培養(yǎng)基母液的制備

1、實驗?zāi)夸?實驗室安全守則實驗操作須知實驗一、培養(yǎng)基母液的制備實驗二、培養(yǎng)基的配制與滅菌實驗三、培養(yǎng)材料滅菌和接種實驗四、愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖實驗五、愈傷組織的分化實驗六、植物再生與快速繁殖 實驗七、馬鈴薯莖尖脫毒實驗八、馬鈴薯試管微薯的誘導(dǎo)實驗九、植物細胞懸浮培養(yǎng)與同步化實驗十、植物細胞的生長計量技術(shù)實驗十一*、 細胞的分裂指數(shù)實驗十二*、 細胞周期的測定,實驗室安全守則,一般規(guī)定 1、上課第一天請先熟悉環(huán)

2、境，察看緊急沖洗站、洗眼站、滅火器、急救箱及安全梯等的位置，牢記“安全”是進行任何實驗最重要的準(zhǔn)則。 2、在實驗室內(nèi)請穿著實驗服，避免穿涼鞋、拖鞋。留有長發(fā)者，戴帽套將頭發(fā)捲入套內(nèi)，或以橡皮筋束于后，以防止引火危險或污染實驗。,,3、在實驗室內(nèi)禁止吸煙、飲食、化妝、嚼口香糖、嬉戲奔跑，食物飲料勿存放于實驗室的冰箱中，實驗桌上勿堆放書包、書籍、衣服及雜物等。 4、所有實驗儀器、耗材、藥品等均屬實驗室所有，不得帶出實驗室。每組分配的儀器

3、、耗材請確定清點與保管，課程結(jié)束后如數(shù)清點繳回。公用儀器請善加愛惜使用，實驗前后，請把工作區(qū)域清理擦拭，并隨時保持環(huán)境衛(wèi)生。,5、實驗前詳閱實驗內(nèi)容，了解實驗細節(jié)的原理及操作規(guī)程，注意上課所告知的注意事項。實驗進行中有任何狀況或疑問，隨時發(fā)問，切勿私自變更實驗程序。打翻任何藥品試劑及器皿時，請隨即清理。實驗后，確切記下自己的結(jié)果，嚴(yán)禁抄襲，確定關(guān)閉不用的電源、水、酒精燈及煤氣等。 6、睡眠不足、精神不濟或注意力無法集中，請立即停止實驗

4、。實驗時間若延長，請注意時間的管制及自身的安全，不可自行逗留實驗室過夜。 7、實驗完畢，請清理實驗室、倒垃圾、滅菌、關(guān)閉燈光及電源，離開實驗室前記得洗手。 8、任何意外事件應(yīng)立即報告師長，并應(yīng)熟知相關(guān)的應(yīng)急措施。,藥品1、使用任何藥品，請先看清楚標(biāo)示、注意事項，翻閱物質(zhì)安全資料表，查明是否對人體造成傷害，使用完畢請放回原位。 2、新配制的試劑請清楚注明內(nèi)溶物、濃度、注意事事項及配制日期，為避免污染，勿將未用完的藥劑倒回容器內(nèi)。

5、3、揮發(fā)性、腐蝕性、有毒溶劑（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、鹽酸、硫酸、?-mercaptoethanol、酚等）要在通風(fēng)櫥中戴手套量取配制，取用完后隨即蓋好蓋子，若不小心打翻試劑，馬上處理。,4、有毒、致癌藥劑例如acrylamide（神經(jīng)毒）、ethidium bromide（突變劑）、SDS、秋水仙素請戴手套及口罩取用，并勿到處污染，脫下手套后，應(yīng)養(yǎng)成洗手的好習(xí)慣。 5、接觸到病原材料或細菌，應(yīng)迅速消毒。所有被污染的物品，在丟棄或

6、重復(fù)使用前均需先滅菌，固體培養(yǎng)基不得倒入水槽或下水道中。 6、使用刻度吸管取物時，切勿用嘴吸取，請用自動吸管或安全吸球。,儀器1、使用儀器前先了解其性能、配置及正確操作方法，零件及附件嚴(yán)禁拆卸，勿私自調(diào)整，并注意插座電壓（110V或220V）之類別。 2、使用離心機時，離心管要兩兩對稱、重量平衡，鎖緊離心機轉(zhuǎn)陀。冷凍離心機于開機狀態(tài)時，務(wù)必蓋緊蓋子，以保持離心槽之低溫并避免結(jié)霜。 3、實驗時不要用潮濕有汗的手去操作電器，不要用手

7、緊握可能荷電的電器，不應(yīng)以兩手同時觸及電器，電器設(shè)備外殼均應(yīng)接地。萬一不慎發(fā)生觸電事故，應(yīng)立即切斷電源開關(guān)，對觸電者采取急救措施。,4、使用微波爐加熱時，不可有鋁箔等金屬物品，瓶蓋必須松開，以免爆炸。加熱后戴防熱手套取出瓶子。5、使用UV燈時，不要以眼睛直視UV，應(yīng)隔著擋板觀察，完畢立即關(guān)燈。 6、超凈工作臺內(nèi)的酒精有機溶劑及易燃物（如甲醇、乙醇、乙醚、瓦斯等）要遠離火苗，不可留置火焰燃燒，萬一著火，應(yīng)力持鎮(zhèn)定，沉著處理。酒精或乙醚

