實驗一培養(yǎng)基的制備-蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院

1、<p>　　農(nóng)業(yè)微生物實驗課指導(dǎo)</p><p><b>　?。ㄐ抻啺妫?lt;/b></p><p><b>　　草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院</b></p><p><b>　　草地保護(hù)研究所編寫</b></p><p>　　2012.09.01</p><p&

2、gt;　　實驗一 培養(yǎng)基的制備</p><p><b>　　一．實驗?zāi)康?lt;/b></p><p>　　明確培養(yǎng)基的配置原理。</p><p>　　通過對基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配置，掌握配置培養(yǎng)基的一般方法和步驟。</p><p><b>　　二．實驗原理</b></p><p>　　

3、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基是一種半合成培養(yǎng)基，適宜于培養(yǎng)各種類型微生物，尤其適合培養(yǎng)真菌。這種培養(yǎng)基是由天然材料馬鈴薯和葡萄糖組成的，營養(yǎng)豐富而且原料容易取得，是一種使用而價廉的培養(yǎng)基。馬鈴薯浸出粉有助于各種微生物的生長，葡萄糖提供能源；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。</p><p>　　牛肉浸膏培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌培養(yǎng)基，有時又稱普通培養(yǎng)基，由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)菌生長所需的最基本營養(yǎng)物質(zhì)，所以可供作微

4、生物生長繁殖之用?；A(chǔ)培養(yǎng)基中含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl。其中，牛肉膏作為微生物碳源，能源，磷酸鹽和維生素，蛋白胨提供氮源和維生素，而NaCl提供無機(jī)鹽。在配置牛肉浸膏培養(yǎng)基時還需要加入一定量的瓊脂作為凝固劑。</p><p>　　高氏一號培養(yǎng)基是用來培養(yǎng)和觀察放線菌形態(tài)特征的合成培養(yǎng)基。如果加入適量的抗菌藥物，則可用來分離各種放線菌。此合成培養(yǎng)基的主要特點是含有多種化學(xué)成分已 知的無機(jī)鹽，這些無機(jī)鹽可能相互作

5、用而產(chǎn)生沉淀。因此，混合培養(yǎng)基成分時，一般是按配方的順序依次溶解各成分，甚至有時還需要將兩種或多種成分分別滅菌，使用時再按比例混合。</p><p><b>　　三．實驗準(zhǔn)備</b></p><p>　　實驗材料：牛肉浸膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、NaOH溶液、HCl(酸液)、葡萄糖、馬鈴薯(土豆)、酒精、可溶性淀粉2 g、KNO3 0.1 g、K2HPO4 0.05

6、g，MgSO4· 7H2O 0.05 g、NaCl 0.05 g、FeSO4· 7H2O 0.001 g (母液)、瓊脂2 g、自來水100mL等。</p><p>　　實驗器材：高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、電爐、天平、三角瓶、紗布、線繩、記號筆、超凈工作臺、pH計、玻璃棒、量筒，燒杯和三角瓶等。</p><p><b>　　四．實驗步驟</b>&

7、lt;/p><p>　　(1)PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的簡稱，即Potato Dextrose Agar 。</p><p>　　配方：馬鈴薯(去皮)200 g、蔗糖15-20 g、瓊脂20-30 g、蒸餾水1000 mL。PH自然。</p><p><b>　　步驟：</b></p><p>　　(1

8、) 將馬鈴薯洗凈，去皮，切成大小約為1-3 cm的小塊，稱200 g，放入1000 mL水中煮沸20-30 min，用四層紗布過濾，取其濾液；</p><p>　　(2)定容：加水補(bǔ)足至1000 mL；</p><p>　　(3)加入稱量好的蔗糖和瓊脂至全部溶化；</p><p>　　(4)趁熱分裝至試管或三角瓶；</p><p>　　(5)

9、用封口膜封口，扎緊，即可進(jìn)行滅菌；</p><p>　　(6)滅菌：將上述培養(yǎng)基以0.1Mpa，121℃，高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后將培養(yǎng)基取出；</p><p>　　(7)一般在培養(yǎng)基溫度降至50-60攝氏度的時候開始在超凈工作臺上往培養(yǎng)皿中分裝；</p><p>　　(8)待培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基凝固后，將培養(yǎng)皿倒置，防止皿蓋上的冷凝水污染培養(yǎng)基(此時皿蓋在下，

