第十二章核素示蹤原理及實驗設(shè)計

1、1,第十二章核素示蹤原理及實驗設(shè)計,第一節(jié)、核素示蹤原理,2,一、核素示蹤原理及應(yīng)用（ Tracer Experiments ),1.核素示蹤法: 利用核素作為示蹤劑（tracer)而建立起來的一種微量研究方法，用于觀察物質(zhì)動態(tài)變化。,3,要點：一般示蹤實驗均采用核素極其標記物作示蹤劑，所以一般認為的示蹤實驗是指核素示蹤實驗,,,觀察對象：元素、 化合物、細胞、寄生蟲,,,加上標記：Labeling,,引入到待研究系統(tǒng)（整體、離體細胞

2、、無細胞系統(tǒng)）,,觀察該標記物的去向（部位、數(shù)量、時相）,,了解被標記物的運動轉(zhuǎn)化規(guī)律：吸收、分布、排泄、轉(zhuǎn)運、代謝,4,原理：兩個基本點,核素（放射性與穩(wěn)定核素）極其標記物雖與自然界存在的相對應(yīng)的同位素和化合物的物理性質(zhì)不同，卻具有相同的化學性質(zhì)和生物特性。進入機體后,在機體內(nèi)所發(fā)生的化學變化或生物學過程與被示蹤的物質(zhì)相同。,放射性核素—衰變—射線---測出穩(wěn)定性核素---質(zhì)量不同---質(zhì)量分析器---檢出,5,3. 應(yīng)用及意義：

3、,核素示蹤廣泛用于基礎(chǔ)醫(yī)學、臨床醫(yī)學、生物學、法醫(yī)學、藥物學和計劃生育等等各方面。,6,4.示蹤法的特點,核素作為標記的特點：示蹤工作對標記基本要求為：制成的標記物必須與被示蹤對象有相同的生物學行為-----代表性+本身的特征-----易檢測到標記,化學基團熒光基團酶分子,,有各自的特點與用途,但對于示蹤實驗來說（體內(nèi)）---會對原分子造成較大的分子結(jié)構(gòu)上的變化-------導致結(jié)論的不可靠,7,可選用核素進行示蹤實驗，特點

4、：,靈敏度高----10-14-10-18g水平，（化學： 10-12水平，對微量物質(zhì)的定量分析有特殊價值。測量方便----衰變不受外力影響，不受雜質(zhì)干擾，不用提純待測物----可直接測量。合于生理條件----示蹤物劑量可以是生理水平，不干擾破壞機體的生理平衡?？梢远ㄎ?--- 器官、細胞、亞細胞水平。,8,穩(wěn)定核素示蹤的特點,無輻射危害不衰變、不分解無化學毒對標記原子的位置及結(jié)構(gòu)可以定位及分析缺點：操作人員的培訓、儀器的

5、昂貴、同位素效應(yīng)。,9,二、示蹤劑tracer,是一些有特殊標記的、很容易被測定的核素及其化合物。分為：放射性和穩(wěn)定核素標記物,10,三、示蹤研究的基本類型,物理示蹤：所用的放射性標記物不是作為體內(nèi)某一特定物質(zhì)的示蹤物，而是追蹤物，不參與化學反應(yīng)與代謝----研究其重量及物理變化。,化學示蹤：用于追蹤某種物質(zhì)在體內(nèi)或培養(yǎng)體系內(nèi)的復(fù)雜的生物學、化學行為。示蹤標記物：可以是待測物、也可以是待測物的前體物，結(jié)構(gòu)與生物學特性相同或相近。,1

6、1,第二節(jié)、示蹤實驗設(shè)計,基本程序-------- 實驗的準備階段 ---------- 正式實驗階段 ----------- 實驗總結(jié)階段 ------------ 實驗的善后處理階段,12,實驗的準備階段,對使用的示蹤劑、研究對象、探測儀器、實驗用具、收集、實驗場所、安全防護等條件進行準備------通過預(yù)實驗檢察和完善這些條件----

7、---甚至冷實驗來掌握與熟悉實驗過程，并完善實驗設(shè)計。為實驗成功的基礎(chǔ)。,13,正式實驗階段,是實驗研究計劃與設(shè)計實施、完成的階段-----按具體的實驗計劃進行-----作好記錄-----步驟、結(jié)果、意外。,14,實驗總結(jié)階段,按照設(shè)計的要求認真檢查與歸納原始的資料，使其系統(tǒng)化、條理化------清除、減少由于整理數(shù)據(jù)引入的誤差-----統(tǒng)計----結(jié)論。,15,實驗的善后處理階段,示蹤實驗不同于一般實驗，尤其是放射性示蹤實驗，產(chǎn)生的

