免疫細(xì)胞的分離與功能測(cè)定

1、第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離一 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離,原理: 密度梯度離心，利用密度為1.077±0.001g/L 淋巴細(xì)胞分層液（聚蔗糖-泛影葡胺）,,,,主要步驟 1 無菌采集靜脈血，抗凝（每1ml全血加0.1ml 125～250U /ml 肝素溶液） 2 用等體積Hanks平衡鹽溶液(HBSS)或pH7.2～7.4 PBS 稀釋 3 按每10ml稀釋血用3～5ml淋巴細(xì)胞分層液的比例先將淋巴細(xì)胞分層液加入離心管中

2、，再小心沿管壁緩慢加入稀釋血，注意切勿使血液混入分層液 4 2000r/min 水平離心30min， 5 吸取分層液與血漿交界部位的單個(gè)核細(xì)胞，用5倍體積的HBSS或RPMI-1640洗滌2次依次以2000 r/min，1500 r/min離心10min 6 用完全RPMI-1640定容，計(jì)數(shù)。一般每ml健康成人血可分離出1×106～2×106單個(gè)核細(xì)胞 7 臺(tái)盼藍(lán)染色，檢查細(xì)胞活性，活細(xì)胞應(yīng)﹥95﹪

3、。,注意事項(xiàng),1 嚴(yán)格無菌操作 2 操作應(yīng)輕柔，細(xì)胞懸液應(yīng)充分混勻 3 淋巴細(xì)胞分層液應(yīng)4℃避光保存，取出后待溫度升至室溫使用 4 如須保存血漿作他用，則不能稀釋血液 5 離心最適溫度18～20℃ 6 分離組織中的單個(gè)核細(xì)胞也可采用上法,二 淋巴細(xì)胞的純化,㈠紅細(xì)胞的去除1 低滲裂解法 1ml蒸溜水加入沉淀的PBMC中，輕搖（﹤1min）立即加入1.8﹪NaCl, 洗滌2 氯化銨處理法 沉淀的PBMC中加入1ml

4、 0.83﹪氯化銨溶液，輕搖2 min，洗滌,,㈡血小板的去除1 .PBMC經(jīng)洗滌2～3次可去除大部分血小板2 .胎牛血清(FCS)梯度離心 1ml PBMC懸液（1×107～2×107/ml）用3ml FCS 800r/min 水平離心15min，18～20℃,㈢單核細(xì)胞的去除,1 .粘附去除法,,原理 單核細(xì)胞可粘附在玻璃或塑料表面 ⑴PBMC用完全RPMI-1640調(diào)整濃度至2×106/

5、ml ⑵將50ml細(xì)胞懸液移入150cm2培養(yǎng)瓶，37℃ 5﹪CO2 95﹪濕度培養(yǎng)1h⑶收集非粘附細(xì)胞，再用預(yù)溫至37℃的RPMI-1640 ,輕輕蕩洗培養(yǎng)瓶并收集蕩洗液⑷1300r/min 離心10 min，18～20℃⑸棄上清，用5～10ml完全RPMI-1640懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)，用臺(tái)盼藍(lán)染色檢查細(xì)胞活性,2. L-亮氨酸甲酯去除法 溶酶體酶→L-亮氨酸甲酯→L-亮氨酸-L-亮氨酸甲酯此法也可清楚NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T

6、細(xì)胞本法只適用于分離新鮮細(xì)胞,⑴用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至3×1065×106/ml，用無血清RPMI-1640配制10mmol/L的L-亮氨酸甲酯溶液（臨用時(shí)配），兩液按1︰1比例混合，室溫40min⑵1300r/min 離心10 min，用HBSS或PBS洗滌沉淀共3次⑶用完全RPMI-1640懸浮細(xì)胞，用無菌尼龍網(wǎng)過濾，離心并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞至所需濃度,,3. 羰基鐵吞噬離心法,在抗凝血中加入一定量羰基鐵粉，3

