免疫細(xì)胞功能的測(cè)定

1、免疫細(xì)胞功能的測(cè)定,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院胡翊群主任醫(yī)師,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,基礎(chǔ)理論 本技術(shù)用于評(píng)估T細(xì)胞對(duì)各種刺激的增殖能力。T細(xì)胞增殖能力是反映T細(xì)胞功能的一個(gè)重要指標(biāo)。,免疫細(xì)胞功能的測(cè)定,T細(xì)胞功能的測(cè)定,刺激T細(xì)胞增殖的因素及意義 1. 特異性抗原： 引起寡克隆活化增殖。 克用于判斷抗原免疫的效果（疫苗接種）和回憶反應(yīng)能力，也能反映T細(xì)胞總體的功能。 2. 絲裂原：多克隆。 3. 刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

2、分子：多克隆。,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,T細(xì)胞增殖測(cè)定方法1. 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞計(jì)數(shù)。2. 放射性核素?fù)饺朐囼?yàn)。 細(xì)胞增殖時(shí)，DNA復(fù)制，須從培養(yǎng)液中補(bǔ)充核苷酸。用放射性核素標(biāo)記培養(yǎng)液中提供的胸腺嘧啶（3HTdR），當(dāng)DNA復(fù)制時(shí)， 3HTdR摻入正在分裂的細(xì)胞的DNA中。細(xì)胞增殖程度與細(xì)胞內(nèi)摻入的3HTdR的量成正比。通過用液閃儀定量測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞中的放射性強(qiáng)度，就可以確定T細(xì)胞增殖的能力與強(qiáng)度。,絲裂原誘導(dǎo)的增

3、殖反應(yīng),誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖反應(yīng)的絲裂原 1. PHA（植物血凝素） 2. Con A（刀豆蛋白 A） 3. PMN（美洲商陸）,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,絲裂原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng),技術(shù)方法1. 用RPMI－10將PBMC配成1x106/ml的懸液。2. 用100g/ml的PHA配制1:10、1:20和1:40稀釋液。3. 96孔板中選擇一行（共12孔），每孔中加入100µl細(xì)胞。指定每相鄰3孔為一組。

4、前3組分別加入一種稀釋度的PHA溶液，最后一組加培養(yǎng)液（對(duì)照組）。4. 37°C ，5％CO2，54h。5. 配制濃度為50µci/ml的3HTdR。,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,絲裂原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng),6. 每孔加入50µci 3HTdR，繼續(xù)培養(yǎng)18h。7. 用多孔自動(dòng)收集儀分別收集每孔細(xì)胞于一小管中。溶解細(xì)胞，將DNA過濾到濾紙上，洗去未摻入的3HTdR，最后用100％的甲醇洗滌，以利濾紙干燥。8.

5、將濾紙放入液閃管內(nèi)，自動(dòng)計(jì)數(shù)，打印結(jié)果。9. 扣除本底，計(jì)算每一組3個(gè)復(fù)本的平均數(shù)。,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,絲裂原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng),影響因素1. 細(xì)胞活力：冷凍技術(shù)影響細(xì)胞活力，復(fù)蘇后應(yīng)檢查細(xì)胞活力。2. 培養(yǎng)液中添加的血清：有些血清可能激活或抑制細(xì)胞增殖。如欲測(cè)定人體細(xì)胞增殖能力，可采用滅活的AB血清。3. 細(xì)胞培養(yǎng)板類型：根據(jù)細(xì)胞數(shù)量采用不同形狀底部的培養(yǎng)板。4. 微生物污染：可降低細(xì)胞增殖能力。,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,單向混合