10、培養(yǎng)基中蒸發(fā)出的水蒸氣是向上走的，還是凝結(jié)于培養(yǎng)基上，就不會有在皿蓋上形成水滴后再滴落的情況了，如此可防止污染)。 </p><p>　　(2) 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基</p><p>　　1、配方：牛肉膏3-5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20-30 g、蒸餾水1000 mL。PH值7.4-7.6。</p><p><b>　　2、步

11、驟：</b></p><p>　　(1)稱量：根據(jù)用量按比例依次稱取各種成分，牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水融化后到入燒杯，蛋白胨易吸濕，稱量時要迅速。</p><p>　　(2)溶解：在燒杯中加入少于所需的水量，加熱，逐一加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸后加入，融化過程需不斷攪拌。加熱時應(yīng)注意火力，勿使培養(yǎng)基燒焦或溢出。溶好后，補(bǔ)足所需水分。<

12、;/p><p>　　(3)調(diào)pH值：若pH值不適宜，可用1 mol/L NaOH或1 mol/LHCl把pH值調(diào)至所需范圍。</p><p>　　(4)過濾：趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利于某些實驗結(jié)果的觀察，如無特殊要求時可省去此步驟。</p><p>　　(5)分裝：按照實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)；分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，分裝三角瓶

13、的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過三角瓶容積的1/2為宜。</p><p>　　以下步驟同上(5)-(8)</p><p>　　(3)高氏培養(yǎng)基：高氏培養(yǎng)基是用來培養(yǎng)和觀察放線菌形態(tài)特征的合成培養(yǎng)基。</p><p><b>　　1.配方</b></p><p>　　可溶性淀粉(20 g)、KNO3(1 g)、K2HPO4

14、(0.5 g)、MgSO4· 7H2O(0.5 g)、NaCl(0.5 g)、FeSO4· 7H2O(0.01 g)、瓊脂 20 g、pH=7.4-7.6。</p><p><b>　　2、步驟：</b></p><p>　　配制時，先用少量冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加熱，邊攪拌邊依次逐一溶化其他成分，溶化后，補(bǔ)足水分到

15、100 mL，調(diào)pH，121℃滅菌20 min。</p><p>　　高溫滅菌后，倒平皿前加入10%酚2滴至100 mL培養(yǎng)皿中混勻，將培養(yǎng)基倒入平皿內(nèi)約15 mL/皿。</p><p>　　實驗二 環(huán)境中微生物的分離和培養(yǎng)</p><p><b>　　一、實驗?zāi)康?#160;</b></p><p>　　1、消毒和滅菌

16、的操作方法及原理。</p><p>　　2、證明實驗室環(huán)境與體表存在微生物。</p><p>　　3、學(xué)習(xí)空氣、土壤、實驗室中微生物分離的方法。</p><p>　　4、觀察不同類群微生物的菌落形態(tài)特征。</p><p><b>　　二、實驗原理 </b></p><p>　　微生物在自

17、然界中呈混雜狀態(tài)存在，要獲得所需菌種，必須從中進(jìn)行分離。在保藏菌種時不慎污染時也需予以分離。 </p><p>　　分離純化方法很多，基本原理相似，即將待分離樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，使微生物的?xì)胞(或孢子)盡量以分散狀態(tài)存在，然后使其長成一個個純種單菌落。</p><p>　　土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此，土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生

18、物資源的重要基地，可以從中分離純化得到許多有價值的菌株。</p><p><b>　　三、實驗準(zhǔn)備</b></p><p>　　實驗材料：PDA培養(yǎng)基(上一次實驗課已準(zhǔn)備) </p><p>　　實驗器材：天平、酒精燈、培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、移液管、培養(yǎng)箱、記號筆、</p><p>　　無菌水、超凈工作臺、棉花、酒精、撥

19、針、接種環(huán)、手術(shù)刀和鑷子等。</p><p><b>　　四、實驗步驟</b></p><p><b>　　(一)消毒和滅菌</b></p><p>　　(1)無菌濾紙的干熱滅菌(暫時不做該部分) 在160℃下，烘2小時。 開始滅菌時升溫不宜過猛，物品不要太擠，溫度上升至160℃時開始計時，2小時后切斷電源

20、，溫度降至60 ℃左右后，取出滅菌物品。</p><p>　　(2)接種針、鑷子等的高溫火焰滅菌 在95%酒精中浸過后，通過火焰將酒精燒去，重復(fù)三次以上。(3)紫外線用于空氣消毒 波長在250-280 nm的紫外線殺菌力最強(qiáng)，30瓦紫外光燈直射2 m內(nèi)照射半小時，即可殺死空氣中的微生物。打開紫外燈，滅菌30 min。</p><p>　　(4)化學(xué)藥品用于種子及植物表

