電泳技術(shù)的臨床應(yīng)用完整版

1、現(xiàn)代電泳技術(shù)的臨床應(yīng)用,Sebia,廈門(mén)市第二醫(yī)院 王友祥,使用范圍和檢測(cè)原理,電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下, 由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小, 形狀等性質(zhì)的差異, 使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度, 從而對(duì)樣品進(jìn)行分離, 鑒定或提純的技術(shù).在生化檢測(cè)中, 主要用于分離各類蛋白分子.,發(fā)展歷程,1809年俄國(guó)科學(xué)家列伊斯首先發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象1937年瑞典科學(xué)家Tiselius建立了界面電泳技術(shù), 并首次證明了血清是

2、由白蛋白及α, β, γ球蛋白組成的因此獲得1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng).1950年后, 區(qū)帶電泳從發(fā)展到成熟. 1980年以來(lái), 毛細(xì)管電泳逐漸受到重視,常用的電泳技術(shù),濾紙電泳醋酸纖維素薄膜電泳凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 : 瓊脂糖凝膠適用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳支持介質(zhì), 成本低, 結(jié)果易保存.聚丙烯酰胺凝膠電泳 : 最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方法, 特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量, 一般用于科研.毛細(xì)管電泳 :經(jīng)典電

3、泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物,電泳技術(shù)的醫(yī)學(xué)應(yīng)用,蛋白質(zhì)電泳分析是實(shí)驗(yàn)室必備的檢測(cè)手段, 可全面精確, 描繪出患者蛋白質(zhì)的全貌. 對(duì)疾病的早期診斷, 療效觀察及預(yù)后判斷具有非常重要的臨床價(jià)值.,蛋白的電泳檢測(cè),根據(jù)使用的染料或者是底物的不同，我們可以檢測(cè)到不同類型的蛋白: 血清蛋白 脂蛋白(運(yùn)送脂類) 各種酶類血紅蛋白,電泳技術(shù)在臨檢中的應(yīng)用,急,慢性炎癥造血系統(tǒng)疾病: 多發(fā)性骨髓瘤, 巨免

4、疫球蛋白血癥腎臟疾病肝臟疾病中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病: 多發(fā)性硬化癥,遺傳性疾病: 地中海貧血代謝性疾病: 糖尿病心血管疾病: 心梗,動(dòng)脈粥樣硬化惡性腫瘤,正確解釋電泳結(jié)果為臨床對(duì)疾病的判斷提供可靠參考,血清蛋白電泳,蛋白染色,血清蛋白電泳后會(huì)呈現(xiàn)出5 或者 6 條帶.染色后,每個(gè)條帶呈現(xiàn)出的不同程度的染色對(duì)應(yīng)著各自的蛋白濃度.如何檢測(cè)染色程度: 需要使用光密度儀.,正常的電泳圖譜,出現(xiàn)單克隆免疫球蛋白的電泳圖譜,蛋

5、白電泳檢測(cè)的不同步驟,制備膠片,加樣,啟動(dòng)電源,開(kāi)始電泳,染色, 脫色,結(jié)果檢測(cè),血清蛋白電泳的目的是什么?,檢測(cè)異常 :含量的變化 : 條帶中蛋白含量的增加或減少性質(zhì)的變化 : 異常條帶的出現(xiàn),臨床意義,將電泳作為常規(guī)檢測(cè)之一, 基于蛋白含量的變化, 有助于我們對(duì)以下疾病的篩查 :炎癥 營(yíng)養(yǎng)不良肺氣腫,臨床意義,對(duì)異常條帶的篩查,有助于我們檢測(cè)下列疾病: 骨髓瘤 巨球蛋白血癥

6、(Waldenstrom)細(xì)菌和病毒感染在這些情況下, 必須要做其他輔助測(cè)試, 比如說(shuō)免疫固定, 使用不同類型的抗血清對(duì)異常蛋白進(jìn)行檢測(cè). (對(duì)于后期治療有很重要的指導(dǎo)意義),電泳結(jié)果的臨床應(yīng)用及常見(jiàn)電泳結(jié)果分析,電泳檢測(cè),什么情況下必須進(jìn)行電泳檢測(cè)?,A/G比例變化血

7、液沉降速度發(fā)生異常變化出現(xiàn)惡性疾病征兆在免疫球蛋白定量檢測(cè)中發(fā)現(xiàn) 某一種免疫球蛋白出現(xiàn)大量異常增加,電泳區(qū)帶分析,,雙白蛋白,或者一條寬峰,或者在白蛋白條帶出現(xiàn)附屬條帶可能是由以下原因造成 :遺傳性雙白蛋暫時(shí)性的雙白蛋白血癥可能是由于藥物刺激導(dǎo)致的急性胰腺炎導(dǎo)致的雙白蛋白血癥 : 大量的胰酶的出現(xiàn)可以導(dǎo)致白蛋白降解,白蛋白區(qū)帶,雙白蛋白血癥,雙白蛋白血癥,在下列情況下白蛋白會(huì)出現(xiàn)下降 :- 腎病綜合癥, 蛋白流失,

8、 胃腸病: 檢查尿蛋白- 淋巴細(xì)胞增生綜合征- 營(yíng)養(yǎng)不良- 肝臟功能不全- 慢性炎癥- 嚴(yán)重?zé)齻? 血液稀釋,在下列情況中白蛋白會(huì)出現(xiàn)增加:- 脫水癥狀- 血液濃縮- 白蛋白注射,Alpha 1 globulins(α1球蛋白區(qū)帶),將會(huì)在下列情況下出現(xiàn)下降:- 蛋白流失- 肝功能不全- 先天性抗胰蛋白酶缺乏癥出現(xiàn)兩個(gè)條帶:- 抗胰蛋白酶的不同基因型出現(xiàn)