7、7℃攪拌15 min，然后用淋巴細(xì)胞分層液離心分離亦可先分離PBMC，再加羰基鐵粉分離去除單核細(xì)胞粘附法去除單核細(xì)胞后，大約95﹪為淋巴細(xì)胞，活性＞95﹪L-亮氨酸甲酯法，99﹪為淋巴細(xì)胞，活性＞95﹪,三 外周血淋巴細(xì)胞選擇性分離,㈠ T細(xì)胞的分離 1 .尼龍棉柱法原理 B細(xì)胞易粘附于尼龍棉纖維，而T細(xì)胞則否,尼龍棉（聚酰胺纖維）預(yù)處理尼龍棉（聚酰胺纖維）50mg在0.2mol/L HCl浸泡過夜，用大量蒸溜水漂洗，晾干。

8、尼龍棉柱制備塑料軟管 長12～16cm 內(nèi)經(jīng)5～6mm 壁厚0.2 mm高6cm的尼龍棉柱可有效地濾過20×106～30×106個(gè)細(xì)胞.此法分離的T細(xì)胞純度可達(dá)90﹪以上,2 .花環(huán)形成分離法 原理 T細(xì)胞表面有綿羊紅細(xì)胞受體，可與綿羊紅細(xì)胞結(jié)合形成花環(huán).綿羊紅細(xì)胞用2-氨基乙基異硫脲溴化物（AET）或神經(jīng)氨酸酶（NM）可提高花環(huán)形成的效果和穩(wěn)定性,,,⑴1ml PBMC懸液(1×107/

9、ml)、2ml NCS和 1ml 4﹪AET-SRBC懸液混勻，37℃水浴10 min ↓ 800r/min 4℃離心5 min，冰浴1h 或800r/min 室溫離心10 min，4℃2h ↓置淋巴細(xì)胞分層液（3～5ml分層液可分離10mlPBMC/NCS/AET-SRBC混合液） ↓1300r/min 離心25 min，18～20℃ 或2000r/min 離心35 min，4℃位于界面的是非花環(huán)形成細(xì)胞，沉

10、淀的是花環(huán)形成細(xì)胞,⑵1ml PBMC懸液(1×107/ml)、2ml NCS和 2ml 2﹪NM-SRBC懸液混勻，37℃水浴10 min以下步驟同⑴經(jīng)1次花環(huán)形成試驗(yàn)所得到的花環(huán)形成細(xì)胞中，T細(xì)胞﹥95﹪，B細(xì)胞﹤1﹪，單核細(xì)胞約為2﹪。經(jīng)2次花環(huán)形成試驗(yàn)后，非花環(huán)形成細(xì)胞中T細(xì)胞﹤2﹪用此法時(shí)，因SRBC與受體結(jié)合可激活某些T細(xì)胞，導(dǎo)致功能增強(qiáng),㈡ T細(xì)胞亞群的分離1. 間接免疫吸附分離法 原理 T細(xì)胞 +

11、抗某種T細(xì)胞分化抗原的抗體 ↓加入包被有羊抗鼠Ig的平皿,2 .抗體/補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用分離法 原理 是一種負(fù)性分離法 T細(xì)胞 + 抗某種需去除T細(xì)胞分化抗原的抗體+補(bǔ)體→該亞群T細(xì)胞裂解 如 T細(xì)胞 + 抗CD4抗體 + 補(bǔ)體→CD4+細(xì)胞裂解 T細(xì)胞 + 抗CD8抗體 + 補(bǔ)體→CD8+細(xì)胞裂解,3.免疫磁性微珠分離法 原理 羊抗鼠Ig + 磁性微珠→免疫磁性微珠

12、 T細(xì)胞 + 抗某種亞群分化抗原的抗體 ↓ 加免疫磁性微珠 ↓ 在外加磁場(chǎng)作用下，該亞群T細(xì)胞連同免疫磁性微珠一起沉降,如 T細(xì)胞 + 抗CD4抗體 ↓ 加免疫磁性微珠 ↓ 在外加磁場(chǎng)作用下，CD4+T細(xì)胞連同免疫磁性微珠一起沉降，CD8+T細(xì)胞則留在懸液中 優(yōu)點(diǎn) 細(xì)胞純度高，產(chǎn)量大，操作簡(jiǎn)單,㈢ B細(xì)胞的分離1 .