21、面消毒次氯酸鈉消毒：種子用1%，植物器官用0.3%消毒各1 min。再用無菌水漂洗3-5次。</p><p>　　(二)環(huán)境中微生物的檢測</p><p>　　1. 器材 PDA培養(yǎng)基(上一次實驗課已備)，無菌鑷子，無菌棉球等</p><p><b>　　2. 實驗步驟：</b></p><p>　　(1) 取5個倒

22、好培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿作為對照;</p><p>　　(2) 取3個PDA培養(yǎng)基，打開皿蓋，使培養(yǎng)基暴露在空氣中約10 min，再蓋上皿蓋，寫明處理、組別和日期；</p><p>　　(3) 取3個PDA培養(yǎng)基，用無菌鑷子夾上無菌棉球在實驗臺或凳子上擦以下，然后打開皿蓋用棉球在培養(yǎng)基表面輕輕涂抹(勿劃破培養(yǎng)基)，寫明處理、組別和日期再蓋上皿蓋；</p><p>　　(4)

23、 取3個PDA培養(yǎng)基，打開皿蓋用你的手指在培養(yǎng)基表面接觸輕壓3-5點，再蓋上皿蓋。寫明處理、組別和日期；</p><p>　　(5) 取取3個PDA培養(yǎng)基，打開皿蓋，對著培養(yǎng)基表面咳嗽或打噴嚏2-3次(或者深呼吸)，再蓋上皿蓋。寫明處理、組別和日期；</p><p>　　(6) 上述工作完備后，將各皿倒置保存在28℃下，培養(yǎng)3-6天。3天后進(jìn)行初次</p><p>

24、　　統(tǒng)計，7天后，進(jìn)行再次統(tǒng)計。</p><p><b>　　五、思考題</b></p><p>　　1. 反復(fù)練習(xí)消毒和滅菌，并搞清楚其本質(zhì)的區(qū)別。</p><p>　　2. 統(tǒng)計結(jié)果并做表，完成以下表格的內(nèi)容</p><p>　　實驗三 病原微生物的分離和培養(yǎng)</p><p><b>

25、;　　一、實驗?zāi)康?#160;</b></p><p>　　1、熟練掌握無菌操作技術(shù)和消毒、滅菌的操作步驟及其原理</p><p>　　2、掌握植物病原真菌的分離、培養(yǎng)和接種的一般方法，并掌握其基本原理</p><p><b>　　二、實驗原理 </b></p><p>　　自然界中各種微生物混雜生

26、活在一起，要研究某種微生物的特性，首先須使該微生物處于純培養(yǎng)狀態(tài)。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一株微生物的過程稱，即為微生物的分離與純化。植物病原微生物的分離培養(yǎng)對病原物鑒定、病原物形態(tài)觀察、植物病害接種體的培養(yǎng)等方面都是經(jīng)常使用的研究手段。 </p><p>　　植物患病組織內(nèi)的微生物，如果給予適宜的環(huán)境條件，除個別種類外，一般都能恢復(fù)生長和繁殖。植物病原微生物的分離就是指通過人工培養(yǎng)，從染病植物

27、組織中將病原真微生物與其它微生物相分開，并從寄主植物中分離出來，再將分離到的病原微生物于適宜環(huán)境內(nèi)純化，這個過程總稱植物病微生物的分離培養(yǎng)。植物病原真微生物的分離一般都是采用組織分離法，就是切取小塊病組織，經(jīng)表面消毒和滅菌水洗過后，移到人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 </p><p><b>　　三、實驗準(zhǔn)備</b></p><p>　　實驗材料：植物病株(校園中紅豆草

28、褐稈病)、種子(苜蓿、紅豆草、沙打</p><p>　　旺)、土樣(校園紅豆草地中)，培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA供</p><p>　　分離真菌，牛肉胨培養(yǎng)基NA供分離細(xì)菌)。</p><p>　　實驗工具：無菌培養(yǎng)皿、三角瓶、玻璃刮刀、吸管、手術(shù)刀、鑷子、酒精燈、無菌濾紙、酒精燈，剪刀，小燒杯，大燒杯和記號筆等。</p><p>

29、　　實驗試劑：無菌水，75%酒精、0.1%NaClO溶液。</p><p><b>　　四、實驗步驟</b></p><p><b>　　(一) 準(zhǔn)備工作</b></p><p>　　1. 工作環(huán)境的清潔和消毒 在無菌室、無菌箱或無菌工作臺(超凈工作臺)上進(jìn)行。 超凈工作臺要經(jīng)過紫外線照射(30 min)并用藥

30、物消毒(70%酒精噴霧)。2. 分離材料的選擇 選擇新近發(fā)病的植株、器官或組織作為分離材料，可以減少腐生菌的污染。任何植株壞死部分的內(nèi)部或表面，都可能有腐生物的寄生，所以一般斑點病要從病斑邊緣的組織剪取，即從病、健組織交界處獲得分離材料，將感病組織洗凈后放入試管或培養(yǎng)皿內(nèi)。</p><p>　　圖1：新鮮植物病株示意圖</p><p>　　(二)植物病原真菌的分離 1.

