真核細(xì)胞基礎(chǔ)知識(shí)1原和細(xì)胞復(fù)習(xí)

1、第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法,,觀察（原版P143） 自1680年荷蘭學(xué)者列文虎克(Leeuven hoek)用單顯微鏡(單透鏡)第一次看到酵母活細(xì)胞以來,人們一直在努力改革和發(fā)展觀察手段，來研究細(xì)胞較深層次的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。今天人們已經(jīng)有了具有原子尺度高分辨本領(lǐng)的掃描隧道顯微鏡。與此同時(shí)人們還創(chuàng)造了一系列對(duì)細(xì)胞組分和細(xì)胞生理活動(dòng)進(jìn)行詳盡分析的方法和手段,它們揭示了各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的功能和作用。,為了提供大量均一的

2、細(xì)胞作為生物學(xué)的研究材料,人們又發(fā)展了一系列細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察技術(shù)，細(xì)胞組分及功能的分析技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)賴以發(fā)展的三大技術(shù)手段。,第一節(jié) 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法 一 各種顯微鏡 1、普通光學(xué)顯微鏡（Light microscope）的分辨本領(lǐng)各種顯微鏡識(shí)別微觀物象的能力常用分辨力（resolving power）的概念來表示。分辨力是指能夠區(qū)分相近兩點(diǎn)的最小距離，能夠區(qū)分的兩點(diǎn)間距離越小，表示顯微鏡

3、的分辨力越高。分辨力亦稱分辨本領(lǐng)。顯微鏡的分辨力是由物鏡決定的。它和物鏡的鏡口率、照明光線的波長(zhǎng)有直接關(guān)系。分辨力可按下式計(jì)算：,0.61(λ) R=---------- ……………………(a) NA (Sin a1/2)R-------分辨力(-------照明光源的波長(zhǎng)NA------鏡口率（數(shù)值孔徑）,n-------物鏡與標(biāo)本間的介質(zhì)的折射率(a------物鏡的鏡口角 所謂鏡口角是指從物鏡光軸

4、上的物點(diǎn)發(fā)出的光線與物鏡前透鏡有效直徑的邊緣所張的角度（2-1）。鏡口角(小于180(，故Sin1/2的最大值也小于1。,2 暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡是因?yàn)橐曇皟?nèi)不能直接看到照明光線,只能看到被檢物體散射或衍射的光線。故視野內(nèi)呈黑暗狀態(tài)。由于被檢物體表面散射的光亮.才使我們能夠在黑暗的視野中觀察到被檢物體的外形和運(yùn)動(dòng)。普通顯微鏡的最高分辨力如上所述為 0.2微米,而暗視顯微鏡雖然對(duì)被檢物體的細(xì)微構(gòu)造分辨不清,但卻可看到0.004微

5、米以上的微粒子的存在。這是普通光學(xué)顯微鏡所不具有的特性。,3 相差顯微鏡 三十年代Zernike.F.提出相差顯微鏡(phase contrast microscope)的原理和設(shè)計(jì),四十年代開始制造相差顯微鏡出售。由于有了相差顯微鏡,在一定程度上克服了上述困難可以直接看到活細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)變化。,4、熒光顯微鏡 某些物質(zhì)受紫外線照射時(shí)發(fā)出熒光(可視光線),這種物質(zhì)稱熒光物質(zhì)。例如維生素A、核黃素、硫胺素等都是細(xì)胞內(nèi)的天然熒光物質(zhì)。用熒

6、光顯微鏡(fluorescence microscope)可以觀察這些熒光物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布位置。另外給細(xì)胞中加入熒光染料(如中性紅、甲基綠、吖啶橙、吖啶黃、剛果紅等)可使細(xì)胞中某些物質(zhì)受紫外線照射誘發(fā)出熒光。例如固定的切片標(biāo)本,用吖啶橙染色,經(jīng)紫外線照射時(shí)可使細(xì)胞內(nèi)的核糖核酸(RNA)發(fā)生紅色熒光,脫氧核糖核酸(DNA)發(fā)生綠色熒光。,5，電子顯微鏡(electron microscope) 可見光的波長(zhǎng)制約了普通光學(xué)顯微鏡的分

7、辨能力。人們?cè)诳紤]可能替換的光源。1926年有人發(fā)現(xiàn)了磁場(chǎng)對(duì)電子束的聚焦效應(yīng)，接著魯斯卡(Ruska)借助于磁力線圈把電子束聚焦于盡可能小的點(diǎn)上。這兩項(xiàng)研究成果奠定了制作電子顯微鏡的基礎(chǔ)。1831年魯斯卡等人通過試驗(yàn)證實(shí)了和光學(xué)成象的幾何原理一樣，電子照射的物體也可以用磁電子透鏡分二次放大的形式顯示出來。1933年魯斯卡制成了第一臺(tái)電子顯微鏡，這臺(tái)電鏡被看作是當(dāng)代各種型號(hào)電鏡的祖先。他得到了500 A?的圖象。,1939年魯斯卡極大的改