13、負(fù)性B細(xì)胞分離法⑴用密度梯度離心法分離PBMC⑵用L-亮氨酸甲酯法去除單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞⑶用花環(huán)形成法去除T細(xì)胞 用此法分離B細(xì)胞，240ml 全血中可得1×107～2×107個(gè)B細(xì)胞，純度﹥90﹪，2﹪～3﹪的單核細(xì)胞，﹤1﹪的其他細(xì)胞,,2 .直接免疫吸附法 兔抗人Ig包被平皿 ↓淋巴細(xì)胞懸液↓洗去未吸附細(xì)胞，收集吸附細(xì)胞,3.間接免疫吸附法 淋巴細(xì)胞懸液 + 抗CD

14、19、抗CD20抗體 ↓ 羊抗鼠Ig包被的平皿 ↓洗去未吸附細(xì)胞，收集吸附細(xì)胞4.免疫磁性微珠分離法,㈣ NK細(xì)胞的分離1.負(fù)性NK細(xì)胞分離法 ⑴用密度梯度離心法分離PBMC ⑵用粘附法去除單核細(xì)胞 ⑶用尼龍棉柱法去除B細(xì)胞 ⑷用花環(huán)形成法去除T細(xì)胞2 .免疫磁性微珠分離法，抗CD16抗體,四 淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè),㈠ 免疫熒光技術(shù) 直接法 FITC-抗CD4抗體 FITC

15、-抗CD8抗體 間接法 FITC-羊抗鼠Ig 抗CD4抗體 抗CD8抗體,㈡ 微量細(xì)胞毒試驗(yàn) PBMC + 抗某亞群T細(xì)胞分化抗原的抗體+補(bǔ)體 ↓ 加染料，該某亞群T細(xì)胞著色如 T細(xì)胞 +抗CD4抗體+補(bǔ)體 ↓ 加伊紅染料，呈紅色的為CD4+細(xì)胞,㈢花環(huán)技術(shù) 1葡萄球菌花環(huán)法原理 SPA可與IgGFc段結(jié)合 直接SPA菌花環(huán)法 SPA菌-抗CD3、SPA菌

16、-抗CD4、SPA菌-抗CD8 間接SPA菌花環(huán)法 SPA菌-兔抗鼠Ig（IgG類） 抗CD3、抗CD4、抗CD8,2 紅細(xì)胞花環(huán)法 原理 將SRBC與mAb或兔抗鼠IgG偶聯(lián)直接紅細(xì)胞花環(huán)法 SRBC-抗CD3、SRBC-抗CD4、SRBC-抗CD8分別與去除粘附細(xì)胞的PBMC作用，染色后鏡檢200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算花環(huán)形成細(xì)胞百分率,間接紅細(xì)胞花環(huán)法抗CD3、抗CD4、抗CD8分別與去除粘附細(xì)胞的PBMC作用，加

17、入SRBC-兔抗鼠IgG偶聯(lián)物作用，染色后鏡檢200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算花環(huán)形成細(xì)胞百分率,五 淋巴細(xì)胞功能測(cè)定,㈠ 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 非特異性刺激物 PHA、ConA、PWM、SPA、LPS，胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白質(zhì)，抗CD2、抗CD3、抗IgM等細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體，及某些細(xì)胞因子特異性刺激物特異性抗原,1 .絲裂原刺激的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)絲裂原→淋巴細(xì)胞→淋巴母細(xì)胞⑴ 3H-TdR摻入試驗(yàn) SI﹦試驗(yàn)組cpm/對(duì)照組

18、cpm,⑵ 形態(tài)學(xué)方法結(jié)果以淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率表示⑶ MTT比色法 琥珀酸脫氫酶→MTT→甲月贊+鹽酸異丙醇或二甲基亞砜→溶解后測(cè)OD值 SI﹦試驗(yàn)組OD均值/對(duì)照組OD均值,2 .混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 可分3H-TdR摻入法、形態(tài)學(xué)方法及MTT比色法,3 .自身混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)4 .淋巴因子誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖反應(yīng) 如 IL-4→B細(xì)胞，IL-2→T細(xì)胞,5 .影響細(xì)胞增