8、等著火時，應(yīng)使用泡沫滅火劑或濕毛巾覆蓋，勿使用水沖洗。 7、使用震蕩器震蕩培養(yǎng)時，注意三角瓶務(wù)必對稱放置，并用橡皮筋等夾緊，勿使其搖晃摔出臺面，否則需拆開并清除玻璃碎片與培養(yǎng)液。,急救措施1、急性呼吸系統(tǒng)中毒：應(yīng)使中毒者迅速離開現(xiàn)場，移到通風(fēng)良好的地方，呼吸新鮮空氣。如有休克、虛脫或心肺機能不全，必須先作抗休克處理，如人工呼吸、給予氧氣、喝興奮劑（如濃茶，咖啡）等。2、經(jīng)由口服而中毒：需立即用3-5%小蘇打溶液或1：5000高錳酸

9、鉀溶液洗胃，洗胃時要大量地喝，邊喝邊使之嘔吐，最簡單的催吐辦法是用手指或筷子壓舌根，或給中毒者喝少量（15-25毫升）1%硫酸銅或硫酸鋅溶液（催吐劑）。使之迅速將毒物吐出。洗胃要反復(fù)進行多次，直至吐出物中基本無毒物為止。再服解毒劑，一般解毒劑有雞蛋清、牛奶、淀粉糊、桔子汁等。另外有些特殊解毒劑專對某種中毒而用。如磷中毒時用硫酸銅，鋇中毒時用硫酸鈉，氰化物中毒時用硫代硫酸鈉等。,3、皮膚、眼、鼻、咽喉受毒物侵害時，應(yīng)立即用大量自來水沖洗，

10、然后送醫(yī)院請各?？漆t(yī)生處理。4、一度燒傷：只損傷表皮，皮膚呈紅斑，微痛，微腫，無水泡。如被化學(xué)藥品燒傷，應(yīng)立即用大量水沖洗，除去殘留在創(chuàng)面上的化學(xué)物質(zhì)，并用冷水浸沐傷處，可減輕疼痛，最后需要消毒，保護創(chuàng)面不受感染。 5、二度燒傷：損傷表皮及真皮層，皮膚起水泡，疼痛，水腫明顯。創(chuàng)面如污染嚴(yán)重，先用清水或生理鹽水沖洗，再以1：1000新潔爾滅消毒，不要挑破水泡，用消毒紗布輕輕包扎好，請醫(yī)生治療。,6、三度燒傷：損傷皮膚全層，包括皮下組織

11、，肌肉，骨骼，創(chuàng)面呈灰白色或焦黃色，無水泡，不痛，感覺消失。在送醫(yī)院前，主要防止感染和休克，可用消毒紗布輕輕包扎好，給傷者保暖和供氧，必要時注射嗎啡止痛。7、炸傷：  其急救措施基本同燒傷處理。但炸傷后傷口往往大量出血，應(yīng)立即將傷口上部扎緊，防止流血過多。如發(fā)生昏迷、休克等，應(yīng)進行人工呼吸，給氧，并送醫(yī)院治療。8、電擊傷：急救時首先使觸電者脫離電源，為此可拉下電閘或用木棍將觸電者從電源上撥開。當(dāng)心別把觸電者摔傷。

12、斷開電源后，檢查傷員呼吸和心跳情況，若呼吸停止，立即進行人工呼吸。對心跳亦停止者要同時進行心臟擠壓。電擊傷比較輕微者，很快能恢復(fù)健康，重者必需請醫(yī)生治療。應(yīng)該注意，觸電者在進行急救時，一般不要注射強心針和喝興奮劑。,實驗操作須知,1、實驗室設(shè)計與要求 實驗室設(shè)計是由工作的目的和規(guī)模決定的，要合理布局，通常按自然工作程序先后安排成一條連續(xù)的生產(chǎn)線，避免有的環(huán)節(jié)倒排增加日后工作的負(fù)擔(dān)或引起混亂。房屋可規(guī)劃為洗滌室、滅菌室、配制室、無

13、菌操作室、培養(yǎng)室、鑒定室、馴化移栽室等。1. 1準(zhǔn)備室 需備有的設(shè)備有：鼓風(fēng)干燥箱、落水架、工作臺、水池、水桶、水盆、試管刷等，主要用于玻璃器皿、用具和培養(yǎng)材料清洗；還需要有高壓水龍頭用于沖洗。1.2滅菌室需備有高壓蒸汽滅菌裝置、細菌過濾器、用于培養(yǎng)基及培養(yǎng)器械的滅菌,1.3配制室 需備有冰箱、化學(xué)實驗臺、藥品柜、器械柜、物品存放架以及各種玻璃器皿和用具，包括各種不同容積的容量瓶、燒杯、量筒、移液管、三角瓶、磨口瓶