8、善了電子顯微鏡，西門子公司開始批量生產(chǎn)并成功的將電子顯微鏡推向了市場(chǎng)。1986年魯斯卡與掃描隧道顯微鏡的發(fā)明人拜寧（Binning)等一起被授于諾貝爾物理獎(jiǎng)。魯斯卡在80高齡得到這次殊榮，是為了獎(jiǎng)勵(lì)他在24歲時(shí)發(fā)明的電子顯微鏡，他可能是歷史上最老又最年輕的諾貝爾獎(jiǎng)獲得者。,電子顯微鏡是用電子束作為照明的光源.電子束的波長(zhǎng)遠(yuǎn)比光波的波長(zhǎng)短.其次,電子顯微鏡使用的是電子透鏡。光學(xué)透鏡是由玻璃制成的可見物質(zhì)透鏡.與此相反，電子透鏡不是肉眼可

9、見的物質(zhì)透鏡,他是由磁或電所行成的局部空間來起透鏡的做用.那么電子束是怎么成象的呢?它和光學(xué)象的形成有何不同？在光學(xué)顯微鏡中，成象的反差度,即亮度差,是因被檢物的不同結(jié)構(gòu)吸收光線的強(qiáng)弱程度不同造成的。,,那么電子束是怎么成象的呢?它和光學(xué)象的形成有何不同？在光學(xué)顯微鏡中，成象的反差度,即亮度差,是因被檢物的不同結(jié)構(gòu)吸收光線的強(qiáng)弱程度不同造成的。而電鏡的成象原因是,入射電子與物質(zhì)原子碰撞后產(chǎn)生散射,被檢的不同部位有不同的散射度,這樣就形

10、成了電子象的濃淡.電子束的散射度是由物體的密度與厚之積,以及加速電壓的大小決定的。,6．掃描隧道顯微鏡(Scanning tunneling microscope,簡(jiǎn)稱 STM)。 人類永遠(yuǎn)不會(huì)停止對(duì)微觀世界的探索，在電子顯微鏡發(fā)明大約半個(gè)世紀(jì)后，1981年拜寧（Binning）等又發(fā)明了掃描隧道顯微鏡它的成象原理完全不同于光鏡和電鏡。?；诹孔恿W(xué)原理，研究者們發(fā)展出了一系列高分辨顯微鏡。這些發(fā)明為人類打開了通向微觀世界的一

11、扇又一扇大門，使人類真正進(jìn)入了納米世界。,STM的探頭有一根探針，針尖只有一個(gè)原子的大小，探針的針尖接近但不接觸觀測(cè)樣品的表面并且同時(shí)進(jìn)行掃描.根據(jù)量子物理學(xué)原理，當(dāng)針尖上的原子與樣品表面的原子的距離小于1納米時(shí)，針尖和樣品間會(huì)產(chǎn)生隧道效應(yīng)，即產(chǎn)生隧道電流.通過記錄隧道電流的變化就可以獲得樣品表面原子排列的情況并把它轉(zhuǎn)化為圖像。 STM具有其他顯微鏡不可比擬的功能和特點(diǎn)：（1）具有高分辨能力。 （２）具有搬移能力。STM不僅可以直接觀

12、察物質(zhì)表面的原子排列情況，而且還可以通過探針對(duì)物質(zhì)表面的原子或分子進(jìn)行搬移.從而人們可以按著自己的意愿在原子水平上進(jìn)行重構(gòu)或組建新的材料。,（3）具有刻蝕能力。STM能對(duì)物質(zhì)表面進(jìn)行刻蝕，通過計(jì)算知道一個(gè)大頭針大小的地方就能記錄下來象”紅樓夢(mèng)”那樣的一部書. （4）具有在多種多樣下的工作能力。對(duì)于生物學(xué)研究尤其重要的是STM可以在真空、大氣等多種條件下工作。（5）不破壞樣品，STM在工作時(shí)既不接觸樣品又沒有高能電子束的轟擊.因此，可以避

13、免樣品的變形。 第二節(jié) 細(xì)胞組分及功能的分析方法,這些方法大致可分為三種：第一種方法是把細(xì)胞及大分子分離出來進(jìn)行研究，即分離分析法；第二種是不破壞細(xì)胞或組分，在原位進(jìn)行組分和功能的研究，既原位分析法.第三種則是在細(xì)胞或細(xì)胞組分生活狀態(tài)下進(jìn)行的動(dòng)態(tài)分析法。當(dāng)然觀察方法和分析的方法并沒有嚴(yán)格的界限。,一、分離分析法 1、細(xì)胞分離技術(shù) 目前流式細(xì)胞術(shù)和分類術(shù)（flow cytometry and serting,FCM, F

