動物組織胚胎學

1、組織學與胚胎學http://jpkc.njau.edu.cn/aniembryo/kchzy3.asp,組織學 Histology胚胎學 Embryology,,組織胚胎學的兩端：組織學之細胞學，cytology，現(xiàn)在發(fā)展成細胞生物學。胚胎學，現(xiàn)在發(fā)展成發(fā)育生物學。都是前沿學科。,課程安排,細胞 cell ------細胞學 cytology組織 tissue ------基本組織學 器官 organ ------器官組

2、織學胚胎學,組織學histology,主要方法固定組織研究活組織研究觀察手段光學顯微鏡電子顯微鏡,光學顯微鏡石蠟切片法,石蠟切片：paraffin section固定fix切片section染色dye固定：將組織用化學試劑浸泡，使組織內蛋白質等成分凝固或沉淀。染色：組織中某些成分與染料化學結合或物理吸附而顯色。,,,,,,,,,,,,,固定到切片（常用）,固定脫水-梯度乙醇透明-二甲苯透蠟-石蠟包埋（

3、73;­­蠟塊）切片（5μm）,,切片到觀察（常用）,脫蠟-二甲苯入水-梯度乙醇蘇木精染色梯度乙醇到95%伊紅染色脫水透明封片觀察,HE染色,用蘇木精與伊紅染色，是最常用的組織學，病理學染色方法。H：蘇木精,Hematoxylin堿性，藍色 E：伊紅eosin酸性，紅色嗜堿性:染成藍色,如:細胞核（核酸，酸性）嗜酸性:染成紅色,如細胞質 （堿性蛋白），,HE染色的腎小管紅色為嗜酸性的胞漿

4、，藍色為嗜堿性的核,冰凍切片,1冰凍（常用液氮）2切片優(yōu)點：保存酶活性，抗原保存好，免疫組化應用較多。缺點：形態(tài)不如石蠟切片。要求有冰凍切片機。,其他光鏡可用制片方法：,簡單，實用，不需要特殊設備，有時候必須用涂片（血液，體液）觸片撕片裝片、磨片。,光學顯微鏡的結構,機械系統(tǒng)光學系統(tǒng)目鏡（10x,5x,16x）物鏡 （4x,10x,20x,40x,60x,100x)聚光器光源,物鏡,最重要，最貴的部位。

5、物鏡上數(shù)字，以40倍為例：40/0.65，放大倍數(shù)，鏡口率（數(shù)值孔徑，N.A)160/0.17機械管長，允許蓋玻片厚度。,分辨率的問題,分辨率（Resolving power）又稱分辨本領，是用來表示人眼或儀器能夠區(qū)分開的被觀察物體上兩點間的最小距離。所能分辨的兩點間距離越小，見到的細節(jié)就越多，分辨率就越高。 人眼在25cm明視距離分辨率為0.2mm，光鏡分辨率為0.2μm，電鏡的分辨率比光鏡的分辨率大約提高1000X。

6、,D=0.61λ/(N*sin(α/2)),α：為入射孔徑角，即光線從樣品進入透鏡的張角：α450nm,N：折光率，空氣 N=1,香柏油（N=1.5),光鏡最大分辨率，D最小值0.2μm,光學顯微鏡種類,普通光鏡（明視野）。暗視野（dark field）顯微鏡。相差顯微鏡。熒光顯微鏡。激光共焦掃描顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscopy）微分干涉顯微鏡（differential-inte

7、rference microscope）,明視野效果，無標本處最亮,暗視野效果，無標本處最暗，（花粉管）,相差效果，可以觀察透明（不染色）標本。用于觀察活細胞,熒光效果，用各種不同的熒光染料,萬能顯微鏡，其實是將幾種功能通過配件集中在一臺顯微鏡上,倒置顯微鏡，其實是將標本置于物鏡上方，細胞培養(yǎng)常用,顯微攝影，現(xiàn)在更多利用了數(shù)碼相機,電子顯微鏡,透射電鏡TEM(transmission electron microscope)電子束

8、代替光線，波長短，電磁透鏡代替光學透鏡。超薄切片，重金屬染色（鉛，鈾鹽），吸收電子。,,,,光學顯微鏡下結構,,,電子顯微鏡下結構,,,,,,,,,,透射電子顯微鏡。分辨率1.44埃，放大倍率80萬倍,超薄切片制作過程,電鏡與光鏡的比較,,電鏡與光鏡光路圖比較,,掃描電鏡(scanning electron microscope),掃描電鏡下的結構,切片上還可以做：,組織化學免疫組織化學原位雜交放射自顯影,組織化學（切片上的

9、化學反應）,PAS反應顯示多糖perioldic acid shiff reaction切片上多糖＋HIO4（氧化）→多醛；多醛＋無色品紅（shiff試劑）→紫紅色沉淀（顯示多糖存在）,PAS反應,紫紅色沉淀（顯示多糖存在）,其他一些特殊染色：胭脂紅染色,粘液染色,類淀粉染色,含鐵血黃素,銀染，黑色為銀顆粒位置,免疫組織化學：immunohistochemistry,利用抗原抗體特異性結合而顯示抗原存在。利用標記技術，如將熒光素（

10、酶）與抗體結合（鑰匙），如果切片上某個部位有抗原（鎖），當抗原抗體結合后，洗去多余抗體，熒光顯示部位即是抗原（某種蛋白）部位。,,,,,細胞漿彌漫性陽性反應（細胞角蛋白,CK）DAB顯色，甲基藍復染。,原位雜交in situ hybridization,利用核酸堿基互補的特性。原理跟免疫組化類似。實驗要求更高。,CGAT,堿基互補原理,Hela細胞（左）、CHO細胞（右）的培養(yǎng),細胞培養(yǎng),計量單位,組織學常用的計量單位：10

11、-3， m 毫10-6， μ微10-9，n納 (埃,10-10 m10-12，p皮如μm(微米），1／1000mm。光鏡常用，如細胞大小nm（納米），1/1000 μm。電鏡常用，如細胞膜厚度,放大倍數(shù)問題,粗略的估算：物鏡放大*目鏡放大。如40*10問題如洗出照片時，如上是否放大倍數(shù)就是400。,,參照物的使用。,切面方向與立體結構,橫切、縱切?？紤]雞蛋的幾個切面,,考慮其他可能的切面。掌握切面對于我們了解器