6、淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng),原理 T細(xì)胞受體能夠識(shí)別同種異型MHC分子。當(dāng)把2個(gè)不同個(gè)體的單個(gè)核細(xì)胞在體外混合時(shí)，可以相互刺激，引起增殖。增殖的強(qiáng)度與兩者之間MHC的差別的程度成正比。所以同種異型混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)度反映2個(gè)個(gè)體之間MHC差別的程度，并且因?yàn)橄嗷プR(shí)別與增殖，結(jié)果是2個(gè)個(gè)體的淋巴細(xì)胞增殖能力的總和。這種試驗(yàn)就是雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)。 將參加反應(yīng)之一方的單個(gè)核細(xì)胞用放射性核素照射，使其失去反應(yīng)能力，但

7、仍保存刺激能力，成為刺激細(xì)胞，則此時(shí)的反應(yīng)結(jié)果僅反映另一方（反應(yīng)方）的增殖能力。在實(shí)質(zhì)性器官移植時(shí)，只需了解受者淋巴細(xì)胞對(duì)供者M(jìn)HC的反應(yīng)能力，所以適合采用單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)。,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn),方法 1. 分離宿主與供者的PBMC，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 x 106/ml。 2. 刺激細(xì)胞滅活：用絲裂霉素（終濃度25µg，37 °C， 5％C，30min）或放射性核素照射（200

8、0 rad）的方法處理刺激細(xì)胞。 3. 96孔板中，每孔加入1x105的刺激細(xì)胞和1x105反應(yīng)細(xì)胞。 37°C，5％CO2，4～6d。加3HTdR，繼續(xù)培養(yǎng)18h。陽性對(duì)照孔加反應(yīng)細(xì)胞和絲裂原，不加刺激細(xì)胞。陰性對(duì)照孔只加照射的自身細(xì)胞。3復(fù)本。 4. 收集細(xì)胞，液閃儀計(jì)數(shù)，打印結(jié)果。,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),5. 計(jì)算相對(duì)反應(yīng)（RR） （實(shí)驗(yàn)組cpm－陰性對(duì)照組c

9、pm） RR＝ 陽性對(duì)照組cpm－陰性對(duì)照組cpm,,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),注意點(diǎn) 1. 細(xì)胞活力：使用冷凍細(xì)胞時(shí)，復(fù)蘇后應(yīng)檢查細(xì)胞活力。 2. 培養(yǎng)液中添加的血清：有的血清可能會(huì)刺激或抑制反應(yīng)。 3. 本底應(yīng)小于2000 rpm，陽性對(duì)照組應(yīng)大于20000 rpm。,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,抗原誘導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng),原理 本試驗(yàn)測(cè)定T細(xì)胞在體外對(duì)

10、某一特定抗原的特異性免疫應(yīng)答能力。所用抗原可以是初次接觸的抗原，也可以是曾經(jīng)免疫過的抗原。常用的測(cè)定回憶反應(yīng)的抗原有純化蛋白衍生物（PPD）和破傷風(fēng)類毒素（TT）。這2種抗原都被常規(guī)列入計(jì)劃免疫接種范疇，成人應(yīng)該對(duì)它們有回憶反應(yīng)。在某些免疫缺陷病中，對(duì)它們的特異性回憶反應(yīng)可減弱或消失。,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,,,,,,,抗原誘導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng),方法（以T細(xì)胞對(duì)破傷風(fēng)類毒素刺激的增殖反應(yīng)為例）1. 分離PBMC和APC，APC用絲裂霉素

11、或放射性核素處理。2. 96孔板中每孔加入1x105 PBMC和1x104 APC。3. 每孔中加入系列稀釋的破傷風(fēng)類毒素溶液，不同孔中抗原終濃度分別為0、1、5、10和20µg/ml。每一種濃度設(shè)3復(fù)本。4. 37C°，5％CO2，6天。5. 加3HTdR，繼續(xù)培養(yǎng)18小時(shí)。計(jì)數(shù)。,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,抗原誘導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng),結(jié)果解釋1. 對(duì)于接種過破傷風(fēng)疫苗者來說，本試驗(yàn)結(jié)果呈低反應(yīng)反映患者對(duì)破傷風(fēng)類

