血培養(yǎng)vs分子生物學(xué)解析

1、2024/2/4,血培養(yǎng),VS,分子生物學(xué),血流感染快速分子診斷,分子診斷不受抗菌藥物使用的影響血培養(yǎng)陽性后分子診斷直接使用血標(biāo)本進(jìn)行分子診斷快速但不能提供藥敏結(jié)果,血培養(yǎng)陽性瓶分子鑒定,Antigone Kotsaki, et al. Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209,陽性血培養(yǎng)－基于PCR的檢測,PCR特異性檢測病原特異性PCR特定耐藥基因檢測：葡萄球菌mecA, 腸球菌van

2、細(xì)菌載量：肺炎鏈球菌自溶毒A基因lytA拷貝數(shù)廣譜檢測：PCR擴(kuò)增特定靶位多態(tài)性分析測序后續(xù)基因檢測種特異性real-time PCR,Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis. 2011, 24(2):137,qPCR鑒定血培養(yǎng)陽性瓶中銅綠假單胞菌,5,Target：ecfX gene血培養(yǎng)系統(tǒng)：BacT/ALERT，

3、87瓶FA、13瓶FN，涂片均顯示G-b對照方法：氧化酶，API 20EDNA提?。?.5ml肉湯，離心后加裂解液，水煮法定量PCR：擴(kuò)增：Oligonucleotide primers基因特異性檢測：fluorescent-labeled hybridization probes，152bp fragment,Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,qPCR鑒定血培養(yǎng)陽性瓶中銅綠

4、假單胞菌,6,33瓶pae，敏感性和特異性均為100%1瓶kpn+pae，由于pae (20CFU/ml)≤kpn (108CFU/ml)，PCR(-)檢測限：將ATCC27853 ecfX基因克隆至TOP10 E.coli,Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,,陽性血培養(yǎng)－基于PCR的檢測,最常見病原體多重PCR電泳譜、ELISA雜交、多重Real-time PCRHyplex

5、 BloodScreen (BAG, Lich, Germany): 多重PCR+ELISA, 4.5-6h完成Prove-It Sepsis (Mobidiag, Helsinki, Finland)：多重real-time PCR+微陣列分析，檢測多種病原及mecA，3h完成多重Real-time PCR,Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209.,血培養(yǎng)陽性－多重real-time PCR

6、,NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013,血培養(yǎng)陽性－多重real-time PCR,NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013,血培養(yǎng)陽性－PNA FISH核酸熒光原位雜交,10,血培養(yǎng)陽性肉湯　　革蘭染色　　PNA FISH,革蘭陰性菌：商品化試劑盒eco/kpn/paeEfa/其它腸球Sau/scnCal/cgl/其它念珠菌報(bào)道Salmonella spp.

7、90min PNA FISH完成,,Appl Environ Microbiol. 2010 ;76:4476 J. Clin. Microbiol. 2013, 51(4):1301J Clin Microbiol. 2009; 47: 247,MALDI-TOF MS,基質(zhì)輔助激光解析電離（MALDI）原理：將樣品分散在基質(zhì)分子中形成結(jié)晶后直接進(jìn)樣，當(dāng)用激光照射結(jié)晶時，基質(zhì)吸收了激光的大部分能量，使基質(zhì)分子和樣品獲得能

8、量投射到氣相并得到電離，成為帶電荷的離子?；|(zhì)在樣品離子形成過程中起到了質(zhì)子化或去質(zhì)子化的作用，使樣品帶上正電荷或負(fù)電荷，成為帶電荷的離子基質(zhì)會干擾被檢測分子質(zhì)譜峰的大小和濃度；不同類型的分析物選擇不同的基質(zhì),MALDI-TOF MS,飛行時間（TOF）原理：離子源產(chǎn)生的離子在加速電場獲得動能，當(dāng)進(jìn)入高真空無電場飛行管道并在此管道內(nèi)飛行時，質(zhì)量較輕的離子飛行速度快，早到達(dá)檢測器；質(zhì)量較重的離子飛行速度慢，晚到達(dá)檢測器。因此依據(jù)離子