9、增加:- 炎癥癥狀,,A1AT不同的基因型,A1AT 等電聚焦電泳,急性炎癥電泳圖譜,Alpha 2 globulins(α2球蛋白區(qū)帶),下列情況中出現(xiàn)下降:- 肝功能不全- 血管內(nèi)溶血,出現(xiàn)兩個(gè)條帶:- 溶血標(biāo)本 (結(jié)合珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合體)- 結(jié)合珠蛋白不同基因型- 出現(xiàn)單克隆免疫球蛋白(帶有大量負(fù)電荷) *Alpha 2條帶在電泳圖譜中,是一個(gè)很特殊的條帶. 因?yàn)檫@一條帶中含

10、有五種蛋白: HDL, Haptoglobin, Alpha 2 Macroglobulin, Ceruloplasmin and Gc globulin. 由于結(jié)合珠蛋白有不同的基因表現(xiàn)型, 增加了這一條帶的復(fù)雜程度. 結(jié)合珠蛋白非?？拷麬lpha 1條帶; 出現(xiàn)溶血時(shí)結(jié)合珠蛋白的遷移率會(huì)發(fā)生改變. 同時(shí),由于HDL的含量或者是存放過(guò)久的標(biāo)本, HDL的遷移速度可能會(huì)更快.,溶血的標(biāo)本,出現(xiàn)在a2區(qū)域的單克隆免疫球蛋白,下列情況下A

11、lpha2區(qū)域會(huì)出現(xiàn)增加現(xiàn)象: - 炎癥癥狀- 腎病綜合征- 出現(xiàn)游離輕鏈,腎病綜合征,Beta globulins(β球蛋白區(qū)帶),在下列情況下會(huì)出現(xiàn)下降 :- 肝功能不全- C3 長(zhǎng)期缺乏 或者 C3 代謝過(guò)快 (also in aging sample,C3 denaturation, splitted in up to 4 fractions: 1 between a

12、2 and b, 1 on b1, 1 on b2 and 1 on g),在下列情況下會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)條帶:- 長(zhǎng)期存放的標(biāo)本或者是高膽固醇的標(biāo)本, LDL 有不同的遷移率; 從而導(dǎo)致LDL電泳是偏移 Beta位置,Beta球蛋白在下列情況下會(huì)出現(xiàn)增加現(xiàn)象:- 膽管阻塞- 腎病綜合征- 肝硬化- 缺鐵性貧血- 血球蛋白異

13、常- 高脂蛋白血癥- 大量溶血,β 脂蛋白,,,,酒精性肝硬化中的β-γ 橋,,,出現(xiàn)在 b 區(qū)域的單克隆免疫球蛋白,游離輕鏈病,Gamma globulins (免疫球蛋白區(qū)帶),在下列情況中會(huì)出現(xiàn)下降現(xiàn)象: - 部分的或全部的免疫缺陷- 免疫抑制治療- 游離輕鏈病或非分泌型骨髓瘤,低免疫球蛋白血癥,多克隆免疫球蛋白的增加:- 炎癥- 肝硬化- 亞急性和慢性感染 檢測(cè)到其他條帶

14、- 單克隆免疫球蛋白- 寡克隆免疫球蛋白,,,高免疫球蛋白血癥,血清蛋白021216－狼瘡病,血清蛋白030127－酒精肝B-r橋,,微量單克隆免疫球蛋白,,大量單克隆免疫球蛋白,,雙克隆免疫球蛋白,與下列各類疾病相關(guān)的寡克隆免疫球蛋白(多個(gè)條帶) :- 自身免疫病- 先天性免疫缺陷癥- 病毒感染 (C Hepatitis, HIV disease, CMV(巨細(xì)胞病毒), EBV,…)- 免疫抑制治療,Oligo

15、clonal pattern(寡克隆免疫球蛋白),血清蛋白電泳是 M蛋白 (Monoclonal Protein) 多克隆 (polyclonal Protein) 寡克隆 (Oligoclonal Protein) 的首選檢測(cè)項(xiàng)目,什么是M蛋白,M蛋白疾病(Monoclonal gammapathies, MG)是由于單一克隆漿細(xì)胞無(wú)限增殖產(chǎn)生的均一單克隆蛋白(Monoc

16、lonal-proteins)所導(dǎo)致的一組疾病M蛋白疾病的“M”含義是Myeloma, Macroglobulinemia, Malignant lymphoma和Monoclonal Gammapathies均以“M”開(kāi)頭. M蛋白在電泳上表現(xiàn)為高而狹窄的尖峰.,表1 646例M蛋白類型分類型別 例數(shù) %IgG型骨髓瘤 205 31.73IgA型骨髓瘤

17、 93 14.40IgM型骨髓瘤 56 8.67IgD型骨髓瘤 12 1.86重鏈病 5 0.77輕鏈病 214 33.13半分子病 1 0.157S IgM 2

18、 0.31BMG 49 7.59雙M蛋白病 8 1.24,多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM),MM是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤,占整個(gè)惡性腫瘤的1%常見(jiàn)于中、老年人(50-70歲居多,40歲以下少見(jiàn)).以往對(duì)此病認(rèn)識(shí)不足，漏診、誤診可達(dá)到70%以上.隨著壽命的延長(zhǎng)對(duì)此病認(rèn)識(shí)的提高病例數(shù)顯著增加.,MM臨床表現(xiàn)特點(diǎn),骨痛,骨骼