31、PDA培養(yǎng)基的制備 2. 沖洗病葉，從病斑周圍1-2 mm處剪取。 3. 取滅菌的小燒杯或培養(yǎng)皿，放入組織材料，先用70%酒精溶液處理30-60秒，再用0.3%次氯酸鈉溶液處理1-3分鐘。</p><p>　　4. 消毒后，取出，用無菌水沖洗3-5次。 5. 用滅菌鑷、剪在無菌條件下將分離材料剪成2-3 mm大小的方塊，每塊組織均為病健相間的組織。用滅菌鑷子夾取剪好的材料，加入培養(yǎng)基平板上輕輕按

32、壓，每皿4-5塊，排放均勻。 6. 用記號筆在培養(yǎng)皿上注明分離的代號、日期、姓名，將培養(yǎng)皿倒轉(zhuǎn)置于22-25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 7. 3-4天后，挑選由分離材料上長出的典型而無雜菌的菌落，在菌落邊緣用菌針挑取帶有菌絲的培養(yǎng)基一小塊轉(zhuǎn)入斜面試管培養(yǎng)基中央，或有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。</p><p>　　圖2：病原真菌在培養(yǎng)皿中的分離培養(yǎng)情況</p><p>&

33、lt;b>　　土壤細(xì)菌的分離</b></p><p>　　1. 制作土壤稀釋液：準(zhǔn)確稱取土樣10 g，加入裝有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩約20 min，使土樣與水充分混勻。用一支無菌吸管從中吸取1 mL土壤懸液加入裝有9 mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10-2稀釋液；再換一支無菌吸管吸取10-2稀釋液1 mL，移入裝有9 mL無菌水的試管中，也吹吸

34、三次，即成l0-3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列土壤稀釋液。</p><p>　　2. 涂布：將無菌平板編上10-4、10-5、10-6號碼，每一號碼設(shè)置至少三個重復(fù)，用無菌移液管按無菌操作要求吸取10-6稀釋液各1 mL放入編號10-6的3個平板中，同法吸取10-5稀釋液各l mL放入編號10-5的3個平板中，再吸取10-4稀釋液各l mL放

35、入編號10-4的3個平板中(由低濃度向高濃度時，吸管可不必更換)。再用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂抹均勻，每個稀釋度用一個滅菌玻璃涂棒，更換稀釋度時需將玻璃涂棒灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時，也可以不更換涂棒。</p><p>　　3. 培養(yǎng)：至于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。</p><p>　　圖3.：制備土壤稀釋液(分級稀釋)</p><p>　　圖4：平板劃線法

36、分離</p><p>　　平板劃線法分離的方法1. 斜線法 2. 曲線法 3.方格法 4. 放射法 5. 四格法</p><p>　　圖5：劃線法得到的培養(yǎng)物</p><p>　　3. 培養(yǎng)(28℃)4. 分離菌種統(tǒng)計，計算每種菌在土壤中的數(shù)量(多少菌落/克土壤)5. 菌種純化(24 h后)6. 菌種保藏(留作鑒定)</p><p>　

37、　(四)菌種的純化1. 菌落邊緣切取法：選擇典型菌落，用滅菌的接種環(huán)切取邊緣菌絲或孢子移</p><p>　　植到斜面或平板上培養(yǎng)，可以獲得純培養(yǎng)菌種。</p><p>　　2. PDA平板表面單孢子挑取法：將需要純化的菌種在無菌玻片上水滴中懸浮</p><p>　　開，再用接種環(huán)劃線到平板上，繼而在顯微鏡下挑選單孢子移植培養(yǎng)。</p><p&

38、gt;　　圖6：真菌孢子示意圖</p><p><b>　　五、思考題</b></p><p>　　1. 試擬出從土壤中分離芽孢桿菌的主要實驗步驟。2. 如何檢驗平板上某個單菌落是不是純培養(yǎng)？</p><p>　　實驗四 微生物的純化、菌落計數(shù)及鑒定</p><p><b>　　一、實驗?zāi)康?#160;<