12、毒素特異性應(yīng)答能力低下或全身免疫缺陷。2. HIV感染者反應(yīng)低下反映CD4+T細(xì)胞減少導(dǎo)致的免疫缺陷。,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,抗原誘導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng),注意點(diǎn)1. 培養(yǎng)液中最好用人AB血清。2. 此T細(xì)胞增殖反應(yīng)需要APC。如使用純化T細(xì)胞，需加5％～10％自身APC。,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,抗原誘導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng),應(yīng)用實(shí)踐1. 絲裂原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng) 臨床上用于評(píng)估T細(xì)胞對(duì)多克隆刺激劑的增殖能力，反映T細(xì)胞基本免

13、疫功能，即T細(xì)胞群總體的信息，不能反映個(gè)別T細(xì)胞克隆的情況 PHA常用于測(cè)試人T細(xì)胞增殖能力，Con A常用于測(cè)試小鼠T細(xì)胞增殖能力。,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,抗原誘導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng),應(yīng)用實(shí)踐2. 單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 1）本方法主要用于估計(jì)器官移植前供體與受者之間MHC相配程度。 2）如培養(yǎng)時(shí)間超過96 小時(shí)，可制備細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）。,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,抗原誘導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng)

14、,應(yīng)用實(shí)踐 3. 抗原誘導(dǎo)的特異性增殖反應(yīng) 用于估計(jì)機(jī)體對(duì)特異性抗原的應(yīng)答能力和機(jī)體總體免疫應(yīng)答能力。,T細(xì)胞增殖功能測(cè)定,B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定,基礎(chǔ)理論 B細(xì)胞受到多克隆激活劑或特異性抗原刺激后，活化、增殖，最后分化成為漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體?？贵w可以在血漿和其他體液中檢出，檢測(cè)抗體是測(cè)定B細(xì)胞功能的最重要的方法。 B細(xì)胞分類：B1細(xì)胞和B2細(xì)胞。兩者發(fā)生學(xué)不同、接受刺激的抗原不同，對(duì)T細(xì)胞的依

15、賴性不同。 由于B2細(xì)胞對(duì)抗原的應(yīng)答依賴T細(xì)胞，所以，B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的低下，其缺陷也可能起源于T細(xì)胞缺陷。,絲裂原誘導(dǎo)多克隆抗體產(chǎn)生能力的測(cè)定,基礎(chǔ)理論 人B細(xì)胞具有PWM受體，在體外受到PWM刺激時(shí)，發(fā)生多克隆激活，產(chǎn)生多克隆抗體。B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力可以用ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清中抗體的量估計(jì)，也可以用ELISPOT方法測(cè)定產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞數(shù)量估計(jì)。,B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定,絲裂原誘導(dǎo)多克隆抗體產(chǎn)生

16、能力的測(cè)定,技術(shù)方法與評(píng)價(jià)1. 分離PBMC96孔板中每孔加入1x105細(xì)胞和PWM終濃度（1：100）。陰性對(duì)照孔內(nèi)不加pWM。每一實(shí)驗(yàn)設(shè)2 復(fù)本。2. 37C°5％CO2培養(yǎng)10天（ELISA）或7天（ELISPOT）。3. 收集上清，用ELISA法測(cè)抗體。收集細(xì)胞，用ELISPOT法測(cè)產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞。,B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定,絲裂原誘導(dǎo)多克隆抗體產(chǎn)生能力的測(cè)定,應(yīng)用實(shí)踐1. 用于確定B細(xì)胞活化和分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