19、腫塊與病理性骨折,骨質(zhì)疏松和溶骨現(xiàn)象貧血免疫功能低下,反復(fù)感染腎臟損害高鈣,高粘(血漿相對(duì)黏度6以上)高尿酸血癥表現(xiàn)MM的臨床表現(xiàn)多樣化,常常因此就診于骨科、腎臟內(nèi)科等,延誤診治,多發(fā)性骨髓瘤的免疫學(xué)特征,血中出現(xiàn)M蛋白,正常Ig水平明顯減低尿中出現(xiàn)M蛋白和輕鏈蛋白(BJP)骨髓中漿細(xì)胞明顯增加無(wú)免疫活性Ig導(dǎo)致免疫功能低下,多發(fā)性骨髓瘤病人溶骨報(bào)告(骨盆),多發(fā)性骨髓瘤病人溶骨報(bào)告,多發(fā)性骨髓瘤病人溶骨報(bào)告(顱骨)

20、,臨床實(shí)例,意義未明的單克隆免疫球蛋白疾病: Benign MC在法國(guó),在對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行檢測(cè)時(shí),會(huì)檢測(cè)到0,15% 比例的單克隆免疫球蛋白攜帶者. 在老齡人群中檢測(cè)到的攜帶者比例更高 (80歲以上人群). 在對(duì)60到99歲人群的檢測(cè)顯示, 出現(xiàn)Ig的比例從2,6%上升至19,2%.(平均值= 5%),MGUS,MGUS攜帶者特征: -未出現(xiàn)臨床和影像學(xué)特征-未出現(xiàn)不良反應(yīng), 未檢測(cè)

21、到血鈣升高,也未出現(xiàn)腎功 能衰竭-未見(jiàn)骨髓瘤的臨床特征-單克隆免疫球蛋白 < 20g/l -其他免疫球蛋白都是正常的,同時(shí)在患者尿液中未檢測(cè)到本周氏蛋白-單克隆免疫球蛋白的濃度隨著時(shí)間的推移未發(fā)生增 加現(xiàn)象-其他的免疫球蛋白的濃度也未隨時(shí)間推移而出現(xiàn)下降,?在20%的情況中, MGUS 將會(huì)轉(zhuǎn)化成惡性疾病 (6-10 years),Kyle report顯示,通過(guò)對(duì)

22、1384名含有MGUS的患者的 20–35(average : 22 years)年的跟蹤監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn), 24%的患者最終演變成惡性的淋巴細(xì)胞增生癥(multiple myeloma, macroglobulinemia, amyloidosis,…).從檢測(cè)到單克隆免疫球蛋白,直到作出多發(fā)性骨髓瘤的診斷報(bào)告,這段時(shí)間是不定的,從2-29年(平均是10年左右).,大量報(bào)告顯示,在下列情況中,發(fā)展成為惡性淋巴細(xì)胞增生疾病的可能性很小 :

23、- 單克隆免疫球蛋白: IgG < 15 g/L IgA < 10 g/L IgM < 5 g/L- 尿蛋白中未出現(xiàn)本周氏蛋白- 其他類型的免疫球蛋白未出現(xiàn)下降,寡克隆免疫球蛋白,由于藥物原因?qū)е碌拿庖呷毕?- 在器官或者骨移植之后 - 自身免疫病: (類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎, 干燥綜合征(66%), 系統(tǒng)性紅斑狼瘡…

24、.) 由于細(xì)菌或病毒感染導(dǎo)致的免疫缺陷:- 病毒 : HIV (63%), EBV, CMV, viral hepatitis,…- 細(xì)菌,寄生蟲(chóng)感染: (腦膜炎, 腦炎,…),在一些腫瘤中: (慢性淋巴細(xì)胞性白血病CLL: 29%) 在5 % 正常群體中 (MGUS) 在多發(fā)性硬化患者中: (CSF 90%),檢測(cè)結(jié)果闡述,電泳的結(jié)果是以%的形式給出的, 但是對(duì)于臨床診斷, 結(jié)果必須要以濃度的形式給出g/L

25、蛋白濃度出現(xiàn)異常時(shí),必須要進(jìn)行其它的補(bǔ)充檢測(cè),患者的隨訪,首次被發(fā)現(xiàn)的患者:如果檢測(cè)到的異常M蛋白峰值不多, 同時(shí)其他免疫球蛋白的含量未發(fā)生變化,也沒(méi)有臨床癥狀, 懷疑可能是 MGUS,第一年每4 至 6個(gè)月對(duì)患者經(jīng)性隨訪,從第二年起, 每年進(jìn)行一次隨訪.,已確診的患者: 如果電泳結(jié)果和先前檢測(cè)相同, 利用異常峰值進(jìn)行量化以便于檢測(cè)異常M蛋白的濃度是否發(fā)生變化. 這種情況下的隨訪檢測(cè),一定要選擇相同的技術(shù)

26、方法. 如果隨訪結(jié)果顯示出現(xiàn)異常區(qū)帶, 一定要進(jìn)行免疫固定電泳確認(rèn)這些異常蛋白的成分.,Ig G l單克隆免疫球蛋白(近正極端),Ig G k 單克隆免疫球蛋白, 伴隨有k 型游離輕鏈,,本周氏蛋白檢測(cè),BENCE JONES蛋白檢測(cè)結(jié)果,異常血清蛋白質(zhì)電泳圖譜的分型及其特征,免疫固定電泳結(jié)果分析指南,在血清蛋白電泳時(shí),檢測(cè)到異常條帶的出現(xiàn),或者是某一個(gè)條帶的蛋白出現(xiàn)異常增加 電泳結(jié)果顯示為低免疫球蛋白血癥, 或

