免疫細胞分離技術終概要

1、免疫細胞分離技術（針對淋巴細胞）,41110111 向珍娟41110124 龔琦青41110131 周武,免疫細胞分離技術的意義,我們知道進行有關細胞免疫方面的檢測，特別是有關免疫細胞功能的體外實驗，往往須將待檢淋巴細胞從血液或組織中分離出來，而外周血會有多種細胞成分，包括淋巴細胞、單核細胞、粒細胞、紅細胞和血咆群體。但有些細胞如淋巴細胞的物理特性及生化特性與其他細胞差異甚微，用簡單的方法不容易分純，因此產生了專門的細胞分

2、離純化技術。,白細胞分離吞噬細胞的分離和收集淋巴細胞分離,白細胞的分離,自然沉降法聚合物加速沉降法,自然沉降法,采集血液,,試管直立靜置室溫（30~60min）,抗凝（如加肝素）,,,血漿層,白細胞層,紅細胞層,,吸管吸取白細胞層,置新試管中,,離心,棄上清并洗滌,,加蒸餾水,低滲處理（裂解紅細胞）,,反復洗滌,得純度較高的白細胞懸液,聚合物加速沉降法,本法是利用高分子量的聚合物如明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（PVP）等

3、使紅細胞凝集成串，加速紅細胞沉降，使之與白細胞分離。優(yōu)點：本法的細胞獲得率比自然沉降法高。,吞噬細胞的分離和收集,方法：斑蝥敷貼法操作：用濾紙蘸取10％中藥斑蝥酒精浸出液，貼敷在臂內側皮膚表面，4～5h后皮膚局部充血，48h后局部形成水皰，吸取皰中的組織液，內含巨噬細胞；優(yōu)點：可從人體組織液中獲取較純的巨噬細胞，不需作進一步體外分離，細胞量損失較少；缺點：此法對病人皮膚有一定損傷，有時可引起局部感染，應慎用。,2024/1/2

4、2,淋巴細胞分離三步走,（一）外周血單個核細胞的分離（二）純淋巴細胞群的采集（三）淋巴細胞亞群的分離,（一）外周血單個核細胞的分離,外周血中單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細胞不同，紅細胞和多核白細胞密度較大，為1.090左右，而淋巴細胞和單核細胞密度為1.075～1.090，血小板為1.030～1.035。為此利用一種密度介于1.075～1.092之間而近于等滲的溶液（分層液）做密度梯度離心，使一定密

5、度的細胞按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。,Ficoll 分層液法,外周血單個核細胞的分離,Ficoll 分層液法 Percoll 分層液法,分層液,基本要求 ①對細胞無毒 ②基本等滲 ③不同于血漿等分離物質 ④有一定的比重最佳選擇（目前） Ficoll（聚蔗糖-泛影葡胺溶液）： 2份6％聚蔗糖蒸餾水溶液+1份34%泛影葡胺生理鹽水溶液組成，其比重為1.077±0.00

6、2.,分離過程,（1）分層液置試管底層（2）肝素抗凝全血以Hanks 液或PBS 液作適當稀釋后，輕輕疊加在分層液上面，使兩者形成一個清晰的界面（3）水平式離心（4）不同層次的液體和細胞帶（5）吸取單個核細胞層,Ficoll 分層液法,分離成品：淋巴細胞 單核細胞分離純度：95%左右，其中淋巴細胞約占90%~95%,Percoll 分層液法,Percoll分離液法是一種連續(xù)

7、密度梯度離心分離法。Percoll 是一種經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，對細胞無毒性。Percoll 液經(jīng)高速離心后可形成一個連續(xù)的密度梯度，不同密度的細胞將懸浮于各自不同的密度區(qū)帶，從而將密度不等的細胞分離純化。,分離過程,（1）用Percoll原液(密度1．135)與約等量的磷酸緩沖液均勻混合（2）高速離心后，形成一個從管底到液面密度逐漸遞減的連續(xù)密度梯度（3）將已制備的單個核細胞懸液輕輕疊加在液面上（4）低速離