17、機(jī)制，以及細(xì)胞因子和其它銀子對(duì)B細(xì)胞分化的影響。2. 因?yàn)锽2細(xì)胞產(chǎn)生抗原需要T細(xì)胞輔助，所以又可以用于檢測(cè)T細(xì)胞的輔助功能。3. 臨床上用于研究免疫缺陷病和自身免疫病患者B細(xì)胞分化異常的機(jī)制。,B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定,絲裂原誘導(dǎo)多克隆抗體產(chǎn)生能力的測(cè)定,注意點(diǎn) 采用以抗體為基礎(chǔ)的技術(shù)（如磁珠法、淘洗法和流式細(xì)胞儀）分離的B細(xì)胞，需考慮抗體對(duì)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的影響（促進(jìn)或抑制作用）。,B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定,EL

18、ISPOT法,基礎(chǔ)理論 ELISPOT全稱為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（enzyme－linked immunospot assay），可用于測(cè)定產(chǎn)生IgG和IgM抗體的B細(xì)胞。其方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特異性B細(xì)胞。如果B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，抗體與板上的抗原結(jié)合。加入酶標(biāo)二抗和顯色劑就會(huì)顯色。一個(gè)斑點(diǎn)就代表一個(gè)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。,B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定,ELISPOT法,技術(shù)方法1. 抗原包被：37C°2h，或4C

19、°過夜。固相載體可用聚苯乙烯平皿、亞硝酸纖維膜、96孔板。2. 抗體生成細(xì)胞培育：加入適量抗體生成細(xì)胞，37C°，5％CO2，3～4h，或過夜。洗滌，去除為與固相結(jié)合的細(xì)胞。3. 測(cè)定斑點(diǎn)產(chǎn)生細(xì)胞：加二抗， 37C°，5％CO2，2～3h。加辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶和底物顯色。4 計(jì)數(shù)：24h后用10～30倍顯微鏡下計(jì)數(shù)斑點(diǎn)形成細(xì)胞。,B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定,ELISPOT法,評(píng)價(jià)1. 在操作中

20、應(yīng)使用無關(guān)抗原作陰性對(duì)照；病應(yīng)排除細(xì)胞標(biāo)本終抗體污染。2. 硝酸纖維素膜靈敏度高于聚苯乙烯。3. 與ELISA聯(lián)合使用，可以估計(jì)單個(gè)細(xì)胞的抗體產(chǎn)量。4 當(dāng)淋巴細(xì)胞受到嚴(yán)重污染時(shí)，也可以使用本法，所以適用于測(cè)定組織中抗體生成細(xì)胞。應(yīng)用實(shí)踐用途同ELISA法。本方法可用于任何可溶性抗原。,B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定,ELISA測(cè)定各類免疫球蛋白,基礎(chǔ)理論 B細(xì)胞受抗原刺激后，最初產(chǎn)生IgM抗體，然后在Th細(xì)胞產(chǎn)生的

21、各種細(xì)胞因子的作用下，可轉(zhuǎn)類成為IgG、IgA、IgE類抗體。應(yīng)用不同的單抗，結(jié)合ELISA方法，可以測(cè)定B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的類別。,B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定,ELISA測(cè)定各類免疫球蛋白,方法1. 包板：96孔板用濃度為10µg/ml的特異性單抗包被。蓋上蓋板，37C°，5％CO2，2h，或4C°過夜。常規(guī)洗板，封閉。2. 上樣：每孔內(nèi)加入1:10或1:20 稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)上清液100µl。陽

22、性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照為培養(yǎng)液。每試驗(yàn)設(shè)2復(fù)本。室溫培育2h，或4C°過夜。3. 加酶標(biāo)二抗：每孔加100µl堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgM或IgG或IgA二抗。室溫培育2h，或4C°過夜。4. 顯色：洗板，每孔加100µl底物（p－nitrophenyl phosphate）。5. 自動(dòng)酶標(biāo)儀讀數(shù)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出抗體濃度。,B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定,ELISA測(cè)定各類免疫球蛋白,評(píng)價(jià)