14、、廣口瓶、各種類型培養(yǎng)瓶、玻璃棒、移液管架、試管刷、電爐、微波爐等。1.4無菌操作室(接種室) 無菌操作室在工作方便的前提下，宜小不宜大，宜精細密閉，忌粗陋放散，是植物組織培養(yǎng)研究或生產(chǎn)工作中最關(guān)鍵的部分，關(guān)系到培養(yǎng)物的污染率，接種工作效率等重要指標(biāo)。要求如下:(1)地面、天花板及四壁盡可能光潔、避免積染灰塵，易于采取各種清潔措施。 (2)干爽、安靜、清潔明亮，在適當(dāng)?shù)奈恢玫跹b紫外燈1-2盞，用以經(jīng)常照射滅菌，使室內(nèi)

15、保持良好的無菌、低密度有菌狀態(tài)。,(3)最好安置一小型空調(diào)機，使室內(nèi)溫度保持在26℃左右，這樣就可以在工作時或不工作時都把工作室的門窗緊閉，保持與外界相對隔絕的狀態(tài)，盡量減少與外界的空氣對流，減少塵埃與微生物侵入。 (4)經(jīng)常采用消毒措施，達到較高的無菌水平，以利完全操作提高工作的質(zhì)量與效率。 (5)無菌室外應(yīng)留有緩沖間，進入無菌室前在此更衣?lián)Q鞋洗手及處理外界采回準(zhǔn)備消毒培養(yǎng)的材料等。無菌操作室應(yīng)備有超凈工作臺或接種箱

16、、固定式載物臺、移動式載物臺、廣口瓶、酒精燈、紗布、器械支架、手術(shù)剪、解剖刀、解剖針、鑷子等。,1.5培養(yǎng)室應(yīng)盡量安排在樓層較高處，以利于采光，減少塵埃和雜菌污染的機會。此外應(yīng)考慮清潔、干燥，培養(yǎng)室保溫隔熱。培養(yǎng)室中距離窗戶較遠處的培養(yǎng)架應(yīng)適當(dāng)安裝人工輔助照明的日光燈。應(yīng)設(shè)計能有效通風(fēng)的窗戶、定期或需要時加強通風(fēng)散熱，如在室內(nèi)地板稍高處設(shè)置進風(fēng)氣窗，在氣窗的對側(cè)近天花板設(shè)置排風(fēng)窗，也可安裝小功率的排風(fēng)扇。室內(nèi)應(yīng)備有制冷設(shè)備、加熱設(shè)備

17、、控光設(shè)備、固定式培養(yǎng)架、旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)架、搖床等。,1.6鑒定室需備有高倍顯微鏡、倒置顯微鏡、相差顯微鏡、解剖鏡、恒溫箱、切片機、烤片臺、恒溫水浴、滴瓶、染色缸、載玻片、蓋玻片等。1.7馴化移植室 應(yīng)備有溫室、彌霧裝置、蔭棚、移植床、缽、盆、塑料布、草炭、蛭石、粗沙等，用于試管小植株的鍛煉和移植。,2、操作前的準(zhǔn)備工作接種室在接種前4-5 d必須通風(fēng)換氣。在接種前一天對接種室進行全面消毒，一般用40%福爾馬林進行全面噴霧，并

18、密閉24 h，然后打開換氣窗10-15 min.。 接種前1 h打開超凈工作臺和棚面的紫外燈照射30 min。 殺菌結(jié)束后，先關(guān)掉棚面的紫外燈，再打開風(fēng)機，最后關(guān)掉超凈工作臺上的紫外燈。在接種后體息時，要先打開臺面的紫外燈，再關(guān)風(fēng)機，最后打開棚面紫外燈。不能將風(fēng)機與臺面上的紫外燈同時關(guān)閉或先關(guān)閉風(fēng)機再開紫外燈。不可穿工作服離開接種室，接種期間兩邊的門切記要關(guān)閉。,3、準(zhǔn)備進臺進入接種室前，應(yīng)先將手表、手鐲、戒子、耳環(huán)等放在

19、室外，將手和手腕用肥皂洗凈后才能進入接種室，并用75%酒精紗布擦拭雙手、雙腕(此紗布置于超凈工作臺外燒杯內(nèi)，并適時注入酒精)之后換上消毒的工作服、帽子、口罩(蓋上鼻子和嘴、著裝時注意頭發(fā)不得置于帽子外，袖口用皮筋扎緊)，進入臺內(nèi)。 操作前用臺內(nèi)的酒精棉團擦拭手、手腕，再擦培養(yǎng)基和超凈工作臺，一般按如下順序擦拭培養(yǎng)瓶：瓶的棉塞、瓶身、瓶底，徹底擦拭后放入超凈工作臺。,,4、接種操作 4.1、剪、鑷消毒 每次取出時剪口

20、并攏，不可接觸磨口瓶和其它器皿，并保持尖端向下;剪、鑷分別在酒精燈外焰徹底灼燒，燒時將剪口鑷口張開，燒至剪、鑷上部，火焰熄滅后，插回磨口瓶,4.2、用上述消毒過的器械，將切割好的外植體插植到培養(yǎng)基表面上，具體操作是： (1)左手拿三角瓶，解開包頭紙，將三角瓶幾乎水平拿著，靠近酒精燈焰，將瓶口外部在燈焰上燎數(shù)秒鐘，使瓶口的水氣散發(fā)掉。 (2)右手小指和無名指配合手掌將棉塞在燈焰附近慢慢拔出，以免空氣速向瓶內(nèi)沖擊，引起瓶口灰塵