27、者免疫球蛋白定量結(jié)果顯示可能是游離輕鏈病 尿蛋白檢測(cè)結(jié)果異常(檢測(cè)到單克隆游離輕鏈),查看患者是否做過(guò)血清蛋白電泳,如果有必要需要進(jìn)行血清的免疫固定電泳,什么情況下必須要進(jìn)行免疫固定電泳檢測(cè)?,正常血清標(biāo)本,Ig G l單克隆免疫球蛋白(近負(fù)極端),Ig G l單克隆免疫球蛋白(近正極端),Ig G k 單克隆免疫球蛋白, 伴隨有k 型游離輕鏈,,本周氏蛋白檢測(cè),BENCE JONES蛋白檢測(cè)結(jié)果,出現(xiàn)在 a2 區(qū)域的Ig A l

28、,出現(xiàn)兩個(gè)異常蛋白帶 :利用Beta巰基乙醇處理后, 結(jié)果為Ig A l單克隆免疫球蛋白,,BME/Fluidil treatment,,BME/Fluidil treatment,,檢測(cè)結(jié)果顯示為3個(gè)IgA l:利用Beta巰基乙醇處理后, 結(jié)果為Ig A l單克隆免疫球蛋白,Ig A k 單克隆免疫球蛋白伴隨有k 型游離輕鏈,characterized on HYDRAGEL BENCE JONES,,BJ assay,I

29、g M k 單克隆免疫球蛋白,在每一個(gè)電泳條帶上都能見(jiàn)到加樣點(diǎn)痕跡:使用BME處理,在BME處理過(guò)以后, 結(jié)果顯示為Ig M k 單克隆免疫球蛋白,BME/Fluidil treatment,,寡克隆免疫球蛋白 Ig G (k + l),雙克隆免疫球蛋白 Ig G k 和 Ig A k,免疫固定結(jié)果顯示為單獨(dú)的 l 成分:需要使用抗 l游離輕鏈和/或抗 Ig D和Ig E的抗血清確認(rèn),,該結(jié)果為 l型游離輕鏈,,BJ assay,

30、characterized on HYDRAGEL BENCE JONES,免疫固定結(jié)果顯示為2個(gè)獨(dú)立的 l 成分:需要使用抗 l游離輕鏈和/或抗 Ig D和Ig E的抗血清確認(rèn),該結(jié)果為單克隆Ig D l, 并伴隨有 l 游離輕鏈,,BJ assay,characterized on HYDRAGEL BENCE JONES,,免疫固定結(jié)果確認(rèn): Ig E l 單克隆免疫球蛋白,免疫固定結(jié)果顯示為單獨(dú)的 l 成分:需要使用抗

31、 l游離輕鏈和/或抗 Ig D和Ig E的抗血清確認(rèn),,特殊病例,在免疫球蛋白區(qū)域檢測(cè)到異常條帶, 但是免疫固定檢測(cè)結(jié)果卻為陰性,,,在使用抗-纖維蛋白原的抗血清結(jié)果顯示為陽(yáng)性,,,尿蛋白的電泳研究,,,,腎單位的生理結(jié)構(gòu)和各類生理蛋白,1百萬(wàn)個(gè)腎單位每天過(guò)濾180升的血漿，同時(shí)產(chǎn)生大約1.5升的尿液。,尿蛋白 : 定義,在生理學(xué)角度講，正常的人的尿蛋白量在 50 至120 mg/24 h (大約在 100 mg/L)主要的蛋白是白

32、蛋白 (少于 30 mg/L)病理上的腎功能疾病：當(dāng)尿蛋白量大于150 mg/24 h 而此時(shí)，尿蛋白的成分也是不定的。,導(dǎo)致尿蛋白含量增加的原因,生理上的因素 : 間歇性的 (站立過(guò)久, 正餐以后, 運(yùn)動(dòng)過(guò)后, 壓力之下)腎前性 : 高血壓, 發(fā)燒, 心臟或肝臟功能衰退,… 蛋白濃度升高 (尿蛋白含量過(guò)高)腎性: 腎小球或腎小管受到損傷 (或者兩個(gè)同時(shí)受到損傷)腎后性 : 泌尿系統(tǒng)出現(xiàn)損傷,腎前性的尿蛋白,尿蛋白含量增加

33、,某一種蛋白含量出現(xiàn)異常升高， 超出了腎小管對(duì)于這一蛋白的再吸收能力。原因自由輕鏈, 主要是在單克隆免疫球蛋白疾病中beta 2 微球蛋白, 淋巴組織增生綜合征 溶菌酶, 在一些急性髓細(xì)胞白血病血紅蛋白, 在結(jié)合珠蛋白飽和后出現(xiàn)的溶血現(xiàn)象中血清粘蛋白, 又稱為Alpha酸性糖蛋白，在支氣管癌患者中肌紅蛋白, 在橫紋肌出現(xiàn)溶解患者中上述各類情況均可導(dǎo)致出現(xiàn)腎病 (尤其是含有自由輕鏈的本周氏尿蛋白),尿蛋白含量增加,腎性尿

34、蛋白分析,a2-巨球蛋白 (MW :900 kDa),注 : (Cystatin C),血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C,腎小球過(guò)濾,小分子蛋白, 分子量小于 67 kDa, 被過(guò)濾到尿液中.其他決定各種蛋白被過(guò)濾的因素 : 分析形狀, 帶電量, 血漿濃度.還有一些血液動(dòng)力學(xué)因素可影響蛋白的過(guò)濾.,腎小球損傷,經(jīng)常出現(xiàn)于成人及兒童患者中, 表現(xiàn)為尿蛋白含量出現(xiàn)增加現(xiàn)象 (大于1 g/24-h)原因糖尿病感染性

35、損傷 (細(xì)菌感染, 乙肝患者, 水痘, 梅毒, 單核白血球增多癥 ,…) 其他系統(tǒng)性疾病 (自動(dòng)免疫系統(tǒng), 癌癥,…)中毒現(xiàn)象 (重金屬, 藥物中毒,…)此時(shí), 我們可以在尿蛋白中發(fā)現(xiàn)白蛋白和其他大分子量蛋白 (大于 67 kDa)。,臨床示例,腎小管的再次吸收功能,在腎小球中被過(guò)濾掉的小分子蛋白， 分子量小于67 kDa, 將會(huì)在腎小管內(nèi)被重新吸收 (內(nèi)吞作用).99% 的在腎小球內(nèi)被過(guò)濾的蛋白, 都將