23、 ELISA法靈敏、簡單、快速、特異性高、重復(fù)性好，是測(cè)定上清和體液中Ig的首選方法。堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗顯色明顯，不必用堿中止反應(yīng)，尤其適用于測(cè)定體外產(chǎn)生的抗體。應(yīng)用實(shí)踐 ELISA可測(cè)定各種體液中的抗體，其結(jié)果反映被檢個(gè)體B細(xì)胞功能。測(cè)定免疫球蛋白各種亞類的水平有助于鑒定免疫缺陷病。,B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定,CTL殺傷功能的測(cè)定,基礎(chǔ)理論 CTL為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的簡稱。是CD8＋T

24、細(xì)胞識(shí)別APC表面MHC I類分子遞呈的腫瘤或病毒特異性抗原肽后，分化形成的。當(dāng)CTL遇到相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞時(shí)，能夠通過細(xì)胞接觸機(jī)制或裂解機(jī)制殺傷靶細(xì)胞。,CTL殺傷功能的測(cè)定,1. 細(xì)胞接觸機(jī)制 CTL表達(dá)FasL，靶細(xì)胞表達(dá)Fas，F(xiàn)asL與Fas的配接，通過Fas傳入的信號(hào)激活靶細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡途徑，導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。2. 細(xì)胞裂解機(jī)制 CTL激活后，胞質(zhì)內(nèi)顆粒向2個(gè)細(xì)胞接觸點(diǎn)移動(dòng)。顆粒膜與細(xì)

25、胞膜融合通過外吐釋放顆粒內(nèi)容物。穿孔素插入靶細(xì)胞膜后聚合，喜愛細(xì)胞膜上形成孔，造成細(xì)胞裂解。顆粒酶誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。,CTL殺傷功能的測(cè)定,51Cr標(biāo)記法原理 如在將靶細(xì)胞與CTL混合之前，先用放射性核素51Cr培育， 51Cr能穿過細(xì)胞膜進(jìn)入胞漿，與胞漿中小分子蛋白質(zhì)牢固結(jié)合，不能自由從細(xì)胞內(nèi)釋放。當(dāng)靶細(xì)胞膜被CTL破壞后， 51Cr被釋放進(jìn)入上清。因?yàn)樯锨逯蟹派湫詮?qiáng)度與細(xì)胞殺傷程度呈正比，通過測(cè)定上清中放射性強(qiáng)度，就可以

26、判定CTL殺傷能力。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,CTL殺傷功能的測(cè)定,技術(shù)方法1. 從腫瘤組織中分離淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。2. 51Cr標(biāo)記腫瘤細(xì)胞。3. 96孔培養(yǎng)板每孔中加入淋巴細(xì)胞和靶細(xì)胞，效：靶比為50:1，25:1，12.5:1。另設(shè)最大釋放對(duì)照（靶細(xì)胞加去污劑）和自發(fā)釋放對(duì)照（不加CTL）。4. 37C°，5％CO2，4h。5. 收集上清，?計(jì)數(shù)器測(cè)定放射活性（cpm）。,CTL殺傷功能的測(cè)定,

27、計(jì)算公式 試驗(yàn)組平均CPM值－自發(fā)釋放組平均cpm值％溶解＝ 最大釋放平均cpm值－自發(fā)釋放平均cpm值注意點(diǎn)由于CTL殺傷靶細(xì)胞受MHC限制，所以靶細(xì)胞必須來自自身，或選用表達(dá)適當(dāng)MHC的腫瘤細(xì)胞系。評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：方法簡單、快速，能定量。缺點(diǎn)：自然釋放率較高，需要的靶細(xì)胞量多。使用放射性核素。,,CTL殺傷功能的測(cè)定,應(yīng)用實(shí)踐這一方法常用于評(píng)估腫瘤患者CTL殺傷