39、;/b></p><p>　　1、學(xué)習(xí)平板菌落計數(shù)的基本原理和方法。</p><p>　　2、初步掌握微生物純化的基本方法。</p><p>　　3、學(xué)習(xí)并掌握微生物的形態(tài)學(xué)鑒定方法。</p><p><b>　　二、實驗原理</b></p><p>　　平板菌落計數(shù)法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)

40、基上所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是說一個菌落即代表一個單細(xì)胞。計數(shù)時，先將待測樣品作一系列稀釋，再取一定量的稀釋菌液接種到培養(yǎng)皿中，使其均勻分布于平皿中的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后，由單個細(xì)胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可換算出樣品中的含菌數(shù)。</p><p>　　自然條件下，微生物常以群落狀態(tài)存在，這種群落往往是不同種類微生物的混合體。為了研究某種微生物的特性或者要大量培養(yǎng)和使用某種微

41、生物，必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。</p><p>　　微生物的分類鑒定是微生物的重要內(nèi)容，一般從菌落特征、細(xì)菌特點及生理生化、分子生物學(xué)等方面進(jìn)行鑒定。形態(tài)學(xué)特征始終被用作微生物分類和鑒定的重要依據(jù)之一，其中有兩個重要原因：一是它易于觀察和比較，尤其是在真核微生物和具有特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)的細(xì)菌中；二是許多形態(tài)學(xué)特征依賴于多基因的表達(dá)，具有相對的穩(wěn)定性。 <

42、/p><p>　　不同種類微生物應(yīng)采用不同的重點鑒定指標(biāo)：</p><p>　　真菌：形態(tài)特征較豐富、細(xì)胞體積較大，以形態(tài)特征為主要指標(biāo)；</p><p>　　放線菌、酵母菌：形態(tài)特征與生理特征兼用；</p><p>　　細(xì)菌：形態(tài)特征較缺乏，使用較多的生理、生化和遺傳等指標(biāo)。</p><p>　　1. 培養(yǎng)特征： 菌落特

43、征，大小、側(cè)面隆起、光澤、粘稠、顏色、邊緣、表面狀況、質(zhì)地、水溶性色素(粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)紅色或紫紅色色素)等</p><p><b>　　2. 細(xì)胞形態(tài)：</b></p><p>　　形態(tài)：球形、桿狀、弧形、螺旋形、絲狀、分枝及特殊形狀</p><p>　　大小：其中最重要的是細(xì)胞的寬度或直徑 </p><p>　　排列：

44、單個、成對、成鏈或其他特殊排列方式 </p><p><b>　　3. 特殊細(xì)胞結(jié)構(gòu)</b></p><p>　　有無鞭毛、芽孢、莢膜(糖被)、菌膠團(tuán)</p><p>　　孢子：形狀、大小、顏色、著生位置、數(shù)量及排列 </p><p>　　細(xì)胞附屬物：如柄、絲狀物、鞘、異形胞等</p><p>　

45、　超微結(jié)構(gòu)：壁、內(nèi)膜系統(tǒng)、放線菌孢子表面特征等</p><p><b>　　三、實驗準(zhǔn)備</b></p><p>　　實驗材料：上節(jié)實驗課分離的微生物；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；高氏一號瓊脂培養(yǎng)基；加有氯霉素(或慶大霉素)和孟加拉紅的馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基:在1000 mL培養(yǎng)基中加入注射用氯霉素2 mL，孟加拉紅33.4 mg，均于滅菌前加入。</p><

46、;p>　　實驗工具：記號筆、酒精燈、打火機(jī)、接種環(huán)、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、撥針、濾紙。</p><p><b>　　四、實驗步驟</b></p><p>　　(一) 選取每皿菌落數(shù)在10～100之間的平板用于計數(shù)。不應(yīng)遺漏酵母菌的菌落，必要時可制片檢查，統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中從土壤中分離出的的菌落數(shù)目</p><p><b>　　(

47、二)挑菌純化</b></p><p>　　從長有單菌落的平板中選取典型的真菌菌落(包括酵母菌菌落)轉(zhuǎn)接斜面，并同時制片作純度檢查。若不純，應(yīng)進(jìn)一步挑取該菌落采用劃線分離，或制成菌懸液進(jìn)一步作稀釋分離，直至獲得純培養(yǎng)體為止。</p><p><b>　　鑒定：</b></p><p>　　1. 搽拭干凈載玻片和蓋玻片</p>