36、會(huì)被重新吸收利用. 例如, 18 g/24-h 白蛋白將會(huì)被過(guò)濾掉; 30 mg/L 白蛋白在人的尿液中被發(fā)現(xiàn).,腎小管損傷,腎小管損傷將會(huì)改變其對(duì)小蛋白分子的重新吸收能力 (小于67 kDa的蛋白)通常是暫時(shí)性的, 并且少于0.5 g/24-hours原因遺傳原因 (Fanconi’s syndrome)免疫球蛋白單克隆擴(kuò)增 (骨髓瘤)藥物作用 (抗癌藥物)中毒現(xiàn)象

37、 (重金屬)白蛋白 (<30%) 及其它小分子蛋白 (小于 67 kDa) 都將會(huì)在尿液中被找到.,腎小管損傷,混合性損傷,臨床示例,腎小球、腎小管均受損傷。,臨床示例,5 PROTEINURIE,,14.3 KDa,,26.6 KDa,,150 KDa,,66 KDa,,輕鏈病多表現(xiàn)為腎臟損害，極易誤診為慢性腎炎。 我們認(rèn)為輕鏈有3種形式出現(xiàn)在血清或尿中；一是正常的輕鏈過(guò)剩 （Kappa和Lambda同時(shí)出現(xiàn)）， 多

38、出現(xiàn)于慢性肝病，紅斑狼瘡等多克隆增殖中。二是伴隨輕鏈。三是單一輕鏈，血和尿中只出現(xiàn)單一增殖的大量輕鏈。,關(guān)于本周氏蛋白的檢測(cè),進(jìn)行血清蛋白電泳時(shí), 已經(jīng)了解患者的血清蛋白電泳信息 (血液中檢測(cè)到單克隆免疫球蛋白), 不建議進(jìn)行尿蛋白濃縮.當(dāng)懷疑患者出現(xiàn)淀粉樣病變或者輕鏈沉淀病時(shí) (血清中未檢測(cè)到單克隆免疫球蛋白), 這種情況下，需要濃縮尿蛋白確認(rèn)是否出現(xiàn)了本周氏蛋白.,濃縮還是不濃縮 ?,Bence Jones protein,漿

39、細(xì)胞增生癥,影響,血液中出現(xiàn)游離輕鏈,尿液中出現(xiàn),起因,結(jié)果,,,,,,,,,,,,腎小管損傷淀粉樣病變輕鏈沉淀病,骨髓瘤巨球蛋白血癥CLL慢性白血病MGUS.....,,,下列參數(shù)會(huì)影響本周氏蛋白的毒性 :,等電點(diǎn) (pI):- When the pI is >6, the Bence Jones will interact strongly with the Tamm-Horsfall protein.-

40、If the pI is low, there will be little interaction with THP. 輕鏈形成的聚合體: - (polymers can reach a MW of 900 kD). 輕鏈的初級(jí)結(jié)構(gòu): - The primary structure of the free light chains is also involved in the toxicity. Thi

41、s is due to the variable region of the light chain.,尿液的檢測(cè)原則,當(dāng)血液中檢測(cè)到M蛋白時(shí):- 進(jìn)行24H尿蛋白檢測(cè)- 電泳 + IF/BJ- 對(duì)異常峰進(jìn)行鑒定- 對(duì)患者進(jìn)行隨訪, 目的是確認(rèn)藥后療效和腎臟損傷程度,原尿檢測(cè) (HR3 Program),Hydragel 15 HR(高分辨試劑檢測(cè)),濃縮尿液檢測(cè) (HR2 Program),Hydragel 15 HR

42、 (高分辨試劑檢測(cè)),Hydragel Bence Jones(本周氏蛋白檢測(cè)),總的尿蛋白: 0,3 g/L,腎小管型損傷,檢測(cè)到:- 微量白蛋白, - 3 個(gè)腎小管型小分子蛋白- 多克隆的 k and l 型輕鏈,沒(méi)有重鏈與之對(duì)應(yīng),本周氏蛋白檢測(cè)陰性,重點(diǎn) : 對(duì)患者定期隨訪檢測(cè), 便于及時(shí)掌握患者腎臟損傷程度,,總結(jié),電泳技術(shù)在同工酶分析方面的應(yīng)用,The Assay and the Clinical Application

43、 of Isoenzymes,同工酶的定義,同工酶是以多種分子形式存在于機(jī)體的催化功能相同分子結(jié)構(gòu)不同,檢測(cè)同工酶的目的,檢測(cè)同工酶活力比單測(cè)定酶的總活力更具有臟器特異性和高靈敏性等優(yōu)點(diǎn), 因而提高了臨床診斷價(jià)值早期診斷某些疾病, 陽(yáng)性率高, 特異性強(qiáng)可以估計(jì)病情嚴(yán)重性和判斷預(yù)后,同工酶的命名,國(guó)際化學(xué)聯(lián)合會(huì)(International Union of pure and Applied Chemistry IUPAC

44、)建議:1、在命名同工酶時(shí)應(yīng)采用規(guī)定的酶的名稱2、如同工酶電泳圖上各主要區(qū)帶旁還分出若干亞區(qū)帶時(shí),可以用 a, b, c, d 注于主要區(qū)帶的右下方.3、經(jīng)明確鑒定過(guò)的特異同工酶, 可以附加諸如分子量, 穩(wěn)定性,亞單位等參數(shù).4、同工酶不應(yīng)該用組織的分布來(lái)加以注解(如腦型，心肌型等)因?yàn)檫@類同工酶在別的生物機(jī)體中不一定存在于同一組織中。,目前廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)中的同工酶,乳酸脫氫酶同工酶(Lactate dehydrogena