21、等沖入，造成污染。 (3)棉塞始終夾在右手兩手指之間，這時再將瓶口在燈焰上旋轉(zhuǎn)，使充分灼燒滅菌。 (4)用右手大、食、中指拿鑷子夾一塊外植體送入瓶內(nèi)輕輕的插入培養(yǎng)基中，鑷子灼燒后放回磨口瓶，再把棉塞在燈焰上灼燎數(shù)秒，灼燎時應(yīng)旋轉(zhuǎn)，避免燒壞，塞好棉塞，包上報紙，便完成了第一瓶的操作，接著再做第二瓶，如此直到外植體全部接完,無菌操作中必須遵守的事項：,（1）棉塞不能亂放。手拿的部分限于棉塞膨大的上半部分，塞入瓶口的那一段始終

22、懸空，并不要碰到其它任何物體；若是螺旋蓋或薄膜，則應(yīng)解下放置在滅過菌的臺面上，放置處應(yīng)隨時用酒精棉團涂抹滅菌。（2）操作人員的頭、胳膊等不得進入臺內(nèi)。 （3）操作人員不得隨意談話、說笑，以免造成污染。 （4）臺外人員走動要輕、動作要小。 （5）接種完畢后注意標(biāo)明接種材料名稱、日期、處理。,5、培養(yǎng)器材的清洗在細胞工程實驗中，離體細胞對任何毒性物質(zhì)都十分敏感。毒性物質(zhì)包括解體的微生物和細胞殘余物以及非營養(yǎng)的化學(xué)物質(zhì)

23、。某些化學(xué)物質(zhì)僅0.01μg/L就會對細胞產(chǎn)生毒性作用，因此對培養(yǎng)器皿的清洗是組織培養(yǎng)中一項極為重要的環(huán)節(jié)。5.1、玻璃器皿浸泡 初次使用和培養(yǎng)后的玻璃器皿都需用水浸泡。新用的玻璃器皿，常帶有許多干涸在上面的灰塵，同時又由于生產(chǎn)的原因，常呈堿性并帶有一些對細胞有毒性的物質(zhì)，如鉛和砷等。在使用前要經(jīng)稀鹽酸（5%）浸泡，中和其中的堿性物質(zhì)便于清洗。用過的玻璃器皿往往帶有大量蛋白質(zhì)附著，干涸后不易刷洗掉，故用后要立即用清水浸泡。,刷洗

24、 浸泡后的玻璃器皿一般仍然要用毛刷沾洗滌劑洗去玻璃器皿上的雜質(zhì)。刷洗次數(shù)太多，會損害器皿的表面光潔度，洗滌劑有使pH上升的趨勢，所以宜選用軟毛刷和優(yōu)質(zhì)的洗滌劑。禁用去污粉，因其含有沙粒，會嚴(yán)重破壞玻璃器皿的光潔。酸洗 刷洗不掉的極微量雜質(zhì)經(jīng)過洗液的強氧化作用可被除掉。洗液對玻璃器皿無腐蝕作用，去污十分有效，是清洗過程中最關(guān)鍵的一環(huán)。洗液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和水按一定比例配制而成，浸泡時，器皿要充滿洗液。常用的洗液配方見附表一。沖

25、洗 刷洗和洗液浸泡后都必須用水充分沖洗，不留任何殘跡，然后用蒸餾水漂洗2~3次，涼干備用。,,5.2 塑料器皿塑料器皿耐腐蝕能力強，但質(zhì)地較軟，且不耐熱，因此它和玻璃器皿清洗不同。通常的方法是：先用清水充分浸泡和沖洗；再用2%NaOH溶液浸泡過夜，自來水沖洗，然后用5%稀鹽酸浸泡30分鐘，再用自來水沖洗，最后用蒸餾水漂洗3次，晾干備用,5.3 濾器玻璃濾器與玻璃器皿清洗相同。無論是浸泡還是酸浸，都可用抽濾法。1） 

26、使用后，立即將清水注入濾器，抽氣過濾，反復(fù)抽濾5次。2）  干凈鉻硫酸洗液或熱濃硫酸注入濾器，抽氣過濾至酸液濾過完畢。3）  用清水再次抽濾10次。4）  蒸餾水抽氣過濾3次。蔡氏濾器使用后棄去石棉濾膜，金屬部分刷洗干凈，最后用蒸餾水漂洗2~3次，晾干備用。新購置的膠塞帶有大量滑石粉，先用自來水沖洗干凈，常規(guī)處理，每次用后的膠塞用水浸泡，然后用2%NaOH煮沸15min左右，自來水沖洗，再用1%稀

27、鹽酸浸泡30min，最后用自來水沖洗和蒸餾水漂洗，晾干后備用。,細胞與遺傳學(xué)實驗室安全、衛(wèi)生要求,一、為了實驗工作的正常進行，要樹立“安全第一”的思想，保證實驗室的絕對安全和所有工作的正常進行。二、嚴(yán)格遵守實驗操作規(guī)程和規(guī)章制度，履行安全防火措施，對沒有安全保證的實驗堅決禁止進行。嚴(yán)格執(zhí)行用火、用電制度，離開實驗室時一定要關(guān)好水、電、煤氣和門窗，確保安全。使用易燃易爆物品和氣體必須按照有關(guān)制度及規(guī)定執(zhí)行。,,三、使用儀器時，必須認(rèn)真按

