瘎┛赦鏒PPH·的未配對電子，使其乙醇溶液退色，據(jù)此可評定抗氧化劑的抗氧化能力[14]。EC50是DPPH·自由基清除率為50%時所需抗氧化劑的濃度，其值越小，說明抗氧化劑的抗氧化能力越強。在相同濃度下，靈芝發(fā)酵小麥對DPPH·自由基的清除能力高于小麥。小麥的EC50為4.8 mg/mL,而靈芝發(fā)酵小麥的EC50降至2.2 mg/mL,這說明發(fā)酵后小麥對DPPH的清

26、除能力提高2.18倍。靈芝發(fā)酵小麥對DDPH·自由基的清除率與其濃度呈正相關，在實驗濃度范圍內，濃度越高，抗氧化能力越強。對羥基自由基（OH·）的清除能力是表征食品抗氧化能力的重要指標[15]。靈芝發(fā)酵小麥對羥基自由基的清除率與其濃度呈正相關，且濃度相同時，靈芝發(fā)酵小麥的羥基自由基清除率顯著高于小麥（p＜0.01）。抗氧化劑將鐵氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀的能力是表征其還原力大小的重要指標[16]。小麥采用靈芝菌絲體發(fā)酵后

27、，其還原力顯著提高（p＜0.01）。鄰苯三酚自氧化-分光光度法被廣泛應用于各種活性物質清除超氧陰離子自由基的抗氧化功能評價。靈芝發(fā)酵小麥與小麥均對超氧陰離子自由</p><p>　　圖1 靈芝發(fā)酵小麥的體外抗氧化能力</p><p>　　2.3 對小鼠血清中的MDA、GSH-Px及SOD的影響</p><p>　　血清與肝臟中MDA含量和SOD、GSH-Px活力是評

28、價功能性食品體內抗氧化能力的常用指標。MDA是細胞膜中不飽和脂肪酸與氧自由基發(fā)生過氧化反應的產(chǎn)物，MDA含量越高，說明氧自由基對細胞膜的過氧化損傷越嚴重[17]。SOD和GSH-Px是體內重要的抗氧化酶，具有清除氧自由基的作用,其活力可反映生物體對氧自由基的抵抗能力和受氧化損傷情況[18,19]。灌胃靈芝發(fā)酵小麥對小鼠血清與肝臟中的MDA、GSH-Px、GSH及SOD的影響如表4與表5所示。模型組小鼠血清和肝臟的MDA含量高于對照組，S

29、OD與GSH-Px活力低于對照組，均達到了差異顯著水平（p＜0.05），這說明D-半乳糖誘導致小鼠衰老模型建模成功。灌胃小麥水提物的各劑量組小鼠血清與肝臟中的MDA含量、SOD與GSH-Px活力與模型組相比均無顯著差異（p＞0.05），這說明小麥水提物的體內抗氧化能力與小鼠所攝取食物的抗氧化能力相近。但灌胃靈芝發(fā)酵小麥水提物的中、高劑量組與模型組相比均差異顯著（p＜0.05），其中高劑量組小鼠血清與肝臟中的MDA含量分別下降27.5%和

30、35.9%，GSH-Px活力分別提高38.7%和29.3%，SOD活</p><p>　　表4 靈芝發(fā)酵小麥對小鼠血清中SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響</p><p>　　* 表中同列數(shù)據(jù)標記不同字母者，在5%水平上存在顯著性差異。</p><p>　　表5 靈芝發(fā)酵小麥對小鼠肝臟中SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響</p><

31、;p>　　* 表中同列數(shù)據(jù)標記不同字母者，在5%水平上存在顯著性差異。</p><p><b>　　3討論與結論</b></p><p>　　小麥經(jīng)靈芝發(fā)酵后，營養(yǎng)成分發(fā)生了顯著的變化。靈芝菌絲體的生物轉化作用和小麥千粒重降低引起的濃縮效應，使粗蛋白、粗脂肪、磷、鈣的質量分數(shù)顯著提高（P＜0.05）。靈芝菌絲體的分解作用，使總可溶性物質、可溶性蛋白和可溶性糖的質