45、se, LDH)肌酸激酶同工酶(Creatine kinase, CK)堿性磷酸酶同工酶(Alkaline phosphatase, ALP)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate transaminase, AST)γ - 谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ- glutamyltransferase, GGT)? - 淀粉酶同工酶(? -Amylase, AMY),同工酶的分析方法,由于同工酶的一級(jí)結(jié)構(gòu) (氨基酸序列)及高級(jí)結(jié)構(gòu)(構(gòu)象)的不同

46、, 因此, 一種酶的各個(gè)同工酶在化學(xué), 物理化學(xué), 生物化學(xué)等方面的性質(zhì)也就有所差異, 這些差異就提供了分析和鑒定同工酶的理論基礎(chǔ)在研究同工酶的所有方法中，電泳法的使用最為廣泛。因?yàn)榇朔ê?jiǎn)便、快速、分離效果良好，并且一般不會(huì)破壞酶的天然狀態(tài),乳酸脫氫酶同工酶(LDH),乳酸脫氫酶是能催化乳酸脫氫生成丙酮酸的酶每種LD同功酶都是由4個(gè)亞單位(肽鏈)組成的四聚物. 這些亞單位中, 有兩類分別專屬M(fèi)(肌肉)和H(心臟).H4

47、 = LD1H3M = LD2H2M2 = LD3HM3 = LD4M4 = LD5,乳酸脫氫酶同工酶(LDH),組成與分布 LDH 1～5 H, M, MW 140,000.LDH 1,2: 心肌, 腎, 紅細(xì)胞LDH 3: 肺, 脾, 胰, 甲狀腺, 腎上腺, 淋巴結(jié)LDH 4,5: 骨骼肌, 肝

48、LDH x: 睪丸, 精子檢測(cè)方法--------瓊脂糖電泳法 原理: 以瓊脂糖膠作為介質(zhì),LDH可分離出五種同工酶區(qū)帶,根據(jù)其電泳遷移率的快慢, 將遷移最快的命名為 LDH1, 依次為 LDH2, LDH3, LDH4和LDH5,最后顯色,掃描確定其百分率.參考值LDH1 28.4 ± 5.3% LDH2 41.0 ± 5.0%LDH3 19

49、.0 ± 4.0% LDH4 6.6 ± 3.5% LDH5 4.6 ± 3.0%,臨床意義,LDH1和LDH2升高： 見(jiàn)于急性心肌梗塞(LDH1／LDH2>1)、病毒性心肌炎、風(fēng)濕性心肌炎和克山病LDH5和LDH4升高：    (1)急性肝炎：LDH5明顯升高，LDH4輕度增高；    (2)急性肝

50、萎縮：LDH5和LDH4都明顯升高；    (3)慢性肝炎，肝硬化：LDH5輕度升高；    (4)骨骼肌急性損傷、皮肌炎：LDH5和LDH4都升高；    (5)前列腺癌：LDH5升高，LDH5／LDH1>1LDH的五種同工酶都升高：見(jiàn)于胃癌、結(jié)腸癌和胰腺癌.,肌酸激酶同工酶（ISO-CK）,,肌酸激酶(CK)同工酶的組成

51、 CK是由M和B兩種亞單位組成的二聚體,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)內(nèi)共有三種同工酶：CK-MM,CK-MB和CK-BB。在細(xì)胞線粒體內(nèi)還有另一種同工酶，稱為CK-Mt。這幾種同工酶的分子量雖然相同，但免疫特性不同，電泳遷移率也不同。,肌酸激酶(CK)同工酶的組成(廣泛存在于各類組織中,與ATP形成有關(guān))骨骼肌:主要為CK-MM,不含CK-BB,僅有少量CK-MB（＜3％）心肌:主要為CK-MM,CK-MB占CK總量的14％-42％

52、 腦組織以及其中含平滑肌器官:幾乎全部是CK-BB，它同時(shí)也是人胚胎中CK的主要存在形式。,,Macro CKType I,,CK BB,Application point,,,CK MB,,CK MM,Macro CKType II,腦組織及其它平滑肌 : CK-BB 0% 心肌細(xì)胞 : CK-MB 0~3%骨

53、骼肌細(xì)胞 : CK-MM 97~100% CK-MB的陽(yáng)性決定水平為 5%,免疫抑制法測(cè)定 原理：用羊抗CK-M抗體與病人血清共同溫育，血清中的CK-M亞單位全部被抑制，測(cè)定剩余的非 M-CK 活性，即代表 CK-BB和 CK-MB中的B亞基，也包括CK-Mt 活性，由于正常人和心臟， 肌肉疾患病人血清中CK-BB和CK-Mt的含量極低，故一般忽略不計(jì)，此時(shí)測(cè)得的非 M-CK 活性實(shí)際

54、上代表CK-MB中的B亞基活性，乘以2即為CK-MB活性。,CK同工酶的臨床意義 1．急性心肌梗塞（1） CK總活性在急性心肌梗塞后的4小時(shí)便開(kāi)始升高，至20-30小時(shí)達(dá)高峰，3-5天后下降至基礎(chǔ)水平。此酶為診斷心肌梗塞的一個(gè)極靈敏指標(biāo)。,4小時(shí),20-30小時(shí),3-5天,,,,（2）CK-MB主要存在于心肌細(xì)胞內(nèi)，急性心肌梗塞后先于CK總活力1-2小時(shí)升高，12-20小時(shí)達(dá)峰值，如無(wú)并發(fā)癥3天后回復(fù)至正常水平，如果胸痛病