28、照各儀器設(shè)備的操作守則進行操作，并及時記錄；使用后認(rèn)真管理，保持儀器內(nèi)外及存放儀器實驗室的清潔；儀器出現(xiàn)問題立刻向管理該設(shè)備的教師報告，并協(xié)助該設(shè)備的教師檢查造成儀器損害的原因，及時維修。不按照儀器設(shè)備的操作守則操作造成的損害應(yīng)按照《儀器設(shè)備、器材損壞丟失賠償?shù)墓芾磙k法》進行賠償。保證儀器設(shè)備的正常運行；不可擅自將儀器借出或搬到其它實驗室。,,四、做好物品（藥品、設(shè)備和玻璃器皿等實驗室固定資產(chǎn)）領(lǐng)用登記記錄，嚴(yán)禁浪費各種藥品、耗材，不得

29、帶出實驗室挪作他用，對于玻璃器皿、離心管、移液槍頭等物品不得隨意拿到其他實驗室，如實驗必須將這些物品借出，必須向負(fù)責(zé)管理該物品的實驗室管理教師登記借用；實驗材料、貴重藥品等要妥善保管，丟失將按原價賠償，試驗成果材料學(xué)生不經(jīng)擁有該成果的教師同意，不得使用，更不能帶出實驗室。,,五、禁止在實驗室內(nèi)吸煙、吃零食或利用實驗室設(shè)備（如電爐、微波爐等）烹調(diào)食物。每次實驗值日的同學(xué)一定要認(rèn)真打掃實驗室衛(wèi)生，擺放好實驗物品，保持室內(nèi)衛(wèi)生清潔，杜絕其他事

30、故的發(fā)生。,實驗一 培養(yǎng)基母液的制備,一、實驗?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)和掌握培養(yǎng)基母液的配制方法。在配制培養(yǎng)基前，為了使用方便和用量準(zhǔn)確，常常將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質(zhì)、激素類分別配制成比培養(yǎng)基配方需要量大若干倍的母液。當(dāng)配制培養(yǎng)基時，只需要按預(yù)先計算好的量吸取母液即可。,二、實驗器材 電光分析天平（感量為0.0001g）、扭力天平（感量為0.01g）、臺秤（感量0.5g）、燒杯（500ml、100ml、50ml）、容量瓶（

31、1000ml、100 ml、50 ml、25 ml）、細口瓶（1000 ml、100 ml、50 ml、25 ml）、藥勺、玻璃棒、電爐。三、實驗藥品NH4NO3、 KNO3 、CaCl2·2H2O 、 MgSO4·7H2O、KH2PO4 、 KI 、 H3BO3 、 MnSO4·4H2O、 ZnSO4·7H2O

32、、 Na2MoO4·2H2O 、CuSO4·5H2O 、CoCl2·6H2O 、FeSO4·7H2O、Na2-EDTA·2H2O 、肌醇 、煙酸 、 鹽酸吡哆醇(維生素B6)  、鹽酸硫胺素(維生素B1) 、甘氨酸 。,,四、實驗步驟1、大量元素母液的配制各成分按照培養(yǎng)基成分表濃度含量

33、擴大10倍，用感量為0.01g的扭力天平稱取，用蒸餾水分別溶解，按順序逐步混合。后用蒸餾水定容到1000ml的容量瓶中，即為10倍的大量元素母液。倒入細口瓶，貼好標(biāo)簽保存于冰箱中。配制培養(yǎng)基時，每配1L培養(yǎng)基取此液100ml。,表1 MS培養(yǎng)基大量元素母液制備,注意：(1) 配制大量元素母液時，某些無機成分如Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，母液配制時要用純度高的重

34、蒸餾水溶解，藥品采用等級較高的分析純，各種化學(xué)藥品必須先以少量重蒸餾水使其充分溶解后才能混合，混合時應(yīng)注意先后順序。特別應(yīng)將Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等離子錯開混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。(2)CaCl2·2H2O要在最后單獨加入，在溶解CaCl2·2H2O時，蒸餾水需加熱沸騰，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸騰，操作時要防止其溢出。,,２、微量元

35、素母液的配制MS培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機鹽由7種化合物（除Fe）組成。微量元素用量較少，特別是 CuSO4·5H2O、 CoCl2·6H2O ，因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表2，表3配方，用感量為0.0001g的電光分析天平稱量，其它同大量元素。配制培養(yǎng)基時，每配制1L培養(yǎng)基，取微量Ⅰ10ml，微量Ⅱ１ml,表2 MS培養(yǎng)基微量Ⅰ的配制,3、鐵鹽母液的配制鐵鹽不是都需要單獨配

36、成母液，如檸檬酸鐵，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨配成母液。這種螯合物使用起來方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)生沉淀。配制方法同上，直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。配制培養(yǎng)基時，配制1L取此液10ml。,表4 MS鐵鹽母液的配制,,注意：在配制鐵鹽時，如果加熱攪拌時間過短，會造成Fe S 04和Na2EDTA鰲合不徹底，此時若將其冷藏，F(xiàn)e S 04會結(jié)晶析出。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，配制鐵