14、CS)是一項(xiàng)較新的開拓性技術(shù)，可以用此項(xiàng)技術(shù)來分離細(xì)胞。 流式細(xì)胞計(jì)可在1小時(shí)內(nèi)分類收集一億八千萬個(gè)細(xì)胞，純度可達(dá)90—99%?？稍?分鐘內(nèi)測(cè)出10000個(gè)細(xì)胞的DNA、RNA、蛋白質(zhì)含量和細(xì)胞體積。此儀器應(yīng)用廣泛但價(jià)格十分昂貴（原版P167）。,2、細(xì)胞器及生物大分子的分離技術(shù) 離心機(jī)是一種借離心力把顆粒從中心向外推移的機(jī)器，當(dāng)離心力超過地球引力時(shí)，懸浮在液體里的顆粒就會(huì)離開中心向外沉降。 1920年代，瑞典化學(xué)家斯維德伯格（T

15、heodor Svedberg)發(fā)明了一種超速離心機(jī)，它的轉(zhuǎn)數(shù)可達(dá)每分鐘十幾萬轉(zhuǎn)，產(chǎn)生的離心力相當(dāng)于地心引力的幾十萬倍。超速離心機(jī)的出現(xiàn)極大的推動(dòng)了細(xì)胞生物學(xué)的研究.,離心技術(shù)有二個(gè)主要參數(shù)，一是離心力，一般用離心機(jī)的每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（r/min)來表示。文獻(xiàn)中也經(jīng)常直接用離心力（g)來表示。 二是沉降系數(shù)（sedimetation coeffient），它是用來表示大分子沉降速度的，各種大分子顆粒均具有一定的沉降系數(shù)。為了紀(jì)念諾貝

16、爾獎(jiǎng)獲得者斯維德伯格，沉降系數(shù)的單位用了他的名字命了名，即斯維德伯格單位（Svedberg unit)，簡(jiǎn)稱S。,1、差速離心法（differential centrifugation) 差速離心法是利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同的離心力，將各種亞細(xì)胞組分和各種顆粒分離開，勻漿液在離心場(chǎng)中，不同大小的顆粒沉向離心管底部的速度不同，當(dāng)離心力不高并且離心時(shí)間不長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞核首先沉到管底。取出上清液進(jìn)行離心并加大離心力，這時(shí)可

17、分離出線粒體，這樣進(jìn)行下去不斷增大離心力，最后可分離出核糖體。 （原版P168）,如何對(duì)分離出的物質(zhì)進(jìn)行純度鑒別呢？一般有兩種方法，一種是用電鏡作形態(tài)學(xué)鑒定。更為簡(jiǎn)便的是利用各種細(xì)胞器的特征或特殊酶分子做生化分析。 2、密度梯度離心法(density gradient centrifugation) 這種方法是利用離心溶液形成梯度來維持重力的穩(wěn)定性和抑制對(duì)流的。這需要在溶液中加入化學(xué)惰性物質(zhì)，如蔗糖、甘油及鹽類（如氯化銫、氯

18、化銣）。這些物質(zhì)不影響分離物的物理及化學(xué)性質(zhì)，分離物的密度一定要在梯度柱密度的范圍內(nèi)，經(jīng)高速離心后，不同密度的分離物就會(huì)集中在等密度帶中而得到相互的分離。,密度梯度離心法(density gradient centrifugation) 這種方法是利用離心溶液形成梯度來維持重力的穩(wěn)定性和抑制對(duì)流的。這需要在溶液中加入化學(xué)惰性物質(zhì)，如蔗糖、甘油及鹽類（如氯化銫、氯化銣）。這些物質(zhì)不影響分離物的物理及化學(xué)性質(zhì)，分離物的密度一定要在梯

19、度柱密度的范圍內(nèi)，經(jīng)高速離心后，不同密度的分離物就會(huì)集中在等密度帶中而得到相互的分離。,粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)分離形成的小泡稱微粒體（microsome)，它給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的研究帶來了極大的方便，正是對(duì)微粒體分離研究使我們得到了關(guān)于分泌蛋白合成機(jī)制等許多成果。又如，在蛋白質(zhì)合成機(jī)制的研究中，當(dāng)初發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞粗提液中能使RNA翻譯成蛋白質(zhì)。然后將粗提液分步分離，依次得到了核糖體、tRNA和各種酶，是否是這些物質(zhì)構(gòu)成了蛋白質(zhì)合成體系呢？我們可以向這個(gè)體系中加

20、入或不加入各種純組分，這樣就可以研究出每個(gè)組分在整個(gè)過程中發(fā)揮準(zhǔn)確作用。,事實(shí)上，分離分析法是在構(gòu)建一種非細(xì)胞體系（cell-free system)。這種體系來源于細(xì)胞，但不具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，它包含了部分細(xì)胞提取物，這些提取物能夠進(jìn)行正常的生物學(xué)反應(yīng)。用這種方法使細(xì)胞中各種生物學(xué)過程相互分開，不受細(xì)胞中復(fù)雜副反應(yīng)的干擾，因而可以確定這些生物學(xué)過程的,密度梯度離心法(density gradient centrifugation)是