55、人患者在48小時(shí)內(nèi)CK-MB尚在正常水平活力不足總CK的2%，即可排除急性心肌梗塞的診斷 若已下降的CK-MB再度上升，提示可能有新的心肌梗塞發(fā)生。,,,,1-2小時(shí),12-20小時(shí),3天后,（1）肌營(yíng)養(yǎng)不良 骨骼肌中富含CK，以CK-MM為主，故各型肌營(yíng)養(yǎng)不良均可引起CK活力升高，發(fā)病年齡越早，予后也越差。 其中半數(shù)以上可檢出CK-MB，（CK-MB/CK＜5%)而心電圖都無(wú)陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明并非心肌受累。 （2）肌肉創(chuàng)

56、傷及肌肉注射 肌肉創(chuàng)傷可使CK活力升高，無(wú)CK-MB出現(xiàn)， CK-MM 是骨骼肌損傷的特異指標(biāo)。肌肉注射青霉素，利血平， 腎上腺素等藥物期間，約有 1/3 的病人在 12-48小時(shí)內(nèi)總CK活力升高，一般可持續(xù)3-6天，檢測(cè)CK同工酶，可見(jiàn)主要是CK-MM占優(yōu)勢(shì)，提示這是肌肉創(chuàng)傷所至。,2．神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病,3. 巨CK的臨床評(píng)價(jià)- 巨CK1,巨CK1 是一種同工酶(抗體)與自身抗體的復(fù)合物最多的是CK-BB與IgG或IgA的

57、復(fù)合物.也有少 數(shù)為CK-MM與IgG的復(fù)合物。CK-BB-IgG或IgA。老年人、風(fēng)濕和心臟病、肌炎患者。在做冠脈造影的患者中巨CK1的發(fā)生率13.8％，認(rèn)為至少部分起源于血管壁。3例低血鉀性肌病婦女。1例急性橫紋肌溶解，肌肉內(nèi)肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶缺乏。認(rèn)為巨CK1與自身免疫性疾病無(wú)明顯聯(lián)系。,3. 巨CK的臨床評(píng)價(jià)- 巨CK2,巨CK2是一種低聚的線粒體 CK，又稱 CK-Mt，存在于細(xì)胞線粒體膜上，當(dāng)線粒體崩解時(shí)，線粒體的小碎片

58、進(jìn)入血液，使CK-Mt成低聚狀態(tài)。眾多文獻(xiàn)認(rèn)為巨CK2 不會(huì)在健康人血中出現(xiàn)，它與惡性腫瘤密切相關(guān)，可作為腫瘤的標(biāo)志物。原發(fā)性肺癌巨CK2檢出率為56.8%。肺癌組CEA(人癌胚抗原)測(cè)定的陽(yáng)性率40.0%。手術(shù)切除后巨CK2轉(zhuǎn)為陰性，提示將巨CK2和CEA聯(lián)合檢測(cè)，用于檢出肺癌有無(wú)周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有價(jià)值。巨CK2亦可為胃腸道惡性腫瘤的標(biāo)志物，13例結(jié)腸癌患者，手術(shù)前有9例血清出現(xiàn)巨CK2；21例結(jié)腸癌或胃癌轉(zhuǎn)移的患者中16例檢出巨

59、CK2。,MM,MB,BB,,,,Macro CK1,,4. CK-BB,《急性顱腦損傷患者血清CK—BB監(jiān)測(cè)的臨床意義》華西醫(yī)學(xué)－1997年12月2期何永生，葉長(zhǎng)寧，四川省人民醫(yī)院神經(jīng)外科 目的；探討急性顱腦損傷患者血清ＣＫ－ＢＢ活性及動(dòng)態(tài)變化的臨床意義。方法：逐日監(jiān)測(cè)５０例急性腦傷患者血清ＣＫ－ＢＢ活性，與臨床指標(biāo)對(duì)比評(píng)價(jià)其臨床價(jià)值，并分析其變化規(guī)律與治療轉(zhuǎn)歸，預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果：血清ＣＫ－ＢＢ在傷后早期升高，且與傷情成正比

60、相關(guān)，ＣＫ－ＢＢ較快恢復(fù)正常是治療有效、無(wú)并發(fā)癥和預(yù)后良好的標(biāo)志。,急性顱腦損傷患者血清CK—BB監(jiān)測(cè)的臨床意義華西醫(yī)學(xué)－1997年12月2期何永生，葉長(zhǎng)寧，四川省人民醫(yī)院神經(jīng)外科 目的：探討急性顱腦損傷患者血清ＣＫ－ＢＢ活性及動(dòng)態(tài)變化的臨床意義。方法：逐日監(jiān)測(cè)５０例急性腦傷患者血清ＣＫ－ＢＢ活性，與臨床指標(biāo)對(duì)比評(píng)價(jià)其臨床價(jià)值，并分析其變化規(guī)律與治療轉(zhuǎn)歸，預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果：血清ＣＫ－ＢＢ在傷后早期升高，且與傷情成正比相關(guān)，ＣＫ

61、－ＢＢ較快恢復(fù)正常是治療有效、無(wú)并發(fā)癥和預(yù)后良好的標(biāo)志。,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)缺氧缺血性腦病患兒血清CK-BB的臨床意義中國(guó)誤診學(xué)雜志－2002年 第2卷第12期鄭紅英 目的：探討缺氧缺血性腦病(HIE)新生兒血清腦型肌酸激酶同工酶(CK-BB)和心型肌酸激酶同工酶(CK-MB)的活性變化,以了解CK-BB和CK-MB對(duì)HIE患兒的檢測(cè)價(jià)值.方法：在出生后1～3 d檢測(cè)HIE患兒CK、CK-BB、CK-MB活性,與正常新生兒作對(duì)比,分析各項(xiàng)

