生殖發(fā)育毒性研

1、生殖與發(fā)育毒性,主講教師 陳華,生殖過程也稱繁殖過程 生殖細胞的發(fā)生形成 交配 受精 合子形成 著床 胚胎形成及發(fā)育 分娩 哺乳,,,,,,,,外源化學物對生殖發(fā)育的影響,干擾生殖發(fā)育的任何環(huán)節(jié)，并造成損害作用。可以通過對內分泌系統(tǒng)，特別是對性腺的作用，發(fā)生間接的影響。神經系統(tǒng)對內分泌功能也有調節(jié)作用，通過下丘腦-垂體-睪丸軸(下丘腦-垂體-卵巢軸) 途徑作用于生殖發(fā)育過程 。,生殖毒性和發(fā)

2、育毒性常用的術語,1、生殖毒理學(reproductive toxicology)主要研究外源化學物對生殖細胞發(fā)生、卵細胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳過程的損害作用及其評定，評定方法即為生殖毒性試驗（繁殖試驗）。2、發(fā)育毒理學(developmental toxicology)主要研究外源化學物對胚胎發(fā)生、胎仔發(fā)育以及出生幼仔發(fā)育的影響及其評定，評定方法稱為發(fā)育毒性試驗，主要為致畸試驗。,生殖毒性和發(fā)育毒性常用的術語,3、胚胎毒性

3、 指化學物對胚胎的選擇毒 性作用。4、胚胎毒物 具有胚胎毒性的物質。5、致畸性 指胚胎在器官發(fā)育期接觸化 學物后，造成永久性結構或 功能畸形。,6、致畸劑 具有致畸性并使出生缺陷發(fā)生率明顯增加的物質。7、母體毒性 指對懷孕動物的毒性效應。8、發(fā)育毒性（developmental toxicity）指出生前后接觸外源性理化因素引起的在子代發(fā)育為

4、成體之前出現的任何對發(fā)育有害的表現，包括：結構畸形，生長遲緩，功能缺陷及死亡。發(fā)育毒物（developmental toxicant）能造成發(fā)育毒性的物質稱為發(fā)育毒物。通常指在未誘發(fā)母體毒性的劑量下產生發(fā)育毒性的物質。,,9、出生缺陷（birth defect） 是指嬰兒出生前即已形成的發(fā)育障礙，包括形態(tài)結構異常（畸形）和功能缺陷（如智力低下，代謝和行為的異常）。10、不良妊娠結局（adverse pregnancy outcom

5、e） 包括子代所有的不良結果：流產、死胎、死產、宮內生長遲緩、發(fā)育異常、新生兒和嬰幼兒期死亡等。,生殖毒性,外源化學物對生殖的過程的損害作用可以表現為性淡漠，性無能或各種形式的性功能減退。雌性可出現排卵規(guī)律改變，月經失調或失經，卵巢萎縮，受孕減少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等。雄性可表現為睪丸萎縮或壞死，精子數目減少。,男性生殖毒性,毒物可影響 精子的產生 精子輸送 神經系統(tǒng) 內分泌系統(tǒng)

6、,精子的產生過程,,特定靶位—睪丸內環(huán)境 與精子快速生成過程有關的細胞分裂和代謝活性，對某些類型的損傷特別敏感。 化學物特別容易損害DNA或影響快速生長組織需要的細胞蛋白功能或細胞呼吸。 DNA損害 蛋白質損傷,下丘腦-垂體-性腺軸激素調節(jié),下丘腦-垂體-性腺軸 雄激素 黃體生成素（LH） 促性腺激素釋放激素（GnRH）,,,女性生殖毒性,女性生殖系統(tǒng)的

7、功能,卵細胞毒性 阻滯原始卵母細胞，影響進一步的成熟和排卵。如抗癌藥--白消安。卵巢體細胞和生殖道毒性 卵巢體萎縮—環(huán)氧樹脂、呋喃妥因 輸卵管和子宮萎縮—鎘,女性生殖功能激素調節(jié)和相關毒性,下丘腦-垂體-性腺軸 促性腺激素釋放激素 （GnRH） 黃體生成素LH 促卵泡素FSH