37、鹽母液時，F(xiàn)e S 04和Na2EDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合，并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色(約加熱20 - 30 min)，調(diào)pH值至5 .5，室溫放置冷卻后，再冷藏。,4、有機母液的配制MS培養(yǎng)基的有機成分有甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆素。培養(yǎng)基中的有機成分原則上應(yīng)分別單獨配制。配制直接用蒸餾水溶解，注意稱量時用電子分析天平。注意：由于維生素母液營養(yǎng)豐富，因此貯藏時極易染菌。被菌類污染的維生素母液，有效濃

38、度降低，并且易給后期培養(yǎng)造成傷害，不宜再用。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是:配制母液時用無菌重蒸餾水溶解維生素，并貯存在棕色無菌瓶中，或縮短貯藏時間。,表5 MS培養(yǎng)基有機物質(zhì)母液的制備,5、 激素母液配制植物組織培養(yǎng)中使用的激素種類及含量需要根據(jù)不同的研究目的而定。一般激素母液的配制的終濃度以0.5mg/ml為好，需要注意的是：（１）配制生長素類，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇充分溶解，或者用1

39、mol/L的NaOH溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。（２）細胞分裂素，例如KT，應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇加3~4滴1mol/L的鹽酸溶解，再用蒸餾水定容。（３）配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。注意：所有的母液都應(yīng)保存在0~4℃冰箱中，若母液出現(xiàn)沉淀或霉團則不能繼續(xù)使用。,五、思考題：1、  配制母液時為什么要按順序加入各藥品？溶解CaCl2·2H2O時，為什么要將蒸餾水加熱？2、 

40、 根據(jù)所給母液濃度、蔗糖、瓊脂用量、pH值，按給出的培養(yǎng)基配方計算各種母液吸取量，填入下表。,表6 按上述配方計算各種母液吸取量并填入下表,培養(yǎng)基配方：MS +BA2.0 （mg／Ｌ） +NAA0.2 （mg／Ｌ） +蔗糖3%+瓊脂0.6%，pH5.8,實驗二 培養(yǎng)基的配制與滅菌,一、實驗?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)培養(yǎng)基配制與滅菌的操作方法。　　對植物外植體進行離體培養(yǎng)時，要依靠培養(yǎng)基提供生長所需的營養(yǎng)成分。不同材料對培養(yǎng)基的要求不同，適

41、當(dāng)?shù)脑O(shè)計和選用培養(yǎng)基，對植物組織培養(yǎng)取得成功至關(guān)重要的。另外，對組織培養(yǎng)物的脫分化和再分化等狀態(tài)的調(diào)控，次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)等都是通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分來實現(xiàn)的。培養(yǎng)基的主要成分包括無機營養(yǎng)物質(zhì)、碳源、有機物質(zhì)、植物生 長激素,,二、實驗器材天平、燒杯（1000ml）、醫(yī)用瓷缸（1000 ml）、三角瓶、量筒（100ml）、移液管、玻璃棒、pH試紙、吸耳球、線繩、封口膜、石棉網(wǎng)。超凈工作臺、鑷子、解剖刀、酒精燈、脫脂棉、燒杯、廣口瓶、培養(yǎng)皿

42、 三、實驗藥品蔗糖、瓊脂、1mol/L NaOH、HCl、各種培養(yǎng)基母液。配方：MS+BA0.5 （mg／Ｌ） +NAA0.5 （mg／Ｌ） +蔗糖3%+瓊脂0.6%，pH5.8,,四、實驗步驟（一）培養(yǎng)基配制（以1L MS培養(yǎng)基為例）1、計量 根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計算需要吸取母液的量，計算公式：吸取量 ml=培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量（mg/L）×1000ml/母液濃度（mg/L）。2、移液取醫(yī)用瓷缸一只

43、，按照計算吸取母液的量依次吸取各母液置于醫(yī)用瓷量杯中備用。,注意：①在使用提前配制的母液時，應(yīng)在量取各種母液之前，輕輕搖動盛放母液的瓶子，如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應(yīng)立即淘汰這種母液，重新進行配制。②用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次。③量取母液時，最好將各種母液按將要量取的順序?qū)懺诩埳希咳?種，劃掉1種，以免出錯；④移液管不能混用。3、稱取稱?。秅瓊脂，30g蔗糖備

44、用,,4、融化用搪瓷量杯量取600～700ml的蒸餾水放在電爐上，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下，加入蔗糖。注意：在加熱瓊脂、制備培養(yǎng)基的過程中，操作者千萬不能離開，否則沸騰的瓊脂外溢，就需要重新稱量、制備。此外，如果沒有搪瓷量杯，可用大燒杯代替。但要注意大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。,5、混合將融化的瓊脂和母液充分混合，用蒸餾水定容到1000ml，來回混合幾

45、次。6、調(diào)pH用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時用精密的pH試紙(5.4～7.0)測培養(yǎng)基的pH，一直到培養(yǎng)基的pH達到要求為止(在調(diào)制時要比目標(biāo)pH值偏高0.2～0.5個單位，因為培養(yǎng)基在滅菌過程中由于糖等物質(zhì)的降解，pH值會下降0.2～0.5個單位左右)。注意：調(diào)至?xí)r要用玻璃棒不停的攪拌,使其充分混合。,7、分裝溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。分裝時，先將培養(yǎng)

