抗偽狂犬病毒單克隆抗體的制備及gB基因編碼蛋白抗原表位的表達(dá).pdf

1、豬偽狂犬病( Pseudorabies, PR)是由豬偽狂犬病病毒( Pseudorabies virus, PRV)引起的一種高度接觸性、急性傳染病。PRV屬皰疹病毒科（Herpesviridae）α皰疹病毒亞科，我國1948年首次報道貓的偽狂犬病，根據(jù)2006年夏的統(tǒng)計結(jié)果， PR流行范圍已擴(kuò)大到31個省、市(區(qū))，包括香港和臺灣在內(nèi)，對我國的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，建立有效的診斷檢測方法對控制和消滅 PR具有重要的意義。

2、本研究篩選出分泌抗 PRV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株;利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了PRVgB基因主要抗原區(qū)蛋白。
　　1、PRV雜交瘤細(xì)胞株的篩選及單抗制備：
　　將偽狂犬病毒Batha株接種于BHK-21細(xì)胞，病毒增殖后，將細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融三次后，收集病毒，利用差速離心法和蔗糖密度梯度離心法分離純化病毒，利用純化的偽狂犬病毒免疫BALB/c小鼠，經(jīng)三免后，取合格小鼠的脾臟細(xì)胞與 NS0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，利用 ELISA和免疫組

3、化方法篩選雜交瘤細(xì)胞，采用有限稀釋法對其進(jìn)行亞克隆，最終獲得2株穩(wěn)定分泌抗豬偽狂犬病毒的雜交瘤細(xì)胞株，即2B2-C1和3F1-A1。特異性實驗結(jié)果表明：2B2-C1和3F1-A1不與豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒以及正常 BHK-21細(xì)胞反應(yīng)，特異性良好。兩株P(guān)RV單抗的獲得，為進(jìn)一步建立特異、敏感、準(zhǔn)確快速的PRV檢測方法打下了基礎(chǔ)。
　　2、PRV gB基因主要抗原區(qū)的克隆及原核表達(dá)：
　　依據(jù)Genban

4、k發(fā)表的PRV gB基因序列，設(shè)計一對特異引物，通過PCR方法擴(kuò)增出 PRV gB基因片段（264bp），并將其克隆于 pET-28a表達(dá)載體，構(gòu)建后的表達(dá)質(zhì)粒命名為 pET-28a-gB，將 pET-28a-gB轉(zhuǎn)入 BL21工程菌，通過IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting分析，結(jié)果表明，gB基因片段在BL21工程菌中得到了高效表達(dá)，表達(dá)蛋白條帶大小約為16 kDa，該表達(dá)蛋白能夠被PRV陽性血清識