8、 雌激素 孕激素,,生殖毒性的評價,外源化學物對生殖過程作用的評定主要通過生殖毒性試驗來進行。生殖毒性試驗可以全面反映外源化學物對性腺功能、發(fā)情周期、交配行為、受孕、妊娠過程、分娩、授乳以及幼仔斷乳后生長發(fā)育可能發(fā)生的影響。,生殖毒性的評價,評定的主要依據是交配后母體受孕情況（受孕率）、妊娠過程情況（正常妊娠率）、子代動物分娩出生情況（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及斷奶后發(fā)育情況等。,生殖毒性的評價

9、,試驗方法原則受試動物：性成熟大鼠、小鼠或家兔劑量分組:一般設立三個劑量組（至少兩個劑量組）和一個對照組染毒途徑:動物接觸受試物的方法應參照人類實際接觸途徑,生殖毒性的評價,動物數:每組雌雄各16到20只，或雌16到20只，雄8到10只給藥物時間：雄性交配前60天開始給藥，連續(xù)60天；雌性交配前14天給藥，連續(xù)14天。觀察交配后母體受孕情況（受孕率）、妊娠過程情況（正常妊娠率）、子代動物分娩出生情況（出生存活率）、授乳哺育（哺

10、育成活率）以及斷奶后發(fā)育情況等。,兩代一窩(和一代一窩)生殖試驗,繁殖試驗,觀察指標,受孕率（％）:反映雌性動物生育能力以及雌性動物受孕情況正常分娩率（％）:反映雌性動物妊娠過程是否受到影響幼仔出生存活率（％）:反映雌性動物分娩過程是否正常幼仔哺育成活率（％）:反映雌性動物授乳哺育幼仔的能力除上述４個指標外，還應該注意出生幼仔是否有畸形存在，對死亡的幼仔應進行畸形檢查，可為下一步致畸試驗提供參考,發(fā)育毒理學,發(fā)育毒理學（deve

11、1opmenta1 toxico1ogy）是研究發(fā)育生物體在受精卵、妊娠期、出生后、直到性成熟的發(fā)育過程中，由于出生前接觸導致異常發(fā)育的理化因素或環(huán)境條件后的發(fā)病機制（pathogenesis），和結果的學科。是毒理學的重要分支學科。,畸胎學,最早可以追溯到6500 D.B.。古希臘的名醫(yī)希波克拉底和亞里斯多德認為異常的發(fā)育可以被子宮內的創(chuàng)傷或應激的物理因素引起，母體的印象和情緒可以影響兒童的發(fā)育。隨著十六、十七世紀生物科學的興旺

12、發(fā)展，William Harvey于1651年提出了畸形起因于器官或結構的不完全發(fā)育的發(fā)育障礙學說，認為可解釋除遺傳起源以外的所有畸形。,現代實驗畸胎學,現代實驗畸胎學開始于十九世紀初，許多十九和二十世紀的胚胎學家，使用各種不同的物理（震動，倒置，針刺）和化學因素處理雞蛋，產生了畸形小雞，有神經管缺陷、無腦畸型、脊柱裂，獨眼畸型，心臟缺陷，位置顛倒和聯體雙胞胎。重要的是，他們注意到作用時間在決定畸形類型方面比損傷的性質更重要。,發(fā)育毒

13、理學,1935年，Hale第一次報道，維生素A缺乏誘導哺乳動物母豬產下包括突眼和顎裂的畸形后代。之后，許多飲食、環(huán)境因素（化學和物理因素），如：氮芥，錐藍，激素，抗代謝物，烷化劑，缺氧和x光的致畸作用被研究。 1941年，Gregg報告了母親風疹病毒感染在奧地利導致眼睛，心臟和耳缺陷以及智力發(fā)育延遲的發(fā)病率增加，并分析了與感染時間的關系。,發(fā)育毒理學,1961～1962年，西德的兒科病房中出現了大量罕見的短肢畸形兒，多數為四肢缺陷、無