28、腫瘤的能力，可作為判斷雨后和觀察療效的指標(biāo)之一。,NK細(xì)胞毒性測(cè)定,基礎(chǔ)理論 NK細(xì)胞存在于外周血、淋巴組織中，尤以脾臟最為豐富。因細(xì)胞體積大和胞漿內(nèi)含大量顆粒，故稱大顆粒淋巴細(xì)胞。表型特征是CD16（Fc?RIII A）和CD56（神經(jīng)細(xì)胞粘附分子）。當(dāng)NK細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞活病毒感染細(xì)胞時(shí)，CD16分子被交聯(lián)，引起脫顆粒，并分泌IFN－?和TNF。顆粒中含有穿孔素、顆粒酶和proteoglycans，引起靶細(xì)胞溶脹性死

29、亡和凋亡。NK細(xì)胞的CD16與IgG1和IGg3結(jié)合，可介導(dǎo)ADCC作用。 NK細(xì)胞表達(dá)一種能識(shí)別HLA－A、－B、－C抗原的受體，向細(xì)胞發(fā)出一致性信號(hào)，阻止NK細(xì)胞的殺傷活性。當(dāng)靶細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)HLA I類分子時(shí)，抑制解除，NK細(xì)胞活化，殺傷靶細(xì)胞。 K562細(xì)胞系不表達(dá)HLA分子，對(duì)NK細(xì)胞殺傷作用敏感，常用作NK細(xì)胞的靶細(xì)胞，用于檢測(cè)NK細(xì)胞的活性。,NK細(xì)胞毒性測(cè)定,技術(shù)方法1. NK細(xì)胞的分離

30、：用抗CD3、CD19、CD14單抗和淘洗法，去除T細(xì)胞、B細(xì)胞和Mo，獲取NK細(xì)胞。2. 加板： 方法同CTL殺傷試驗(yàn)。不同的是，靶細(xì)胞為K562細(xì)胞。最大釋放組為靶細(xì)胞中加去污劑，自發(fā)釋放對(duì)照組中不加Nk細(xì)胞。37C°，5％CO2，4h。3. 收集上清液，?計(jì)數(shù)器測(cè)各孔cpm值。4. 計(jì)算％溶解值：方法同CTL法。,NK細(xì)胞毒性測(cè)定,評(píng)價(jià)1. 本方法穩(wěn)定，但51Cr污染環(huán)境。2. 從外周血中 分離的NK細(xì)胞是靜止

31、細(xì)胞，只能殺死對(duì)峙敏感的K562細(xì)胞系，不能殺傷其它腫瘤細(xì)胞。3. 冷凍保存影響NK細(xì)胞活性，故宜采用新鮮分離的NK細(xì)胞。4. 人血清中含有的IgG會(huì)抑制NK細(xì)胞的殺傷活性，故培養(yǎng)液中宜使用小牛血清。,NK細(xì)胞毒性測(cè)定,應(yīng)用實(shí)踐 檢測(cè)NK細(xì)胞免疫活性。在疾病狀態(tài)下，NK細(xì)胞的功能會(huì)受到影響。,LAK細(xì)胞毒性測(cè)定,基礎(chǔ)理論 LAK細(xì)胞是淋巴因子激活殺傷細(xì)胞的簡稱。NK細(xì)胞在大劑量IL－2刺激下擴(kuò)增并分

32、化成為LAK細(xì)胞。LAK細(xì)胞對(duì)新鮮分離的腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞系具有非特異性殺傷作用。臨床上用LAK細(xì)胞過繼性治療某些腫瘤患者，例如腎細(xì)胞癌、黑色素瘤合霍奇金病，有一定療效。,LAK細(xì)胞毒性測(cè)定,技術(shù)方法1. 制備：抽取患者外周血20ml，分離PBMC。培養(yǎng)皿中加入重組IL－2，是終濃度為100U/ml。37C°，5％CO2，培養(yǎng)，每3～4天換液；細(xì)胞數(shù)增加時(shí)分瓶。2. 培養(yǎng)7～10天。收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)。細(xì)胞需要量為109～10