46、基倒入燒杯中，然后將燒杯中的培養(yǎng)基倒入錐形瓶(50 ml或100 ml)中。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/5～1/4。每1L培養(yǎng)基，可分裝25～30瓶。8、包扎用封口膜封口，外邊可加一層牛皮紙，扎好繩子，用鉛筆或碳素墨水筆在牛皮紙上寫上培養(yǎng)基的代號。注意：培養(yǎng)基中的部分成分在高溫滅菌時易發(fā)生化學(xué)變化，致使培養(yǎng)基pH值降低，從而使瓊脂凝固力下降，發(fā)生培養(yǎng)基滅菌前凝固，滅菌后不凝固現(xiàn)象。避免

47、此現(xiàn)象發(fā)生的方法是:調(diào)整培養(yǎng)基pH值，一般不低于5.6，若需酸性較強培養(yǎng)基，可適當(dāng)增加瓊脂用量。,,（二）培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基中含有大量的有機物質(zhì)，特別含糖量較高，是各種微生物滋生、繁殖的好場所。而接種材料需要在無菌條件下培養(yǎng)很長時間，如果培養(yǎng)基被污染，則達不到培養(yǎng)的預(yù)期結(jié)果。因此，培養(yǎng)基的滅菌，是植物組織培養(yǎng)中十分重要的環(huán)節(jié)。常用的滅菌方法是高壓滅菌和過濾除菌。,1、高壓蒸汽滅菌法把分裝好的培養(yǎng)基及所需滅菌的各種器具、蒸餾水等，放入

48、高壓蒸汽滅菌鍋的消毒桶中，外層鍋內(nèi)加水，水位高度不超過支架高度。蓋好鍋蓋，上好螺絲，注意上螺絲要對角線上。加熱后，鍋上壓力表指針開始移動，當(dāng)指針移至0.5kg/cm2時，扭開放氣閥排除冷空氣，使壓力表指針回復(fù)零位。當(dāng)指針移至1.1～1.2kg/cm2時，即121℃時，維持20min的時間。由于容器的體積不同，瓶壁的厚度不同，所以滅菌的時間也要適當(dāng)考慮，具體可以參考表1。滅菌后要趁熱取出三角瓶，不可久不放汽，讓壓力鍋自行冷卻，這樣易將棉塞

49、等悶得太濕，引起后來長霉污染。培養(yǎng)基自然冷卻凝固。放置1 d后再使用。,表1 培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所必須的最少時間,,注意：（1）鍋內(nèi)冷空氣必須排盡，否則壓力表指針雖達到一定壓力，但由于鍋內(nèi)冷空氣的存在事實上達不到應(yīng)有的溫度，因而影響滅菌效果。當(dāng)達到一定壓力后，注意在保持壓力過程中，嚴(yán)格遵守滅菌時間，時間過長會使一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞，影響培養(yǎng)基成分，時間短則達不到滅菌效果。對蒸餾水，各種器具滅菌時，滅菌時間要適當(dāng)延長，壓力也要提高，

50、一般在126℃維持一個小時。另外三角瓶中的液體不超過總體積的70%，否則當(dāng)溫度超過100℃時，培養(yǎng)基會噴溢，造成培養(yǎng)瓶壁和封口膜的污染。,,（2）消毒后的培養(yǎng)基不能立即用于接種，而應(yīng)放置24-72h。放置后如果培養(yǎng)基中沒有出現(xiàn)菌落，則說明培養(yǎng)基是無菌的，才可以用于接種。另外做好的培養(yǎng)基一般應(yīng)在1-2周內(nèi)用完，短時間可存放于室溫條件，如不能盡快用完，應(yīng)放在4℃條件下。,2、過濾除菌培養(yǎng)基中某些成分是熱不穩(wěn)定的，在高溫濕熱滅菌中可能會降解

51、。這類物質(zhì)需要進行過濾滅菌。例如一些生長因子，如赤霉素(GA)、玉米素、脫落酸、尿素和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。先將除去了不耐熱物質(zhì)的培養(yǎng)基其它成分經(jīng)高壓滅菌后置于超凈工作臺上冷卻至40℃,再將過濾滅菌后的該化合物按計劃用量依次加入,搖勻,凝固后即可使用。如果是液體培養(yǎng)基，沒有凝固這個問題，則可在冷卻到室溫后再加入。,按上述配方計算各種母液吸取量并填入下表,培養(yǎng)基配方：0、1/2 MS+NAA0.