48、;<p>　　2. 載玻片上加一滴水，挑少許真菌的菌絲和孢子放到水滴中，蓋玻片一側(cè)先接觸水滴附近，另一側(cè)輕輕放下，使水滴均勻分布在蓋玻片和載玻片之間，且無氣泡</p><p>　　3. 放在顯微鏡的低倍鏡下觀察，選擇單個的菌絲、孢子和分生孢子梗</p><p>　　4. 放到高倍鏡下觀察和繪圖</p><p><b>　　思考題</b&

49、gt;</p><p>　　1. 統(tǒng)計土壤中分離出的細(xì)菌種類，描述各種菌落特征、菌體形態(tài)和生化反應(yīng)結(jié)果，并計算在土壤中的數(shù)量。</p><p>　　2. 統(tǒng)計植物組織中和種子上分離出的真菌種類，描述每種菌的菌落特征、孢子形態(tài)和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)(繪圖)，統(tǒng)計分離率或種子帶菌率。</p><p>　　實驗五 微生物的計數(shù)和測量</p><p><b

50、>　　一、實驗?zāi)康?lt;/b></p><p>　　1、了解目鏡測微計和鏡臺測微計的構(gòu)造。</p><p>　　2、掌握用顯微測微計測量微生物細(xì)胞大小的方法。</p><p>　　3、了解血球計數(shù)板的構(gòu)造、原理和使用方法。</p><p>　　4、 掌握應(yīng)用血球計數(shù)板測定青霉菌孢子濃度的方法。</p><p&

51、gt;<b>　　二、實驗原理</b></p><p>　　在一定條件下，各種微生物細(xì)胞的大小，是微生物形態(tài)特征之一，也是分類鑒定的依據(jù)之一。由于微生物細(xì)胞很小，只能在顯微鏡下測量，一般采用顯微測微計來測量。顯微測微計有鏡臺測微計和接目測微計兩個部件。鏡臺測微計是在中央部分刻有精度等分線的載玻片。一般將1 mm等分為100格，每格長度為10 m，用于校正接目測微計。接目測微計可直接用于測量細(xì)

52、胞的大小。它是一塊可放在目鏡內(nèi)的圓形玻片，其中央一般有100等分的小格，每小格代表的長度隨目鏡、物鏡放大倍數(shù)的大小而改變。通常必須以鏡臺測微計來校準(zhǔn)，從而計算出在一定的接物鏡和接目鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，接目測微計每格的實際代表長度，最后方可利用接目測微計直接測量被測對象的長度和寬度。</p><p>　　目鏡測微尺的標(biāo)定 把目鏡的上透鏡旋開，將目鏡測微尺輕輕放在目鏡的隔板上，使有刻度的一面朝下。將鏡臺測微尺放在顯微

53、鏡的載物臺上，使有刻度的一面朝上。先用低倍鏡觀察，調(diào)焦距，待看清鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度相平行，并使兩尺左邊的一條線重合，向右尋找另外一條兩尺相重合的直線。根據(jù)下列標(biāo)定公式進(jìn)行標(biāo)定。 </p><p>　　接目測微計每格的長度(m)＝</p><p>　　例如，目鏡測微尺20個小格等于鏡臺測微尺3小格，已知鏡臺測微尺每格為10 m，則3小

54、格的長度為3×10=30m，那么相應(yīng)地在目鏡測微尺上每小格長度為3×10÷20=1.5 m。用以上計算方法分別校正低倍鏡、高倍鏡及油鏡下目鏡測微尺每格實際長度。</p><p>　　顯微直接計數(shù)法，即利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是一種常用的微生物計數(shù)方法。該計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網(wǎng)，每

55、個方格網(wǎng)共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為l mm，則每一個大方格的面積為l mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.l mm，所以計數(shù)室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。

56、</p><p>　　計數(shù)時，通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。</p><p>　　設(shè)五個中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個中方格的計數(shù)板，則</p><p>　　1 mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50

57、000A·B(個)</p><p>　　同理，如果是16個中方格的計數(shù)板，</p><p>　　1 mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×16×104×B=32000A·B(個)</p><p><b>　　三、實驗準(zhǔn)備</b></p><p>　　實驗材料：菌種 青霉菌(Sacc

58、haromyces cerevisiae)斜面培養(yǎng)物</p><p>　　實驗工具：普通光學(xué)顯微鏡、鏡臺測微計、接目測微計、蓋玻片、載玻片、香柏油、滴管、血球計數(shù)板、擦鏡紙。</p><p><b>　　四、實驗步驟</b></p><p>　　(一)菌體大小的測定</p><p><b>　　1、放置目鏡測微