14、眼、腭裂、骨骼發(fā)育不全，十二指腸和肛門閉鎖。同一時期，全球出現了5850個短肢畸形兒。McBride和Lenz在德國和澳洲的獨立研究，均確認反應停是其原因。反應停事件是人類歷史上的一個悲劇。但由此，促進了化學致畸的研究以及管理法規(guī)的建立。1966年美國FDA提出了三段生殖毒性試驗指南，包括了對致畸等發(fā)育毒性的評價。,短肢畸形兒,短肢畸形兒,人類不良生殖結局：,著床后的丟失（流產和死胎）估計為31 %；自發(fā)單一畸形大約<10‰

15、；嚴重畸形的總率在出生時約有2～3 %，到1歲時約6～7 %；出生缺陷有14 %；低出生體重7 %；l歲之前嬰兒死亡率1.4 %；神經功能異常占16～17 %；人類正常生育率只有50 %左右。,發(fā)育各階段發(fā)育毒性作用的特點,1.著床前期 又稱分化前期，從受精時算起，到完成著床之前。其期限在人類為d11～d12；嚙齒動物為前6d。受損的是相對未分化細胞，致胚泡死亡稱為著床前丟失（preimplantation loss）。

16、一般認為，此時很少發(fā)生特異的致畸效應。,發(fā)育各階段發(fā)育毒性作用的特點,2.器官形成期 著床后孕體即進入器官形成期，直到硬腭閉合。人是3周～8周。一般認為大鼠、小鼠、兔的著床時間為妊娠d6～d7天，硬腭閉合時間為妊娠d15～d18。器官形成期特別容易感受致畸物的作用而誘發(fā)器官結構的缺陷，即結構畸形，故又稱為致畸敏感期或致畸作用危險期（critical period）。此期以結構畸形最突出，也可有胚胎死亡、生長遲緩。,,,人胚胎主要器

17、官的致畸敏感期,妊娠3周時的胚胎,妊娠6周時的胚胎,發(fā)育各階段發(fā)育毒性作用的特點,3.胎兒期 器官形成結束（以硬腭閉合為標志）后即進入胎兒期（人類從d56～d58起），直到分娩。在胎兒期接觸發(fā)育毒物不良作用主要表現為：全身生長遲緩、特異的功能障礙、經胎盤致癌和偶見死胎。 免疫系統(tǒng)、中樞神經系統(tǒng)和生殖器官的功能異常，包括行為的，精神的，運動的缺陷和生殖力降低等。這些臨床表現需要出生后對子代的仔細觀察和測試才能發(fā)現。,妊

18、娠11周時的胎兒,妊娠18周時的胎兒,發(fā)育各階段發(fā)育毒性作用的特點,4.圍生期和出生后的發(fā)育期 圍生期從第二十六周至出生后4周，出生后的發(fā)育期 指出生后5周至成體。圍生期是一生中對致癌物最敏感的時期，許多兒童期高發(fā)的腫瘤（急性淋巴細胞性白血病、神經母細胞瘤、骶骨前畸胎瘤、胚性腺肌瘤等）都可能與出生前因素有關。妊娠期或圍生期接觸外源化學物，會嚴重影響出生后T細胞、B細胞和吞噬細胞的發(fā)育、遷移、歸巢和功能。

19、出生前后接觸具有發(fā)育神經毒性的化學物，表現為對感覺、運動、自主和認知的影響。,出生后,發(fā)育毒性的劑量-反應模式和閾值的概念,三 發(fā)育毒性劑量-反應（效應）關系十分復雜，并且因化學物的類型，暴露的時間和劑量而改變。致畸帶 指從NOAEL到胚胎死亡劑量之間的劑量范圍。,發(fā)育毒性的劑量-反應模式,主要有以下三類：1.除了在較高劑量幾乎全窩胚胎死亡外，正常胎、生長遲緩和結構畸形同時存在。 2.在遠低于胚胎致死劑量下即可出現致畸，甚至

