植物細胞微核檢測技術(shù)

1、實驗四 植物細胞微核技術(shù)檢測,一、實驗?zāi)康?1、了解細胞微核形成的機理及其形態(tài)特點；2、學(xué)習(xí)植物根尖細胞的微核檢測技術(shù)。,二、實驗原理,微核(micronucleus)簡稱MCN，是真核類生物細胞中的一 種異常結(jié)構(gòu)，往往是細胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用而產(chǎn) 生的。在細胞間期，微核呈圓形或橢圓形，游離于主核 之外，大小應(yīng)在主核1/3以下。微核的折光率及細胞化學(xué) 反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣，也具合成DNA的能力。 一

2、般認為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體斷 片產(chǎn)生的，在有絲分裂后期不能向兩極移動，所以游離 于細胞質(zhì)中，在間期細胞核形成時，即可在它附近看到 一到幾個很小的圓形結(jié)構(gòu)，直徑大約是細胞直徑的1/20 ~1/5，這就是微核。,微核率的大小是和用藥的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正 相關(guān) ，因此，微核是常用的遺傳毒理學(xué)指標(biāo)之一， 指示染色體或紡錘體的損傷。微核測試已用于輻射 損傷、輻射防護、化學(xué)誘變劑、

3、新藥試驗、染色體 遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。,三、實驗材料：,大蒜、大豆、蠶豆等。,四、實驗儀器設(shè)備：,顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、鑷子、載玻片及蓋玻片。,五、實驗步驟：,1、浸種催芽：將實驗用的蠶豆按所需要量放入盛有自來水的燒杯中，浸泡24h，此間至少換水兩次。種子吸漲后，經(jīng)36~48h，大部分初生根長至1~2cm。2、處理根尖：陽性檢測采用 1.0~2.5M CrO3，0.5~ 1.5M NaN3，150

4、~250mM EMS，對照用自來水處理，處理時間24h。3、恢復(fù)培養(yǎng)：處理后的根尖用自來水浸洗3次，每次 2-3min，洗凈后在水中恢復(fù)培養(yǎng)24h。,4、固定：用甲醛：冰醋酸（3：1）固定液固定24h后棄去 固定液，或換入70％酒精中保存。5、酸解：棄去固定液，用清水漂洗2-3次，吸凈水，加入 6M鹽酸，于室溫解離10min，棄去鹽酸，漂洗根尖2-3 次，徹底洗凈鹽酸。6、染色：截下1-2mm長的根

5、尖，滴加石炭酸品紅染液，染 色10min，加蓋玻片，壓片觀察。,固定是借助于物理方法或化學(xué)藥劑的作用，迅速透 入組織和細胞將之殺死，并且使其結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物如： 蛋白質(zhì)，脂肪，糖類以及核物質(zhì)與細胞器等，在形 態(tài)結(jié)構(gòu)上盡可能保持生活時的完整和真實狀態(tài)，同 時更易于染色，可以較清楚的顯現(xiàn)細胞在生活時不 易看清的結(jié)構(gòu)。,酸解的作用是去除未固定的蛋白質(zhì), 同時使胞間層的 果膠類物質(zhì)解

6、體，細胞分散而易于觀察。,六、實驗結(jié)果,1、首先在低倍鏡中找到分生組織區(qū)細胞分散均勻，分裂相較多的部位，再轉(zhuǎn)高倍鏡觀察，找到微核。2、微核識別標(biāo)準(zhǔn)：（1）在主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核。（2）小核著色與主核相當(dāng)或稍淺。（3）小核形態(tài)為圓形、橢圓形或不規(guī)則型。3、每一處理觀察3個根尖，每個根尖計數(shù)100個細胞，統(tǒng)計其中含微核的細胞數(shù)，計算平均數(shù)，即為該處理的MCN‰，即微核千分率。,微核,微核,,,,MN,NCE,,

7、,,改良：CB法微核:微核（micronuclear）：無著絲粒斷片（染色體碎片）或在分裂后期落后的整條染色體，在分裂末期不能納入主核，當(dāng)進入下一個間期時，它們在細胞質(zhì)內(nèi)濃縮成小于主核1/3，著色與主核相同或略淺的小核。胞漿分裂阻滯微核法(CB法)：培養(yǎng)基中加入胞松素-B,后者不干擾細胞核分裂，但能阻滯胞漿分裂。分裂一次的淋巴細胞的胞漿中出現(xiàn)雙細胞核,簡稱CB細胞。CB細胞大,具有雙核,易于鑒別。雙核細胞是只經(jīng)歷一次分裂的細胞。,

8、,,,CB法估算劑量范圍：0.25-5.0Gy；受照后微核隨時間變化規(guī)律:照射后立刻升高,然后保持恒定水平,持續(xù)時間不清；照后盡早采血,不超過一月； 微核法：直接涂片法、培養(yǎng)法、CB法；微核僅出現(xiàn)在誘發(fā)后經(jīng)過一次分裂的間期細胞傳統(tǒng)微核法不能分辨未轉(zhuǎn)化、分裂一次和一次以上的淋巴細胞,影響微核測試的準(zhǔn)確性；CB法計數(shù)CB細胞中的微核,可顯著提高微核檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。,,MN,,,CB法優(yōu)點：方法簡單,分析快速,易于掌

9、握,有利于自動化分析,尤其在核事故涉及的人員較多時更顯示具優(yōu)越性。缺點：不像雙著絲粒體對輻射敏感、特異；自發(fā)率高，1％－2％；個體差異大，自發(fā)率與性別無關(guān)，與年齡呈正相關(guān)，估算劑量下限的不確定性高；衰減速度比雙著絲粒體快。,進展：穩(wěn)定性染色體畸變（易位）分析：熒光原位雜交(FISH)技術(shù),利用生物素(biotin)標(biāo)記的已知堿基序列的核酸作為探針,按照堿基互補的原則,與標(biāo)本上染色體同源序列進行特異性結(jié)合（原位雜交）,然后用熒光標(biāo)記的

10、生物素親和蛋白 (avidin)和抗親和蛋白的抗體進行免疫監(jiān)測和放大,使探針雜交區(qū)發(fā)出熒光(顯色),形成可監(jiān)測的雜交雙鏈核酸,最后在熒光顯微鏡下檢查探針存在與否。結(jié)合了探針的染色體呈現(xiàn)出特定的顏色,未結(jié)合探針的染色體不著色,如著色與未著色的染色體間發(fā)生了互換,這種異常的染色體在熒光顯微鏡下非常容易鑒別。,,,,,1,4,FISH,,,FISH,,易位,,易位,,,特點：L FISH與G顯帶相比，節(jié)省了人力物力,由于不需要分散良好的分裂