32、量分數(shù)顯著提高（P＜0.01）。小麥發(fā)酵后氨基酸含量和組成也發(fā)生了明顯的變化，必需氨基酸中，Thr質量分數(shù)增加25.89%（P＜0.01），但Met的質量分數(shù)下降11.32%（P＜0.01），非必需氨基酸中，Gly、Ale和His的質量分數(shù)增加最為顯著，分別提高了17.38%、11.13%和10.15 （P＜0.01）。</p><p>　　小麥經(jīng)靈芝發(fā)酵后，體外與體內抗氧化能力均顯著提高。體外抗氧化試驗結果表明

33、，靈芝發(fā)酵小麥水提物的DPPH·清除能力、羥基自由基清除率、鐵氰化鉀還原力和超氧陰離子自由基清除率均顯著高于小麥水提物（p＜0.05）。體內抗氧化實驗表明， 灌胃靈芝發(fā)酵小麥水提物可提高小鼠血清和肝臟中SOD和GSH-Px等抗氧化酶的活力，這表明小鼠對氧自由基的抵抗能力提高；小鼠血清和肝臟中MDA含量降低，這說明氧自由基對小鼠細胞膜的過氧化損傷程度降低。靈芝發(fā)酵小麥具有較強的抗氧化作用，其主要原因是發(fā)酵小麥籽粒含有大量的靈芝菌

34、絲體。靈芝菌絲體中含有靈芝多糖、靈芝三萜等功能性成分，具有較強的抗氧化作用。此外，小麥中的蛋白質、多糖等大分子物質在靈芝菌絲體分泌的水解酶的作用下，被降解為低聚肽和低聚糖。低聚肽和低聚糖不僅更容易被吸收利用，還具有較強的抗氧化能力，這也是靈芝發(fā)酵小麥具有較強抗氧化作用的原因之一。</p><p>　　總之，小麥經(jīng)靈芝發(fā)酵后，不僅營養(yǎng)成分有所改善，抗氧化能力也顯著提高。靈芝發(fā)酵小麥經(jīng)烘干與粉碎后，可作為抗氧化類功能

35、性食品的生產(chǎn)原料，也可與普通小麥粉一起用于饅頭、面條、粥粉等普通食品的生產(chǎn)，以提高其營養(yǎng)價值和保健功能。靈芝發(fā)酵小麥粉的物化特性、貯存和加工過程中抗氧化作用的穩(wěn)定性、攝入人體后的實際保健效果等還需要進一步系統(tǒng)研究。</p><p><b>　　參考文獻：</b></p><p>　　[1] 黃婷, 朱哲, 劉良忠, 等. 納豆幾種干燥方法的比較及主要營養(yǎng)成分的分析 [

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57、　　immersion in rats [J]. Turkish Neurosurgery, 2016, 26(3): 288-384</p><p>　　XI L Y, LI Y, QIAN Z J, et al. In vitro antioxidant activity of 5-HMF isolated from marine red alga laurencia undulata in free-rad

58、ical-mediated oxidative systems [J]. Journal of Microbiology & Biotechnology, 2009, 19(11): 1319-1327</p><p>　　NIE H, XIONG L, LAO N, et al. Hyperbaric oxygen preconditioning induces tolerance against sp

59、inal cord ischemia by upregulation of antioxidant enzymes in rabbitsm [J]. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 2006, 26(5

60、): 666-674.</p><p>　　Nutritional Characteristics and Antioxidant Capacity of Wheat Fermented by Ganoderma lucidum</p><p>　　Kou Juanni1 Li Songwen2 Xin Hanxiao2 Liu Liying1 Sun Zhongtao1</

61、p><p>　　( College of Life Sciences, Shandong Agricultural University1, Tai’an 271018)</p><p>　　（Shandong Zuotianshi Biotechnology Company Limited2, Jinan 250000)</p><p>　　Abstract The

62、 solid state fermentation of wheat by Ganoderma lucidum was carried out, and the nutritional components and antioxidant capacity of wheat before and after fermentation were determined and compared. Result showed that the

63、 mass fraction of protein, crude fat, total soluble substance, soluble protein and soluble sugar of the fermented wheat were increased by 8.1%, 14.9%, 837%, 197% and 537%, respectively, compared with the unfermented whea