8、心后，得四個細胞層。表層為死細胞殘片和 血小板，底層為粒細胞和紅細胞，中間有兩層，上層富含單核細胞(78％)，下層富含淋巴細胞(98％）。,Percoll分層液法,優(yōu)點：純化單核細胞和淋巴細胞；缺點：操作流程較長，手續(xù)較多。,連續(xù)密度梯度離心法分離單個核細胞中各細胞成分的分布示意圖,（二）純淋巴細胞的分離,根據(jù)密度離心分離法獲得的淋巴細胞主要混合在單個核細胞懸液中，由于淋巴細胞在數(shù)量上占單個核細胞的大多數(shù)，因此，單個核細胞有時也可以

9、大致地代表淋巴細胞直接用于某些實驗，但嚴格地講，采用上述方法獲得的單個核細胞需去除單核細胞才能較為準確地代表淋巴細胞用于實驗。,純淋巴細胞群的采集,實驗原理：利用單核細胞在37℃和Ca2+存在條件下，能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性；實驗方法：粘附貼壁法 吸附柱過濾法 磁鐵吸引法,2024/1/22,粘附

10、貼壁法,將已制備的單個核細胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃溫箱靜置1h左右，單核細胞和粒細胞均貼于平皿壁上，而未貼壁的非粘附細胞幾乎為純淋巴細胞，繼用橡皮刮下貼壁的細胞即為純單核細胞群。缺點：因B細胞也有貼壁現(xiàn)象，用本法分離的淋巴細胞群中B細胞有所損失。,2024/1/22,吸附柱過濾法,將單個核細胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG10的柱層中，凡有粘附能力的細胞絕大部分被吸附而粘滯在柱層中，從柱上洗

11、脫下來的細胞主要是淋巴細胞；優(yōu)點：此法簡單易行，對細胞極少損害。,2024/1/22,磁鐵吸引發(fā)法,原理：利用單核細胞具有吞噬的特性；操作：在單個核細胞懸液中加直徑為3μm的羰基鐵顆粒，置37℃溫箱內短時旋轉搖動，待單核細胞充分吞噬羰基鐵顆粒后，用磁鐵將細胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細胞。,2024/1/22,（三）淋巴細胞亞群的分離,原則：根據(jù)相應細胞的特性和不同的標志加以選擇性純化；陽性選擇法：凡根據(jù)細胞的特性和標志

12、選擇純化所需細胞的方法；陰性選擇法：選擇性去除不要的細胞，僅留下所需的細胞的方法；,2024/1/22,淋巴細胞亞群的分離,通過以上兩步的實驗分離操作，我們得到純度比較高的淋巴細胞混合液。然而在具體的實驗操作中，我們還需要將淋巴細胞進一步的進行分離。原則：根據(jù)相應細胞的特性和不同的標志加以選擇性純化；陽性選擇法：凡根據(jù)細胞的特性和標志選擇純化所需細胞的方法；陰性選擇法：選擇性去除不要的細胞，僅留下所需的細胞的方法；,分離方法,

13、1. E花環(huán)沉降法2. 尼龍毛分離法3. 免疫吸附分離法4. 免疫磁性微珠分離法5. 流式細胞儀分離法,E花環(huán)沉降法,基本原理：T 細胞有羊紅細胞受體(E受體)，可以與羊紅細胞結合形成較大的E 花環(huán)的特性，可將T 細胞和B 細胞分離。,分離過程,（1）將淋巴細胞與一定比例的綿羊紅細胞混合（2）淋巴細胞形成E 花環(huán)（3）用淋巴細胞分層液分離（4）浮懸在分層界面的細胞群則富含B 細胞，而T 細胞由于與羊紅細胞結合形成E 花環(huán)后