21、根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的浮力密度的差異而不是根據(jù)他的大小來進(jìn)行分離的，比如線粒體、溶酶體或過氧化物酶體的大小相近，但密度不同，我們可以根據(jù)浮力密度對(duì)它們做進(jìn)一步的分離。這種方法的精確和靈敏是令人信服的，早在1957年人們就用氯化銫密度梯度離心技術(shù)將含有15N標(biāo)記的細(xì)菌DNA和未標(biāo)記的細(xì)菌DNA分子分離開，這個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)直接證明了DNA的半保留復(fù)制。,二 細(xì)胞的原位分析方法 人們除了用分離的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行研究外，同時(shí)還發(fā)展出了一系列對(duì)細(xì)胞進(jìn)行原位分

22、析的方法。顧名思義，這種方法要求被測(cè)定的物質(zhì)必須保持在細(xì)胞的原來位置不動(dòng)。一般的細(xì)胞化學(xué)方法都屬于這一類。比如為了測(cè)定蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂類等細(xì)胞組分，通常利用一些顯色劑與被檢物質(zhì)中一些特殊基因特異性相結(jié)合，,通過這種結(jié)合所產(chǎn)生的顏色的深淺度來判斷各種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。四氧化鋨與不飽和脂肪酸反應(yīng)呈黑色，用以證明脂肪滴的存在。用氮-汞試劑與組織中蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨酸殘基反應(yīng),形成紅色沉淀。這是著名的米倫(Millon)反應(yīng)。

23、原位分析的方法很多，我們?cè)谶@里僅介紹幾種對(duì)細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)進(jìn)行定位定量分析的方法。,1、孚爾根(Feulgen)反應(yīng) 1924年德國化學(xué)家 孚爾根（Robert Feulgen)在研究核酸時(shí)找到了一種方法，它只能使DNA著色，而RNA不著色。他發(fā)現(xiàn)DNA在細(xì)胞核里，特別是在染色體里。他用此方法證明，DNA普遍存在于動(dòng)植物細(xì)胞核中。 2、原位雜交技術(shù) 福爾根技術(shù)可使我們了解到DNA在細(xì)胞中的存在位置，但如果我們想知道某

24、段特殊核苷酸順序在染色體上或在細(xì)胞中的確切位置，福爾根技術(shù)便無能為力了，這需要用原位雜交技術(shù)。,2、原位雜交技術(shù) 福爾根技術(shù)可使我們了解到DNA在細(xì)胞中的存在位置，但如果我們想知道某段特殊核苷酸順序在染色體上或在細(xì)胞中的確切位置，福爾根技術(shù)便無能為力了，這需要用原位雜交技術(shù)。 原位雜交（in situ hybridization)是一項(xiàng)核酸分子雜交技術(shù)（nuclear acid molecular hybridization

25、technigue)。其原理是，兩條具有互補(bǔ)核苷酸順序的單鏈核苷酸分子片斷。 在一定條件下通過氫鍵的結(jié)合形成DNA—DNA,DNA—RNA或RNA—RNA雙鏈分子。,1974年Steffensen等從HeLa細(xì)胞的多核糖體中分離出5SrRNA，并以125I標(biāo)記制成探針，并測(cè)探出5SrRNA的基因在染色體上的位置。具體過程是這樣的，首先對(duì)載片上的人體細(xì)胞中期染色體進(jìn)行原位變性，并加入探針，這時(shí)，探針只能和產(chǎn)生它的模板DNA互補(bǔ)，即進(jìn)行

26、分子雜交，而其他部位則不行。放射自顯影暴露二個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)在所有制片的染色體組中，一對(duì)一號(hào)染色體均被標(biāo)記，標(biāo)記的位置是短臂末端，這說明5SrRNA基因位于第一號(hào)染色體的短臂末端。,原位雜交技術(shù)首先是在光鏡水平上發(fā)展起來的。近年來隨著免疫電鏡技術(shù)的不斷進(jìn)步，電鏡原位雜交技術(shù)也得到了發(fā)展。電鏡原位雜交和光鏡原位雜交的基本原理是一致的,區(qū)別是探針的標(biāo)記物不同，一般以生物素等一些小分子取代同位素或螢光素來標(biāo)記特異核苷酸序列來制作探針進(jìn)行原