52、5+6-BA0.1+蔗糖3%+瓊脂0.６%，pH5.8 1、 MS+NAA0.2+6-BA0.2+蔗糖3%+瓊脂0.６%，pH5.82、 MS+NAA0.5+6-BA0.5+蔗糖3%+瓊脂0.６%，pH5.83、 MS+NAA0.2+6-BA1.2+蔗糖3%+瓊脂0.６%，pH5.84、MS+NAA0.5+6-BA0.2+蔗糖3%+瓊脂0.６%，pH5.85、 MS+NAA0.5+6-BA0.5+蔗糖3%+瓊脂0.６%，pH5

53、.86、 MS+NAA0.5+6-BA1.2+蔗糖3%+瓊脂0.６%，pH5.87、 MS+6-BA0.2+蔗糖3%+瓊脂0.６%，pH5.88、MS+6-BA0.5+蔗糖3%+瓊脂0.６%，pH5.89、 MS+6-BA1.2+蔗糖3%+瓊脂0.６%，pH5.8,實驗三、無菌操作與培養(yǎng)材料接種,實驗?zāi)康呐c意義　　學(xué)習(xí)無菌操作方法。培養(yǎng)材料的接種是組織培養(yǎng)過程中一個重要的環(huán)節(jié)。通過本實驗，領(lǐng)會無菌培養(yǎng)對接種的要求，初步掌握培

54、養(yǎng)材料接種的操作技術(shù),實驗步驟,（1）準(zhǔn)備好培養(yǎng)基，無菌水，培養(yǎng)皿及接種工具。（2）將培養(yǎng)基、無菌水、接種工具置于接種臺上，打開超凈臺紫外燈開關(guān)，同時打開接種室內(nèi)的紫外燈，用紫外燈照射至少25分鐘，然后關(guān)室內(nèi)的紫外燈，開送風(fēng)開關(guān)，關(guān)閉臺內(nèi)的紫外燈，通風(fēng)十分鐘后，再開日光燈進行無菌操作。（3）接種前用肥皂洗手，特別是將手指洗凈，然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次。,(4) 將待接種的植物材料取回實驗室，用自來水沖洗干凈，切成段，每

55、段長約5cm，（以下在超凈臺上進行）于燒杯中先用75%酒精浸泡30-60秒,之后用20%的84消毒液浸泡10-20分鐘，取出用無菌水洗3─4次，每次3-5分鐘，置于無菌培養(yǎng)皿中，在超凈工作臺上按無菌操作要求操作（超凈工作臺事先開啟，用紫外燈滅菌30分鐘，人進入前一定要關(guān)閉紫外燈），用解剖刀橫切成5mm的片狀（棄去兩端），用槍狀鑷子將它接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，注意薄片的切口朝向培養(yǎng)基，每瓶接種4-6片，接種后蓋好瓶蓋。,,（5）解除三角瓶上捆

56、扎的線繩，有必要的話可以用沾有75%的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培養(yǎng)基處理整齊排列在接種臺左側(cè)，然后用75%酒精擦洗接種臺表面。（6）接種用的鑷子使用前插入95%的乙醇溶液中，使用鑷子時在酒精燈上燒片刻，冷卻后待用。也可以插入培養(yǎng)基邊緣促使其冷卻。（7）在酒精燈火焰旁揭去封口膜，將瓶口傾斜接近水平方向，用火焰灼燒瓶口，灼燒時應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動瓶口（靠手腕的動作，使試管口沾染的少量菌得以燒死），左手持瓶，使其靠近火焰，右手將燒過

57、的鑷子觸動培養(yǎng)基部分，使其冷卻，夾取外植體，將其放在培養(yǎng)基上，用鑷子輕輕按一下，使其部分浸入培養(yǎng)基。每瓶可放4-6個外植體。,（8）轉(zhuǎn)動瓶口灼燒，將封口膜從酒精燈火焰上過一下，蓋上封口膜，扎好繩子，標(biāo)上接種日期、材料名稱、姓名等。(9)將已接入植物組織（外植體）的培養(yǎng)瓶，放在25℃、無光的培養(yǎng)室培養(yǎng)，每7d檢查、觀察、記載1次，剔除材料已被雜菌污染的三角燒瓶。注意工作臺接種時，應(yīng)盡量避免做明顯擾亂氣流的動作（比如說、笑、打噴嚏）

58、，以免影響氣流，造成污染。另外操作過程中要不時用75%的酒精擦拭雙手。接種前培養(yǎng)基出現(xiàn)大量污染現(xiàn)象,若菌類只存在于培養(yǎng)基表面，且主要是真菌時，可能是因培養(yǎng)瓶密封不嚴(yán)或放置培養(yǎng)基的環(huán)境不潔凈，菌類種群密度過大所致。若菌類存在于培養(yǎng)基內(nèi)部，則可能是由使用污染的貯藏母液引起。另外培養(yǎng)瓶不潔凈，滅菌不徹底也是導(dǎo)致接種前培養(yǎng)基污染的原因。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是:保持環(huán)境潔凈，杜絕使用污染的母液，嚴(yán)格高壓蒸汽滅菌程序，保證滅菌時間。,,接種后培養(yǎng)

59、基出現(xiàn)大面積污染、菌落分布不勻,此種情況主要是接種過程中發(fā)生的污染所致。可能是接種室不潔凈、菌類孢子過多、鑷子帶菌、操作人員手未徹底消毒、操作人員呼吸及超凈工作臺出現(xiàn)故障等原因引起。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是:保持無菌接種室潔凈，并定期用甲醛等熏蒸滅菌；在接種前無菌室用紫外燈滅菌時間不低于20-30 min；用75%酒精噴霧殺菌降塵，超凈臺開啟15-20 min后方可使用；鑷子等接種工具嚴(yán)格徹底滅菌，且接種時使用1次滅菌1次；操作過程中經(jīng)常