19、殖反應(yīng)的因素⑴細(xì)胞應(yīng)保持高活性，⑵可溶性抗原刺激淋巴細(xì)胞增殖時(shí)，常需一定數(shù)量的抗原呈遞細(xì)胞⑶不同的刺激原有不同的刺激劑量⑷嚴(yán)格無菌操作,六 NK細(xì)胞活性測(cè)定,靶細(xì)胞 人NK細(xì)胞 K562細(xì)胞（靶細(xì)胞）鼠NK細(xì)胞 YAC-1細(xì)胞（靶細(xì)胞）,㈠ 形態(tài)學(xué)方法 原理 靶細(xì)胞被NK細(xì)胞殺傷后細(xì)胞膜通透性改變而使臺(tái)盼藍(lán)染料透入細(xì)胞，細(xì)胞呈藍(lán)色，無折光性,,靶細(xì)胞 K562細(xì)胞或YAC-1細(xì)胞用完全RPMI-1640

20、 調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml 效應(yīng)細(xì)胞 人PBMC或小鼠脾細(xì)胞用含15﹪NCS的RPMI-1640調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml 對(duì)照孔 100ul靶細(xì)胞＋100ul完全RPMI-1640 實(shí)驗(yàn)孔 100ul靶細(xì)胞＋100ul效應(yīng)細(xì)胞 效/靶細(xì)胞比例（E/T ）為50︰1各設(shè)3個(gè)平行空，37℃ 5﹪CO2溫箱培養(yǎng)過夜每孔各取30ul細(xì)胞懸液，加30ul 0.

21、5﹪臺(tái)盼藍(lán)室溫染色5min,于白細(xì)胞計(jì)數(shù)板中每孔各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，記錄死細(xì)胞及活細(xì)胞數(shù)，求出各組NK細(xì)胞活性的均值 實(shí)驗(yàn)組靶細(xì)胞死亡數(shù)－對(duì)照組靶細(xì)胞死亡數(shù)NK細(xì)胞活性%﹦ 100 100﹪,×,,㈡ 同位素釋放法1 . 51Cr釋放試驗(yàn)2.

22、 125I-UdR釋放試驗(yàn)3. 全血NK細(xì)胞活性同位素檢測(cè)法,七 單核-巨噬細(xì)胞的分離與功能測(cè)定,㈠人單核細(xì)胞的分離方法 單核細(xì)胞占外周血白細(xì)胞的3﹪～5﹪,,1 Peroll離心沉淀法 Peroll（聚乙烯吡咯酮包被的硅膠混懸液）Peroll連續(xù)密度梯度液配制Peroll 7ml 和2×PBS 6ml→1500r/min 離心40min 操作步驟 PBMC加到3～5mlNCS上 ↓ 800r/m

23、in，離心15 min（18～20℃） ↓ 沉淀細(xì)胞用含10﹪NCS的PBS配制成2×107～5×107/ml懸液 ↓ 加到Peroll連續(xù)密度梯度液，4℃ 2400 r/min 離心20 min ↓ 出現(xiàn)4個(gè)細(xì)胞層，吸取第二層細(xì)胞（單核細(xì)胞占70﹪～90﹪），洗滌后計(jì)數(shù)，配制成所需濃度,,2 粘附法 用EDTA抗凝血制備PBMC，用DEME液將PBMC配制成2×106/ml懸液

24、，加入培養(yǎng)瓶（75cm2瓶加10 ml細(xì)胞懸液） ↓ 37℃ 5﹪CO2 溫箱 1h ↓ 用DEME液洗滌2次，洗去非粘附細(xì)胞 ↓ 用細(xì)胞刮片刮下細(xì)胞，或加入0.2﹪EDTA/PBS，10min 后收集細(xì)胞， ↓ 1500 r/min 離心10 min, 配制細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整至所需濃度,,,,3 Colotta法 用PBS5倍稀釋的肝素抗凝血20ml，加在20ml淋巴細(xì)胞分層液上 ↓

25、2000 r/min 離心20 min 室溫,吸取PBMC用PBS洗滌兩次，500 r/min 離心10 min ↓ 棄上清，沉淀中加入5ml含10﹪NCS，25mmol/L HEPES的RPMI-1640培養(yǎng)液 ↓ 加在5ml 46﹪Percoll液中 ↓ 2200 r/min 離心30 min 室溫，得到3個(gè)帶，第一 帶為富含單核細(xì)胞層（83﹪），第二帶含少量單核細(xì)胞，第三帶為淋巴細(xì)胞 ↓吸出