27、位雜交。然后用與膠體金相連的生物素的特異性抗體對(duì)原位雜交樣品進(jìn)行免疫反應(yīng)，這樣就可在電鏡下觀察到探針的位置。,近些年發(fā)展起來的免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry)開創(chuàng)了這方面研究這項(xiàng)技術(shù)主要是利用抗原和其相應(yīng)的抗體能作特異性結(jié)合即免疫反應(yīng)這一原理，來定位組織或細(xì)胞中蛋白質(zhì)抗原成分的一類技術(shù)。我們可以利用這一技術(shù)來對(duì)蛋白類抗原進(jìn)行定位定性分析。雖然抗原和抗體的結(jié)合具有高度的敏感性和特異性，但是抗體與抗原的結(jié)合是看不見的

28、，為了解決這一問題，早在四十年代Coons巧妙的使熒光素和抗體項(xiàng)結(jié)合，然后用這種被標(biāo)記的抗體同被檢測(cè)的抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)，這樣就很容易在熒光顯微鏡下檢測(cè)到組織或細(xì)胞中的抗原 。,免疫酶標(biāo)記技術(shù)、免疫鐵蛋白技術(shù)。特別是1971年Faulk和Taylor創(chuàng)造的免疫膠體金技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)的特點(diǎn)是，膠體金能迅速而穩(wěn)定地與蛋白質(zhì)即抗體相結(jié)合，這是一種由于蛋白質(zhì)被膠體金表面負(fù)電荷吸引而結(jié)合的過程。這種結(jié)合主要是物理過程，不會(huì)影響蛋白質(zhì)的活性，另外金顆粒

29、容易識(shí)別，能產(chǎn)生強(qiáng)烈的二次電子，是理想的掃描電鏡的標(biāo)記物。,三 細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析的方法 第一位在這個(gè)方向上努力的是德國生物化學(xué)家努普（Franz Knoop）。早在1904年他就用苯環(huán)標(biāo)記脂肪分子對(duì)脂肪代謝研究，得出了在體內(nèi)脂肪代謝過程中脂肪分子每次斷裂下兩個(gè)碳原子的結(jié)論。這個(gè)結(jié)果被40年后的進(jìn)一步研究所證實(shí)。1913年德國化學(xué)家帕內(nèi)斯（Fridrich Adolf Paneth）等人想到了可以用放射性同位素標(biāo)記生物大分子來研究大分子在

30、細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)。這樣就有了放射自顯影技術(shù)（radioautograpgy）。,。放射性同位素技術(shù)所以能被應(yīng)用是由于存在兩個(gè)基本條件，一是放射性同位素不影響機(jī)體的正常代謝。二是機(jī)體細(xì)胞對(duì)某種元素及其不穩(wěn)定同位素“一視同仁”。該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用使得細(xì)胞生物學(xué)取得了很大的進(jìn)展，例如象檸檬酸循環(huán)，DNA半保留復(fù)制的證明等。 制造帶有放射性同位素的小分子并不復(fù)雜，只要把普通化合物放在核反應(yīng)堆里用中子轟擊，取出后就帶有放射性同位素了。如今用于標(biāo)記

31、的幾乎所有小分子前體都可以通過商品銷售得到。,放射自顯影術(shù)不但在定位研究上有靈敏度高，定位精確的特點(diǎn)，它還是動(dòng)態(tài)研究中最有效的手段針對(duì)活細(xì)胞一般都采用放射自顯影的追蹤標(biāo)記也稱脈沖標(biāo)記(pulse—chase)的方法。這種方法是先用帶同位素標(biāo)記的前體分子摻入到生活細(xì)胞的代謝中去，標(biāo)記一段時(shí)間后便把它徹底洗掉，再用不帶標(biāo)記的前體分子代替。然后在不同時(shí)間取樣并分析同位素的量和它所在的位置，從而了解它們的代謝途徑。,,第三節(jié) 細(xì)

32、胞培養(yǎng)技術(shù) 1885年，德國學(xué)者Roux發(fā)現(xiàn)雞脛細(xì)胞可在溫?zé)岬纳睇}水中存活一段時(shí)間，他稱這項(xiàng)試驗(yàn)為 “explanation” ，即體外種植的意思。1907年美國動(dòng)物學(xué)家Harrison從兩棲類胚胎中取下一塊神經(jīng)管組織，放在一滴淋巴液中作懸滴培養(yǎng)，他觀察到了神經(jīng)管分化或神經(jīng)元，并且向培養(yǎng)液中伸出了軸突。這些可以說是細(xì)胞培養(yǎng)的開拓性工作。從這些工作可以看出細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)是指將細(xì)胞從機(jī)體中分離出來，進(jìn)行體外培養(yǎng)的技

33、術(shù)。,一 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 二種類型，一類是貼壁依賴性細(xì)胞，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都屬這一類型，另一類型是非貼壁依賴性細(xì)胞，比如來源于血液，淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞屬于這一類型。 貼壁培養(yǎng)接觸抑制(Contact inhibition)。然而接觸抑制實(shí)際上只抑制了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)而并沒有抑制細(xì)胞的分裂。所以我們看到細(xì)胞長(zhǎng)滿生存平面后仍能繼續(xù)分裂，直到細(xì)胞達(dá)到一定密度，才停止分裂。這后一種抑制叫密度抑制（Density innibi