9、的飛行時間與其質(zhì)荷比平方根（m/z）成正比的關(guān)系，通過測定飛行時間，計(jì)算出相應(yīng)離子的分子量。,MALDI-TOF MS操作步驟,MALDI-TOF MS快速鑒定陽性血培養(yǎng),14,使用菌落、陽性血培養(yǎng)肉湯鑒定快速：20分鐘(從報(bào)警到鑒定出結(jié)果）MALDI-TOF MS(Bruker)+BACTEC(BD):正確鑒定：193/213陰性菌（包括厭氧菌）(90.61%)，284/319陽性菌(89.02%)80.9%復(fù)數(shù)菌正確鑒定出一

10、種，7株緩癥鏈球菌鑒定為spnMALDI-TOF MS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMérieux):388個陽性瓶，種正確率91%（包括念珠、厭氧菌）15瓶復(fù)數(shù)菌：使用通用庫多鑒定出一種，革蘭染色后使用陰性或陽性庫分析，6瓶鑒定出第二種菌,Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1631　J Clin Microbiol 2010; 48: 1542,MALDI-TOF MS,1

11、5,VITEK MS(bioMérieux)以16s為金標(biāo)準(zhǔn)，980株臨床分離株，ID正確率腸桿菌科97.7%非發(fā)酵菌92%葡萄球菌屬94.3%鏈球菌屬84.8%HACEK84%酵母菌85.2%,J Clin Microbiol. 2010; 48: 900,PCR/ESI MS,廣譜PCR－ESI MS（電噴射質(zhì)譜）189陽性血培養(yǎng)和45陰性血培養(yǎng)，一致率98.7%6例spn標(biāo)本方法陰性提供定量結(jié)果－－

12、評估病原體載量假陰性率24%：幾乎均由混合感染導(dǎo)致5-6h完成檢測結(jié)合PCR的敏感性和ESI MS特異性可以直接檢測標(biāo)本，不需要培養(yǎng),Proc Natl Acad Sci. 2005;102:8012,血標(biāo)本分子檢測,種特異性、屬特異性、廣譜、多重PCR、微陣列分析血培養(yǎng)陰性的苛養(yǎng)菌，如Bartonella spp.巴爾通體, Coxiella burnetii伯氏考克斯體, Mycoplasma spp.支原體, Chlam

13、ydia spp.衣原體, Ricketssia spp.立克次體，Tropheryma whipplei,商品化分子生物學(xué)檢測方法:血標(biāo)本,18,SeptiFast®(Roche)：multiplex real-time PCR，種屬特異性熒光探針，檢測重要血流感染致病菌SepsiTestTM® (Molzym)：eubacterial and panfungal real-time PCR， a 16S and

14、 18S rRNA gene-based universal PCR+ sequencing，幾乎可以鑒定所有細(xì)菌、真菌VYOO® (SIRS Lab)：multiplex PCR，檢測重要血流感染菌，電泳分離擴(kuò)增片段Plex-ID® (Abbott)：eubacterial and panfungal PCR+質(zhì)譜，幾乎可以鑒定所有細(xì)菌、真菌,Intensive Care Med. 2011 May, publ

15、ish online.,SeptiFast test檢測的病原譜,BMJ Open 2012;2:e000392Intensive Care Med (2010) 36:49–56,SeptiFast test評估,Intensive Care Med (2010) 36:49–56,,,SeptiFast與PCT、CRP相關(guān)性,Langenbecks Arch Surg (2012) 397:447–455,VYOO®檢測

16、能力評估,PLoS ONE. 2012,7 : e38916,Sepsis,非感染SIRS,血培養(yǎng)陽性,血培養(yǎng)陰性，其它標(biāo)本培養(yǎng)陽性,Sepsis,所有培養(yǎng)陰性,VYOO®,與微生物學(xué)一致性為46.2%仍需改進(jìn),PLoS ONE. 2012,7 : e38916,3種商品化PCR檢測系統(tǒng)比對,Med Klin Intensivmed Notfmed 2013,3種商品化PCR檢測系統(tǒng)比對,Med Klin Intensivm

17、ed Notfmed 2013,分子生物檢測血標(biāo)本,26,幾乎所有與血培養(yǎng)對照的研究，都顯示更高的敏感性，但并非所有血培養(yǎng)陽性菌一定能檢測出來不可替代血培養(yǎng)！相較于血培養(yǎng)，其高敏感性可以更早地開始抗菌治療，或改變治療方案污染導(dǎo)致的假陽性無法排除！評估血培養(yǎng)陰性的PCR陽性結(jié)果分析其它微生物檢查結(jié)果（如BALF，傷口拭子等）免疫反應(yīng)指標(biāo),Intensive Care Med. 2011 May, publish online.