8、各種放射性廢物必須妥善處理，要嚴格按照放射性廢物處理的國家規(guī)定來執(zhí)行，嚴防事故發(fā)生。,16,2.示蹤實驗設(shè)計的基本要求,①放射性示蹤實驗的 基本要求②穩(wěn)定性核素示蹤實驗的 基本要求,17,放射性示蹤實驗的 基本要求,A.放射性核素的選擇：實驗要求+核素性質(zhì)基本原則 輻射類型：?衰變核素、?-和? 半衰期：適當?shù)陌胨テ?，長要滿足實驗過程短要便于處理要考慮生物半衰期 1/Te=1/Tp+1/Tb如果Tp 與Tb 相差20

9、倍以上時， Te約為其中的較短的半衰期,18,,B.放射性核素標記的位置研究物質(zhì)轉(zhuǎn)運規(guī)律-----去向---標記原子要牢固，位置不要求。研究某個基團的變化代謝時------標記于特定的基團上。,19,,C.示蹤劑的要求有足夠的放射性核素純度>98%放射化學純度>95%放射性比活度高、無載體,20,,D.示蹤劑劑量的選擇,標記物的放射性比活度放射性核素的 半衰期標記物在被觀察系統(tǒng)中被稀釋的程度標記物在被觀察

10、系統(tǒng)內(nèi)的利用率標記物在被觀察系統(tǒng)內(nèi)分布、排泄特點實驗周期、儀器的探測效率示蹤劑的化學毒性（安全劑量）要求：稀釋后，樣品的脈沖計數(shù)率>5倍本底 >B小動物7.4—18.5KBq(0.2—0.5uCi) 可達370KBq（10uCi）離體<37KBq（1uCi）,21,例,主要觀察組織中標記物的分配約為輸入總量的1%，要觀察10天，估計在此期間標記物從該組織消失量為最初的

11、90%，取組織為該組織的10%，測量上可知最小可測的放射性=500 DPM，估算所需劑量。,22,,10%組織：500DPM*100/10=500090%消失：5000/10%=50000（開始事該組織的總放射性）1%的分配量：50000/1%=5000000 DPM=2.25uCi=83.5KBq,23,,F.示蹤劑給予途徑：口、腹腔、皮下、肌注、靜脈滴注、靜脈一次性推注G.樣品的采集與制備：代表性、污染的防止H.測量方法的選

12、擇： ? NaI 晶體閃爍計數(shù)器，32P-----G-M管，3H和14C-----液閃和核乳膠.,24,穩(wěn)定核素實驗的基本要求,核素選擇：2H，13C，15N，18O示蹤劑量：劑量大，可達化學劑量豐度：較高的豐度的示蹤物,25,二、示蹤實驗的實驗方法,離體實驗；從整體分離出來的簡單系統(tǒng)：細胞株，無細胞酶系統(tǒng)，短期培養(yǎng)的細胞懸液，切片、器官灌注。用途：揭示物質(zhì)轉(zhuǎn)化規(guī)律，精細的結(jié)構(gòu)與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及攝取的關(guān)系，是物質(zhì)代謝、受體配體

13、研究的首選。,整體實驗：將示蹤物引入完整的機體內(nèi)，從體外觀察或定期取標本觀察標本的去向，以了解物質(zhì)在體內(nèi)的運動轉(zhuǎn)化規(guī)律。用途：研究物質(zhì) 的吸收、分布、轉(zhuǎn)運和排泄等或?qū)δ承┢鞴俚墓δ苎芯俊Ｄ芊从硻C體的實際生理情況—作離體實驗驗證。,26,,優(yōu)點：1.系統(tǒng)簡單，示蹤物極其轉(zhuǎn)化物濃度不會遇到轉(zhuǎn)運排泄等復(fù)雜因素的影響，對結(jié)果的分析比較單純，靈敏度也高。2.實驗條件可以人為加以控制，便于進行各種精細的分析性研究缺點：實驗條件與整體差別大，得出

14、的結(jié)論不一定反映實際情況，要用整體實驗驗證。,優(yōu)點：能反映機體的實際生理情況—作離體實驗驗證。缺點：不精細,27,離體實驗,恒量標記實驗：在實驗中加入過量的示蹤劑，實際示蹤劑消耗量小，在整個實驗中，示蹤劑濃度變化小。不須考慮示蹤劑的濃度變化。DNA合成,脈沖標記實驗只允許被研究系統(tǒng)與示蹤劑接觸短暫時間，隨后將示蹤劑除去，再繼續(xù)觀察。常用于細胞的 增殖動力學研究，活性肽的代謝研究。,28,整體實驗的給藥途徑,如研究吸收途徑，則選擇不同