34、tion）。,,這時(shí)如果要細(xì)胞繼續(xù)分裂增殖就要進(jìn)行及時(shí)的分散，分瓶接種于新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。這一過程叫傳代培養(yǎng)（Subculture）。這種直接從有機(jī)體取出的細(xì)胞培養(yǎng)至第一次傳代為止，稱原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳到10代左右，大部份細(xì)胞才會(huì)進(jìn)入退化期，出現(xiàn)細(xì)胞的大量死亡。有人據(jù)此而把培養(yǎng)10代以前的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。,經(jīng)過10代培養(yǎng)的細(xì)胞仍有極少數(shù)存，出現(xiàn)細(xì)胞的大量死亡。有人據(jù)此而把培養(yǎng)10代以前的細(xì)胞統(tǒng)稱為原

35、代細(xì)胞培養(yǎng)。經(jīng)過10代培養(yǎng)的細(xì)胞仍有極少數(shù)存活下來，這些細(xì)胞往往會(huì)繼續(xù)順利傳代40—50次。雖然這些細(xì)胞的形態(tài)有了很大的變化，但它們?nèi)员３种旧w的2倍體數(shù)量和接觸抑制的行為。多數(shù)學(xué)者把這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞株（Cell strain）,,細(xì)胞傳代過程中可能會(huì)有極少數(shù)細(xì)胞發(fā)生了帶有癌變特點(diǎn)的遺傳性突變，發(fā)生突變的細(xì)胞可能無限制的分裂增殖，這種能無限傳代的細(xì)胞叫作細(xì)胞系（Cell ilne）。,著名的Hela細(xì)胞就是1952年從一

36、位名叫Hela的美國婦女的子宮頸上皮癌分離出來的細(xì)胞系，目前這一細(xì)胞系已遍布世界各地的實(shí)驗(yàn)室，但仍沒有壽終正寢的跡象。表列出了一些常用的細(xì)胞系。 細(xì)胞系 細(xì)胞來源 3T3 纖維X細(xì)胞（小鼠） BHK-21 纖維X細(xì)胞（敘利亞XX）,Hela 上皮細(xì)胞（人） Vero 腎細(xì)胞 CHO卵巢細(xì)胞 PTK1

37、 上皮細(xì)胞（袋X）,1．     懸浮培養(yǎng)非貼壁依賴性細(xì)胞如雜交瘤細(xì)胞等比較適合于懸浮培養(yǎng)，它是指細(xì)胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長(zhǎng)的過程。這種方法是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。但由于動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁的保護(hù)，它不能耐受劇烈的攪拌和通氣。因此在許多方面又與發(fā)酵培養(yǎng)不同。懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是，有成熟的理論計(jì)算，可以借鑒微生物發(fā)酵的部分經(jīng)驗(yàn)。它的不足是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度較低。轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸浮培養(yǎng)有潛

38、在的致癌危險(xiǎn)等。,植物細(xì)胞培養(yǎng)德國植物學(xué)家Haberlandt 從1898年開始。 原生質(zhì)體培養(yǎng) 去壁的植物細(xì)胞稱原生質(zhì)體（Protoplast）。原生質(zhì)體類似動(dòng)物細(xì)胞。它既可供基礎(chǔ)理論的研究，也可作應(yīng)用的研究，其主要方法步驟是：（1）原生質(zhì)體的制備；（2）原生質(zhì)體的培養(yǎng)；（3）原生質(zhì)體培養(yǎng)到細(xì)胞培養(yǎng)的過渡；（4）愈傷組織或脛狀體的形成；（5）植株再生，（圖 魯潤(rùn)X P12）也可以用不同植物的原生質(zhì)體進(jìn)行融合與體細(xì)胞的雜交，由此而

39、獲得體細(xì)胞雜交的植株。,單克隆抗體技術(shù)二十世紀(jì)六、七十年代，末爾斯坦（Milstein）等在對(duì)抗體深入研究過程中遇到了一個(gè)困難，即，要解決抗血清的異質(zhì)性問題，要求有一個(gè)永久抗體產(chǎn)生系，以無限制地提供抗體。而體外培養(yǎng)條件下B淋巴細(xì)胞的壽命很短。,事實(shí)上自然界中存在能分泌均質(zhì)的免疫球蛋白又永不死亡的細(xì)胞，它是B淋巴腫瘤細(xì)胞，它們?cè)跐{細(xì)胞階段發(fā)生了成瘤轉(zhuǎn)化。這種細(xì)胞很容易克隆和體外培養(yǎng)。遺憾的是他們始終沒有發(fā)現(xiàn)能與B淋巴腫瘤細(xì)胞分泌的抗體