59、計</b></p><p>　　取出接目鏡，旋開接目透鏡，將接目測微計放在目鏡的隔板上(有刻度的一面向下)，然后旋上接目鏡，最后將此接目鏡插入目鏡鏡筒內(nèi)。</p><p><b>　　2、放置鏡臺測微計</b></p><p>　　把鏡臺測微計放在顯微鏡載物臺上(有刻度的一面向上)。</p><p><

60、b>　　3、校正接目測微計</b></p><p>　　用低倍物鏡觀察，對準(zhǔn)焦距，通過調(diào)焦能看清鏡臺測微計的刻度；移動鏡臺測微計和轉(zhuǎn)動接目測微計使兩者刻度平行；轉(zhuǎn)動推進(jìn)器從而使兩測微計某段起、止線完全重合，數(shù)出兩條重合線之間的格數(shù)。</p><p>　　用同法分別校正在高倍鏡和油鏡下目鏡測微尺每小格所代表的長度。</p><p>　　4、計算接目測

61、微計每格的相對長度</p><p>　　接目測微計每格的長度(m)＝</p><p>　　5、將鏡臺測微尺取下，分別換上青霉菌玻片標(biāo)本，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量菌體的大小。先量出菌體的長和寬占目鏡測微尺的格數(shù)，再以目鏡測微尺每格的長度計算出菌體的長和寬。并詳細(xì)記錄于表1中。</p><p>　　例如，目鏡測微尺在這架顯微鏡下，每格

62、相當(dāng)于1.5 μm，測量的結(jié)果，若菌體的平均長度相當(dāng)于目鏡測微尺的2格，則菌體長應(yīng)為3×1.5 μm=3.0 μm。</p><p>　　一般測量菌體的大小，應(yīng)測定10-20個菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。</p><p>　　(二)微生物顯微鏡直接計數(shù)法</p><p>　　1、青霉菌孢子懸液的制備</p><p>　　(

63、1)取一支孢子成熟的青霉菌斜面培養(yǎng)物，用無菌移液管吸取5ml無菌水加入菌管中。</p><p>　　(2)采用無菌操作技術(shù)，用接種環(huán)將菌管內(nèi)斜面上的孢子輕輕刮下，注入到盛有玻璃珠的三角瓶中，同樣方法將另15 mL無菌水分三次再加入菌管中，將剩余的孢子全部刮干凈，將孢子液全部合并于三角瓶中，水平旋轉(zhuǎn)振蕩30 min，然后倒入含有脫脂棉的無菌漏斗中過濾，得單孢子懸浮液。</p><p>　　2

64、、顯微鏡下孢子濃度測定</p><p><b>　　(1)稀釋</b></p><p>　　定量取出孢子懸液，加到無菌干燥的試管中，按照一定倍數(shù)將其稀釋，稀釋的程度一般以血球計數(shù)板每小格內(nèi)含有5～10個菌或孢子最為合適。</p><p><b>　　(2)加樣</b></p><p>　　取潔凈干燥

65、的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，用無菌滴管從蓋玻片的邊緣滴一滴孢子稀釋液，則孢子稀釋液自行滲入，注意不要產(chǎn)生氣泡。</p><p><b>　　(3)計數(shù)</b></p><p>　　靜置5 min，使孢子沉降不再流動，然后即可在顯微鏡下觀察計數(shù)。先在低倍鏡下找到計數(shù)室的位置，然后換成高倍鏡計數(shù)。如發(fā)現(xiàn)孢子懸液太濃或太稀釋，應(yīng)重新稀釋并計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中的計算

66、結(jié)果取平均值，以減少實驗誤差，并詳細(xì)記錄于表2中。</p><p>　　(4)清洗血球計數(shù)板</p><p>　　計數(shù)完畢，將血球計數(shù)板取下，在水龍頭上用水柱沖洗，切忌用硬物洗刷，然后自然吹干，鏡檢觀察是否有孢子或其他沉積物，直至洗刷干凈。</p><p><b>　　五、思考題</b></p><p>　　1．目鏡測微

67、尺標(biāo)定結(jié)果：</p><p>　　低倍鏡下 倍目鏡測微尺每格長度是 μm。</p><p>　　高倍鏡下 倍目鏡測微尺每格長度是 μm。</p><p>　　油鏡下 倍目鏡測微尺每格長度是 μm。</p><p>　　菌體大小測定結(jié)果(表1)：</p><p>　　