20、全窩致畸。3.有生長遲緩和胚胎致死但沒有畸形發(fā)生。,閾值,哺乳動物的發(fā)育毒性通常被認為是一種閾值現象。假定的閾值是低于它有害的反應不會發(fā)生的母體的劑量。但是，發(fā)育毒性是否有閾值還有爭論。 是否產生畸形依賴于在致病過程中的每個步驟在損傷和修復之間的平衡。,發(fā)育毒性的物種差異,物種差異以及個體差異在致畸作用中較為明顯。同一物質在不同動物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的類型也不一致。種間差異即同一物種中不同品系之間存在的差異，在致

21、畸作用中也極明顯。,母體毒性（materna1 toxicity）與發(fā)育毒性,母體毒性 是指化學毒物對孕母產生的損傷作用，表現為增重減慢、功能異常、臨床癥狀，甚至死亡。目前常常用增重減慢和死亡率來表示。發(fā)育毒性可能是直接對孕體的效應或間接通過對母體及胎盤的毒性，以及直接、間接效應的組合毒性。,母體毒性與胚胎毒性的關系,①具有發(fā)育毒性，但無母體毒性。表示致畸作用有特定的機理，與母體毒性無關。如反應停。這類化學物最容易被忽視也最危險。

22、②出現發(fā)育毒性也出現母體毒性：尤其是當發(fā)育毒性只在母體毒性存在時才能被觀察到的時候，發(fā)育效應可能是間接的，往往不具有特定的致畸機理。如乙醇和可卡因，主要在母體毒性水平對胚胎/胎兒有有害影響，他們的發(fā)育毒性可能部份歸咎于母體生理學的紊亂的繼發(fā)效應。,母體毒性與胚胎毒性的關系,③具有母體毒性，但不具有致畸作用：這類物質在妊娠期很容易引警覺，避而遠之。④在一定劑量下，既無母體毒性，也不表現發(fā)育毒性。,致畸（發(fā)育毒性）作用機制,1.基因突變與

23、染色體畸變 2.干擾基因表達3.細胞損傷和死亡4.干擾細胞-細胞交互作用 5.通過胎盤毒性引起發(fā)育毒性 6.干擾母體穩(wěn)態(tài),發(fā)育毒性和致畸作用試驗與評價,一 動物發(fā)育毒性試驗已為國際接受的試驗程序——生殖毒性的ICH三階段實驗指南。提供了動物種/系選擇，給藥途徑，劑量水平，給藥次數和間隔，暴露期間，實驗的樣本大小，觀察技術，統(tǒng)計分析和報告要求的指南。,發(fā)育毒性和致畸作用試驗與評價,三階段試驗：I階段試驗：檢測對生殖能力、早

24、期胚胎發(fā)育的影響（一般生殖毒性試驗）；染毒 雌雄性交配前-受孕-雌性受精-雌性著床期間；觀察 受試物對成年雌雄性的生殖功能、配子的發(fā)生及成熟、交配行為、受精、著床前的發(fā)育和著床的影響。,受精過程,發(fā)育毒性和致畸作用試驗與評價,II階段試驗：檢測對胚胎和胎兒發(fā)育的影響（致畸試驗） ；染毒 從著床-硬腭閉合期間；觀察 受試物對成年雌性生殖功能、胚胎發(fā)育、器官形成期的發(fā)育毒性。,致畸試驗,動物選擇: 致畸試驗的動

25、物選擇，除參照毒性試驗中選擇動物的一般原則，即食性和對受試物代謝過程與人類接近，體型小，馴服，容易飼養(yǎng)和繁殖及價廉外，還應特別注意妊娠過程較短、每窩產仔數較多和胎盤構造及厚度與人類接近等特點。多選擇小鼠或大鼠。,致畸試驗,劑量分組一般應先進行預試，目的是找出引起母體中毒的劑量。最少設3個劑量組，另設對照組。原則上最高劑量組，可以引起母體輕度中毒，即進食量減少、體重減輕、死亡不超過10%。最低劑量組不應觀察到任何中毒癥狀；中間劑量組可以