40、的相應(yīng)抗原。因此不能用來進(jìn)行抗體分析。1974年末爾斯坦和科勒合作，試圖培養(yǎng)一株骨髓瘤細(xì)胞，使之能永久產(chǎn)生針對(duì)一個(gè)已知抗原的抗體。,,,,他們用羊紅細(xì)胞免疫小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞和一種小鼠的骨髓瘤細(xì)胞，在病毒或細(xì)胞融合劑聚乙二醇（Polyethyleneglycol）的作用下，使脾細(xì)胞中的B淋巴細(xì)胞和瘤細(xì)胞融合為一個(gè)雜交瘤細(xì)胞，它們是淋巴細(xì)胞，瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞的混合體，他們應(yīng)用HAT選擇培養(yǎng)基對(duì)混合細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)選擇。其選擇原理是這樣的

41、。正常細(xì)胞在培養(yǎng)基中合成DNA有兩條途徑，一是主要合成途徑，另外還有一條是補(bǔ)救旁路。主途徑是利用培養(yǎng)基中的糖和氨基酸這些簡(jiǎn)單的含碳含氮復(fù)合物來合成嘌呤及嘧啶核甘酸。這一過程需要四氫葉酸來供應(yīng)甲?；?。這一途徑可以被葉酸拮抗物氨基嘌呤所阻斷；細(xì)胞的補(bǔ)救途徑是通過次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和細(xì)胞嘧啶核苷激酶（TK），將核苷酸前體合成核甘酸，以提供DNA合成的原料。（圖 ）,,,,Milstein 用于融合的腫瘤細(xì)胞是經(jīng)過選

42、擇的它是補(bǔ)救旁路途徑酶缺失的突變細(xì)胞系，這種細(xì)胞在HAT選擇培養(yǎng)基中不能存活，這是因?yàn)镠AT培養(yǎng)基中含有氨基嘌呤，它阻斷了DNA的主要合成途徑。正常淋巴細(xì)胞的壽命很短，所以它也不能在HAT培養(yǎng)基上傳代，只有雜交瘤細(xì)胞能夠生存和傳代。因此很容易在HAT培養(yǎng)上選擇雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞既能增殖又可分泌抗體，由于抗原大分子有不同的抗原部位，所以我們這時(shí)得到的實(shí)際是多克隆抗體。,通過檢測(cè)單細(xì)胞雜交瘤生長(zhǎng)小孔的上清液來選擇出

43、需要的單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞，再進(jìn)一步進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，即克隆化。多次克隆化可淘汰遺傳性狀不穩(wěn)定的雜交瘤 ，從而得到能產(chǎn)生高效單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。 單克隆抗體技術(shù)正被廣泛的采用，（技術(shù)導(dǎo)論320）成為分析蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)及功能的分子生物學(xué)方法為免疫診斷和治療開辟了新的途徑.1980年代初，單克隆抗體診斷開始為受歡迎的商品，有著廣泛的市場(chǎng)，這是生物技術(shù)最早開發(fā)的項(xiàng)目。為此，末爾斯坦、科勒和杰尼(Jerne) 三人

44、共同獲得1984年諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)。,實(shí)際上，末爾斯坦的淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的研究是理論研究的副產(chǎn)品。這說明，在許多看不出有任何商業(yè)價(jià)值或醫(yī)學(xué)重要性的理論研究中，可以衍生出異想不到的巨大的實(shí)用價(jià)值。或醫(yī)學(xué)重要性的理論研究中，可以衍生出異想不到的巨大的實(shí)用價(jià)值。 （原版 183）（技術(shù)導(dǎo)論318）單克隆抗體靶向制劑。 （技術(shù)導(dǎo)論322）,單克隆抗體靶向制劑當(dāng)前由血栓引起的心腦血管阻塞引起的死亡增多。其機(jī)制是正常情況下血

45、纖維蛋白原可轉(zhuǎn)換為血纖維蛋白來維護(hù)血管壁，但血栓的主要成分是血纖維蛋白。有一種纖溶酶原,,纖溶酶原激活劑,纖溶酶,HAT培養(yǎng)基設(shè)計(jì)正常細(xì)胞在培養(yǎng)基中合成DNA有兩條途徑，一是主要合成途徑，另外還有一條是補(bǔ)救旁路。主途徑需要四氫葉酸來供應(yīng)甲?；?。這一途徑可以被葉酸拮抗物氨基嘌呤所阻斷；細(xì)胞的補(bǔ)救途徑是通過次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和細(xì)胞嘧啶核苷激酶（TK），將核苷酸前體合成核苷酸。,Milstein 用于融合的腫瘤細(xì)