68、3．菌體數(shù)目測定結(jié)果(表2)</p><p>　　A表示五個中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。 </p><p>　　實驗六 細(xì)菌的革蘭氏染色及其形態(tài)觀察</p><p><b>　　一、實驗?zāi)康?lt;/b></p><p>　　1、了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。</p><

69、p>　　2、學(xué)習(xí)掌握革蘭氏染色技術(shù)，進(jìn)一步熟練光學(xué)顯微鏡油鏡的使用技術(shù)。</p><p><b>　　二、實驗原理</b></p><p>　　革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立的。革蘭氏染色法(Gram stain)不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示

70、；染色反應(yīng)呈紅色(復(fù)染顏色)的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。細(xì)菌對于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當(dāng)用乙醇處理時，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞內(nèi)而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍(lán)紫色；革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使

71、結(jié)晶紫-碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液(番紅)的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。</p><p>　　革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料(basic dye)初染液；媒染劑(mordant)；脫色劑(decolorising agent)和復(fù)染液(counterstain)。堿性染料初染液的作用象在細(xì)菌的單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫(crystal violet)。

72、媒染劑的作用是增加染料和細(xì)胞之間的親和性或附著力，即以某種方式幫助染料固定在細(xì)胞上，使不易脫落，碘(iodine)是常用的媒染劑。脫色劑是將被染色的細(xì)胞進(jìn)行脫色，不同類型的細(xì)胞脫色反應(yīng)不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95％的酒精(ethanol)。復(fù)染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復(fù)染的目的是使被脫色的細(xì)胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細(xì)胞仍然保持初染的顏色，從而將細(xì)胞區(qū)分成G+和G-兩大類群，常用的復(fù)染液是番

73、紅。</p><p><b>　　三、實驗準(zhǔn)備</b></p><p>　　實驗材料：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌</p><p>　　實驗工具：顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲苯，因二甲苯有毒及容易損壞鏡頭，可用乙醚乙醇混合液替代二甲苯)、生理鹽水、擦鏡頭紙、吸水濾紙、紗布、打火機(jī)、玻璃鉛筆、玻片夾或鑷子等。</p&

74、gt;<p>　　實驗試劑：草酸銨結(jié)晶紫，番紅水溶液，碘液，95%乙醇</p><p><b>　　四、實驗步驟</b></p><p>　　(一)涂片 將培養(yǎng)24小時的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別作涂片(注意涂片切</p><p>　　不可過于濃厚)，干燥、固定。固定時通過火焰1～2次即可，不可過熱，以 </p>

75、<p><b>　　載玻片不燙手為宜。</b></p><p><b>　　(二)染色</b></p><p>　　1．初染加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗。</p><p>　　2. 媒染滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。</p><p>　　3. 脫色將載玻片上面的水甩凈，并襯

76、以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精 </p><p>　　剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約20～30秒鐘，立即用水沖凈酒精。</p><p>　　4. 復(fù)染用番紅液染1～2分鐘，水洗。</p><p>　　5. 鏡檢：干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。</p><p>　　以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌

77、，常常呈假陽性。</p><p>　　6. 同法在一載玻片上以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合制片，作革蘭氏染色對比。</p><p>　　五、革蘭氏染色的注意事項</p><p>　　(一)涂片不宜過厚，勿使細(xì)菌密集重疊，影響脫色效果，否則脫色不完全造成假陽性。鏡檢時應(yīng)以視野內(nèi)分散細(xì)胞的染色反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)。</p><p>　　(二)火焰固定不宜過

78、熱，以玻片不燙手為宜，否則菌體細(xì)胞變形。</p><p>　　(三)滴加染色液與酒精時一定要覆蓋整個菌膜，否則部分菌膜未受處理，亦可造成假象。</p><p>　　(四)乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。如脫色過度，則G+菌被誤染成G-菌；而脫色不足，G-菌被誤染成G+菌。在染色方法正確無誤前提下，如菌齡過長，死亡或細(xì)胞壁受損傷的G+菌也會呈陰性反應(yīng)，故革蘭氏染色要用活躍生長期的幼齡培養(yǎng)

79、物。</p><p><b>　　六、思考題</b></p><p>　　1．詳敘革蘭氏染色的原理及操作方法，染色時應(yīng)注意哪些問題? </p><p>　　2．哪些環(huán)節(jié)會影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性?其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么?</p><p>　　3．不經(jīng)過復(fù)染這一步，能否區(qū)別G+菌和G-菌? </p><