26、允許母體出現某些極輕微中毒癥狀。其劑量與高劑量和低劑量成等比級數關系。一般最高劑量不超過LD50的1/5～1/3，低劑量可為1／100～1／30。,致畸試驗,動物交配處理每組動物大鼠或小鼠為12～20只，家兔8～12只，狗等大動物3～4只。性成熟雌雄動物按雌雄l：1或2：1比例同籠交配。每日將已確定受孕雌鼠隨機分入各劑量組和對照組。出現陰栓或精子之日即為受孕0日，也有人作為第1日。致畸作用有極為明確的敏感期，應精確掌握動物接觸受

27、試物的時間，必須在器官發(fā)生期。,致畸試驗,胎仔檢查自然分娩前1-2日將受孕動物處死，剖腹取出子宮及活產胎仔，并另行記錄死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19-20天，小鼠第18-19天，家兔在第29天。,致畸試驗,下列幾方面進行畸形檢查：外觀畸形肉眼檢查，例如露腦；肉眼檢查內臟及軟組織畸形，例如腭裂；骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損，分叉肋等?；螜z查只限活產胎仔。,致畸試驗,結果評定活產幼仔平均畸形出現數:即根據出現的畸形總數，計

28、算每個活產幼仔出現的畸形平均數?；纬霈F率:即作為畸胎的幼仔在活產幼仔總數中所占的百分率。母體畸胎出現率 :即出現畸形胎仔的母體在妊娠母體總數中所占的百分率。,致畸試驗,確定受試物是否具有致畸作用時需注意以下幾點：任何結果必須通過統(tǒng)計計算方法進行劑量組與對照組對比；必須具有統(tǒng)計學意義才能認為是陽性結果.應該掌握所用實驗動物品系的自然畸形發(fā)生率。致畸作用中動物物種和品系差異較為顯著，因此要求在兩種動物進行試驗。由于物種差異，對

29、動物不具有致畸作用的外源化學物對人是否致畸的問題，應格外認真對待。,發(fā)育毒性和致畸作用試驗與評價,III階段試驗：檢測對出生前后及哺乳期發(fā)育的影響（圍生期毒性試驗）；染毒 孕母從著床到幼仔斷乳期間；觀察 從著床到子代性成熟的母體生殖毒性（成年雌性生殖功能：妊娠、分娩和哺乳）和子代的發(fā)育毒性（胚胎、胎兒生長發(fā)育，新生幼仔宮外生活的適應性，斷乳前后的生長發(fā)育，獨立生活能力和成熟的性功能）。,發(fā)育毒性和致畸作用試驗與評價,二 流行病

30、學研究和人類的證據可以用流行病學方法來研究環(huán)境發(fā)育毒物對人類發(fā)育的影響，包括其性質、程度以及原因。 要發(fā)現危險的增加，需要正確發(fā)現異常結局和暴露，需要足夠大的效應和研究人群。病例報告和出生缺陷監(jiān)測登記對獲得對人類的發(fā)育毒性證據是有用的。,發(fā)育毒性和致畸作用試驗與評價,美國FDA(l979)對于藥物在妊娠期的使用用字母A，B，C，D和X來進行等級評定 A類表示，在妊娠人群中控制良好的研究未能證實有危險。X類表示在妊娠期用藥是不當

31、的。 C類，表示危險不能夠被排除。 B和D分別代表與危險的關系相對地較小，或較大。,Wilson 曾提出確認人類新的致畸物的標準：,1.某種特異的缺陷或幾種缺陷綜合癥的發(fā)病率突然增加； 2.缺陷的增加與某種已知的環(huán)境改變，如某種新藥的廣泛使用巧合； 3.已知在妊娠的特殊階段接觸環(huán)境的改變，產生有特征性的缺陷綜合征； 4.缺少妊娠時引起特征性缺陷嬰兒產生的其他普通因子。,發(fā)育毒性和致畸作用試驗與評價,三、發(fā)育毒性的替代試驗 1