46、胞是經(jīng)過選擇的它是補(bǔ)救旁路途徑酶缺失的突變細(xì)胞系即次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺失（HGPRT） ，這種細(xì)胞在HAT選擇培養(yǎng)基中不能存活，這是因?yàn)镠AT培養(yǎng)基中含有氨基嘌呤，它阻斷了DNA的主要合成途徑。單克隆抗體靶向制劑在發(fā)達(dá)國家死亡率最高的是心腦血管堵塞致死。血栓是血纖維蛋白組成的血凝塊。,,血纖維蛋白,,纖溶酶原,,纖溶酶原激活劑,,纖溶酶,,凝血塊,,,,,,降解物,,,,,,,,,內(nèi)出血,過多,血管破裂,,,,,

47、,,,,,,,,,血纖維蛋白抗體,纖溶酶原激活劑,,纖溶酶原,,,,,只有在血纖維蛋白附近的酶原被激活,Table 4-1 Some Important Discoveries in the History of Light Microscopy1611 Kepler suggested a way of making a compound microscope.1655 Hooke used a compound microsc

48、ope to describe small pores in sections of cork that he called “cells.”1674 Leeuwenhoek reported his discovery of protozoa. He saw bacteria for the first time 9 years later.1833 Brown published his microscopic observ

49、ations of orchids, clearly describing the cell nucleus.,1835 Schleiden and Schwann proposed the cell theory, stating that the nucleated cell is the unit of structure and function in plants and animals.1857 Kollider de

50、scribed mitochondria in muscle cells.1876 Abbe analyzed the showed how to optimize microscope design.1879 Flemming described with great clarity chromosome behavior during mitosis in animal cells.,1881 Retzius descri

51、bed many animal tissues with a detail that has not been surpassed by any other light microscopist. In the next two decades, he, Cajal, and other histologists developed staining methods and laid the foundations of microsc

52、opic anatomy.1882 Koch used aniline dyes to stain microorganisms and identified the bacteria that cause buberculosis and cholera. In the following tow decades, other bacteriologists, such as Klebs and Pasteur, identifi

53、ed the causative agents of many other diseases by examining stained preparations under the microscope.,1886 Zeiss made a series of lenses, to the design of Abbe, that enabled microscopists to resolve structures at the t

54、heoretical limits of visible light.1898 Golgi first saw and described the Golgi apparatus by staining cells with silver nitrate.1924 Lacassagne and collaborators developed the first autoradiographic method to localiz

55、e radioactive polonium in biological specimens.1930 Lebedeff designed and built the first interference microscope. In 1932, Zernicke invented the phase-contrast microscope. These two developments allowed unstained livi

56、ng cells to be seen in detail for the first time.,1941 Coons used antibodies coupled to fluorescent dyes to detect cellular antigens.1952 Nomarski devised and patented the system of differential interference contrast

57、for the light microscope .,Table 4-2 Major Events in the Development of the Electron Microscope and Its Application to Cell Biology1897 J.J.Thomson announced the existence of negatively charged particles, later termed

58、 electrons.1924 de Broglie proposed that a moving electron has wavelike properties.1926 Busch proved that it was possible to focus a beam of electrons with a cylindrical magnetic lens, laying the foundations of elect

59、ron optics.,1931 Ruska and colleagues built the first transmission electron microscope.1935 Knoll demonstrated the feasibility of the scanning electron microscope; three years later a prototype instrument was built by

60、 Von Ardenne.1939 Siemens produced the first commercial transmission electron microscope.1944 Williams and Wyckoff introduced the metal shadowing technique.,1945 Porter, Claude, and Fullam used the electron microsco

61、pe to examine cells in tissue culture after fixing and staining and staining them with OsO4.1948 Pease and Baker reliably prepared thin sections(0.1 to 0.2 μm thick)of biological material.1952 Palade, Porter, and Sj&

62、#246;strand developed methods of fixation and thinsectioning that enabled many intracellular structures to be seen for the first time. In one of the first applications of these techniques, H.E.Huxley showed that skeletal

63、 muscle contains overlapping arrays of,protein filaments, supporting the “sliding filament”hypothesis of muscle contraction.1953 Porter and Blum developed the first widely accepted ultramicrotome, incorporating many fe

64、atures introduced by Claude and Sjöstrand previously.1956 Glauert and associates showed that the epoxy resin Araldite was a highly effective embedding agent for electron microscopy. Luft introduced another embeddi

65、ng resin,Epon, five years later.,1957 Robertson described the trilaminar structure of the cell membrane, seen for the first time in the electron microscope.1957 Freeze-fracture techniques, initially developed by Steer

66、e, were perfected by Moore and Mühlethaler.Later(1966),Branton demonstrated that freeze-fracture allows the interior of the membrane to be visualized.,1959 Brenner and Horne developed the negative staining techniqu

67、e, invented four years previously by Hall, into a generally useful technique for visualizing viruses, bacteria, and protein filaments.1963 Sabatini, Bensch, and Barrnett introduced glutaraldehyde(usually followed by Os

68、O4)as a fixative for electron microscopy.1965 Cambridge Instruments produced the first commercial scanning electron microscope.,1968 de Rosier and Klug described techniques for the reconstruction of three-dimensional