15、途徑給予示蹤物。一般采用靜脈注射（小動物可腹腔注射）又分為一次性快速推注和恒速滴注。,29,,靜脈注射方式分一次性快速注射和恒速滴注兩種。示蹤劑的濃度在血液和組織或代謝物中都呈現(xiàn)出時相變化（圖12·1，圖12·2），這是機體內(nèi)復(fù)雜代謝過程綜合影響的結(jié)果；血液中示蹤物的濃度不僅取決于它的吸收，也取決于它在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化和排泄。,圖12-1 靜脈一次性快速注射放射性示蹤劑在血液（—·—）、組織（－－－）、代謝

16、物（……）中的時相變化,圖12-2 靜脈恒速滴注放射性示蹤劑在血液（—·—）、組織（－－－）、代 謝物（……）中的時相變化,30,整體實驗特點,整體實驗的結(jié)果是一個綜合性的結(jié)果血漿中示蹤物濃度取決于：代謝轉(zhuǎn)化、排泄、體內(nèi)的反饋組織中的示蹤物的濃度取決于組織攝取、代謝和釋放的速度，血中示蹤物濃度。研究代謝轉(zhuǎn)化速度時，必須同時考慮標記前身物和標記物的比活度，前者對后者有直接的影響。,31,三、示蹤實驗資料的整理與分析,一般而

17、言，須在確保標記物起到真正的示蹤作用，量具與探測儀器精度高，嚴格控制各種變異因素和測量數(shù)據(jù)可靠的前提下，才能對示蹤實驗資料進行統(tǒng)計分析處理。注意：兩個計數(shù)率的顯著性檢驗 可疑值的舍取 誤差傳遞,32,四、數(shù)據(jù)表示方法的選擇,整個臟器的總放射性活度放射性含量dpm/mg or ml組織或體液比活度dpm/mmol or mg化合物相對比活度：兩個解剖部位中同一化合物比活度的比值，兩種化合

18、物（前身與產(chǎn)物）的比活度的比值（或豐度）。,33,第三節(jié)、雙標記示蹤實驗,原理與用途用同種或不同種的核素標記同種分子不同部位或不同種分子進行示蹤實驗，追蹤不同的標記原子得到所需的信息。,34,,,含示蹤物A的標本中加入示蹤物B，活度為DB,勻漿、提取、制樣,雙標記測量，測得活度DA’和DB’,標本中示蹤物A的活度DA=DA’/回收率（%）,回收率（%）=DB’/DB,,,,,35,用途：在物質(zhì)代謝中的應(yīng)用廣泛,研究分子內(nèi)兩部分的代謝規(guī)

19、律研究同種分子處于不同形態(tài)時的運動轉(zhuǎn)化規(guī)律（在同一動物個體或試管中進行使 各種動物個體差異減至最?。２煌镔|(zhì)運動轉(zhuǎn)化規(guī)律的比較觀察,36,雙標記示蹤實驗的設(shè)計,標記化合物：一般不要單分子內(nèi)雙標記化合物，而要兩種單標記物混和作雙標記物的示蹤劑，成對的核素有：3H----14C，3H、14C---32P， 32P—45Ca,3H、14C、32P---125I，24Na—36Cl,55Fe—59Fe,125I—131I，放射性---穩(wěn)定

20、同位素一般要求：能量可以區(qū)分開,37,示蹤劑劑量的配比,兩種標記放射性核素發(fā)出的能量不同按照兩種放射性核素各自的探測效率不同和在體內(nèi)消失的速度估算所需用量要預(yù)實驗驗證,38,雙標記測量,液體閃爍測量----能閾的不同雙標記不同的半衰期核素射線種類不同穩(wěn)定核素,39,第四節(jié)、同位素效應(yīng)Isotope effect,概念：由于同位素質(zhì)量的不同而引起的物質(zhì)反應(yīng)速度的變化稱為同位素效應(yīng).一般1H、2H、3H同位素效應(yīng)強，質(zhì)量差別大。

21、,40,同位素效應(yīng)的類型,初級同位素效應(yīng)primary isotope effect：同位素所在斷裂而產(chǎn)生的效應(yīng)，嚴重。次級同位素效應(yīng)secondary isotope effect: 同位素所在部位的鄰近化學鍵發(fā)生斷裂。溶液同位素效應(yīng)：溶液中某種原子被其同位素取代，引起反應(yīng)速度下降。H2O—D2O,41,生物體系中的同位素效應(yīng),整體和離體中均存在同位素效應(yīng)20-30%D2O養(yǎng)動物-----病理變化30-35% D2O養(yǎng)動物--