62、指標(biāo)與病情、轉(zhuǎn)歸、預(yù)后的關(guān)系.結(jié)果：中度、重度HIE患兒血清CK-BB、CK與正常新生兒相比有顯著性升高;重度組CK-MB比正常組顯著升高.CK-BB活性迅速下降者,治療有效,預(yù)后良好;CK-BB活力持續(xù)升高,患兒預(yù)后差, CK-MB升高患兒常伴有心肌功能損害.結(jié)論：血清CK-BB是診斷HIE的可靠、特異性指標(biāo),動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)新生兒CK-BB、CK-MB活性對(duì)病情估計(jì)、判斷療效及預(yù)后評(píng)估有重要價(jià)值.,羊水Ⅲ°混濁新生兒肌酸磷酸激

63、酶同功酶改變及臨床意義,當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2007年6月傅發(fā)展，浙江省蒲江縣人民醫(yī)院目的  探討羊水Ⅲ°混濁新生兒肌酸磷酸激酶及其同功酶的改變及意義。方法  24例羊水Ⅲ°混濁新生兒暫無(wú)心腦肺等臟器并發(fā)癥作為實(shí)驗(yàn)組，24例正常新生兒作為對(duì)照組，出生后48小時(shí)內(nèi)測(cè)定CK、CK-MB、CK-BB。  結(jié)果  兩組差異有顯著性（P＜0.01）。 結(jié)論  CK-BB主要存在

64、于腦部神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿中，只有在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞受損時(shí)才釋放到細(xì)胞外。由于宮內(nèi)缺氧導(dǎo)致血腦屏障功能受損，因而大量CK-BB通過(guò)血腦屏障進(jìn)入血液循環(huán)，使血清中水平升高。CK-BB在血中表達(dá)水平越高，持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，表明腦損害病情越重，因其有較高的特異性與靈敏性，在腦缺氧損害時(shí)，CK-BB可作為早期診斷、病情估計(jì)及判斷預(yù)后的評(píng)價(jià)指標(biāo)。,新生兒缺氧缺血性腦病血清CK-BB水平與腦實(shí)質(zhì)CT值的相關(guān)性研究,中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2006年

65、第14卷05期張愛(ài)梅, 劉長(zhǎng)云, 呂祖芳, 段全紀(jì)目的：探討新生兒血清肌酸激酶腦型同工酶(CK-BB)的水平與腦實(shí)質(zhì)CT值對(duì)缺氧缺血 性腦病(HIE)的診斷價(jià)值.方法：采用比色法對(duì)49例HIE患兒和32例對(duì)照組新生兒血清CK-BB水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)測(cè)定. 同時(shí)采用日本東芝Aqilion 螺旋CT掃描機(jī)單純頭顱平掃,在CT診斷分度的同時(shí)測(cè) 定腦實(shí)質(zhì)CT值.結(jié)果：生后24小時(shí)內(nèi)HIE

66、組血清CK-BB水平與對(duì)照組相比明顯增高(P均<0.01), 且 HIE各組之間差異有顯著性意義(P均<0.01);生后48及72小時(shí)重度HIE組血清 CK-BB水平仍高于對(duì)照組(P <0.01),與輕、中度HIE組與對(duì)照組相比差異有非 常顯著性意義(P <0.01).輕、中、重度HIE患兒腦實(shí)質(zhì)CT值均明顯低于對(duì)照組 (均P <0.01),且

67、HIE各組之間差異有顯著性意義(P均<0.01).相關(guān)分析發(fā)現(xiàn), HIE組生后24小時(shí)內(nèi)患兒血清CK-BB水平與腦實(shí)質(zhì)CT值呈顯著負(fù)相關(guān)(r =- 0.747, P <0.01).結(jié)論：血清CK-BB水平監(jiān)測(cè)可作為HIE診斷及評(píng)價(jià)腦損傷程度的早期預(yù)測(cè)指標(biāo), 與腦實(shí)質(zhì)CT值結(jié)合可對(duì)窒息后缺氧缺血性腦病做出早期而正確的診斷,為早期治 療提供依據(jù).,腦脊液蛋白研

68、究,,中樞合成免疫球蛋白是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患的一個(gè)重要信號(hào)，主要用于對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患進(jìn)行診斷和鑒別診斷如：多發(fā)性硬化癥、癡呆、脊髓炎、副腫瘤性腦炎、神經(jīng)性梅毒等現(xiàn)階段臨床上診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變主要依靠影像學(xué)結(jié)合臨床分析，但是，在病變?cè)缙谟跋駥W(xué)及常規(guī)檢查常無(wú)法診斷然而中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變患者腦脊液中免疫球蛋白IgG增加卻發(fā)生較早因此實(shí)驗(yàn)中對(duì)腦脊液中IgG進(jìn)行蛋白電泳，形成的典型寡克隆區(qū)帶對(duì)上述疾病的早期診斷而言，是重要的、必不可少的依

69、據(jù),瓊脂糖凝膠電泳和免疫固定原理相結(jié)合,利用高分辨技術(shù)在瓊脂糖凝膠上對(duì)腦脊液蛋白進(jìn)行電泳分離(血清中的免疫球蛋白的濃度應(yīng)該被稀釋到和腦脊液中Ig一樣的濃度: 5 至 10 mg/L).利用與標(biāo)有過(guò)氧化氫酶的特異的抗血清(G, A, M, k, l)之間的免疫反應(yīng),免疫球蛋白將會(huì)被固定在Igs過(guò)氧化氫酶被激活從而進(jìn)行顯色 : 這種顯色反應(yīng)非常靈敏 (最低可以檢測(cè)到125-250 µg/L的微量蛋白).,臨床病例,1 :