14、比重較大，則沉降在管底相關拓展：用神經(jīng)氨酸酶預處理羊紅細胞將有利于花環(huán)的形成和增加穩(wěn)定性。另外將沉降在管底與羊紅細胞結合的T 細胞經(jīng)低滲法處理可使圍繞細胞周圍的綿羊紅細胞快速裂解，又可得到E 受體陽性的T細胞群。,,,尼龍毛分離法,原理：本法利用B細胞和單核細胞具有易粘附于尼龍纖維表面的特性，可將T和B細胞分開。操作方法：取松散而經(jīng)過處理的尼龍毛（聚酰胺纖維），均勻充填在內徑5～6nm的聚乙烯塑料管（飲料管即可）內，經(jīng)Hanks液浸

15、透保溫，將單個核細胞懸液加入柱內，放37℃溫箱靜置1～2h。用預溫的含10％～20％小牛血清培養(yǎng)液灌洗，洗脫液內含有非粘附的T細胞，重復灌洗幾次以除去管內殘留的T細胞。再用冷或溫培養(yǎng)液邊沖邊洗邊擠壓塑料管，此時洗脫液內富含B細胞。優(yōu)點：如此得到的T細胞純度在90％以上，B細胞純度可達80％。,2024/1/22,免疫吸附分離法----親和板結合分離法,原理：各種淋巴細胞亞群具有不同的抗原性，將相應抗體結合于塑料平板上，繼加細胞懸液，

16、凡抗原陽性的細胞則與相應抗體結合，抗原陰性的細胞可從未吸附的細胞懸液中獲取；,2024/1/22,親和板結合分離法,同樣若用特異性抗原交聯(lián)在塑料板上，則可分離得具有特異抗原受體的淋巴細胞。淋巴細胞受體與特異抗原或抗體接觸，可引起細胞激活，因此，凡欲去除細胞懸液內某一細胞亞群時，本法更適用。如要分離CD4+或CD8+細胞，則可用抗CD4或CD8單克隆抗體吸附。用抗Ig抗體則可分離B細胞。同樣，用活化的C3包被，可分離出有C3受體的細胞

17、。,2024/1/22,親和板結合分離法（陽性選擇法）,（1）將相應抗體結合于塑料平板上（2）加細胞懸液（3）各種淋巴細胞亞群具有不同抗原性的特點和表面標志，抗原陽性的細胞與相應的固相抗體結合，吸附在平板上（3）多次細胞洗滌后我們將得到吸附在平板上的抗原陽性細胞（4）同理若用特異性抗原交聯(lián)于塑料板上，則可分離得到具有特異抗原受體的淋巴細胞。但淋巴細胞受體與特異抗原或抗體連接后有可能引起細胞激活，因此，凡欲去除細胞懸液內某一細胞亞

18、群時，即將其用于陰性選擇，本法更合適。,2024/1/22,免疫磁珠法分離細胞原理：,免疫磁珠法分離細胞是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。免疫磁珠法分為陽性分離法和陰性分離法：    陽性分離法－磁珠結合的細胞就是所要分離獲

19、得的細胞    陰性分離法－磁珠結合不需要的細胞，游離于磁場的細胞為所需細胞。,熒光激活細胞分離儀(FACS)分離法,主要原理是細胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，細胞排成單行，逐個流經(jīng)檢測區(qū)進行測定。當細胞從流動室噴嘴處流出時，超聲振蕩攪動液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴（40000個/s），每小滴內最多含一個細胞（其中只有百分之幾的液滴中含細胞），細胞經(jīng)激光束照射產生熒光和散射光，由光電倍增管接收，

20、轉換成脈沖信號，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細胞的類型。如識別的是預計所需的細胞時（如T細胞、B細胞要其亞群），在細胞樣品流斷裂成小滴時，使液滴瞬即感應陽電荷、陰電荷或不帶電荷，使所需的細胞在電場偏轉下進入不同的收集管;優(yōu)點：用FACS分離細胞準確快速，能保持細胞活力，并可在無菌條件下進行；局限：儀器昂貴，極少用于常規(guī)，而多數(shù)僅作為研究的手段,2024/1/22,2024/1/22,熒光激活細胞分離儀,整體分離結果,至此，通過細胞分離技術，