第十七章甾類激素藥物

1、子學(xué)習(xí)情境2.2 氫化可的松發(fā)酵,發(fā) 酵 制 藥,任務(wù)一 甾類藥物,激素：是由內(nèi)分泌腺體及具有內(nèi)分泌機(jī)能的細(xì)胞或組織所分泌的物質(zhì)（甲狀腺、腎上腺、卵巢、睪丸、胰腺等），是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)部自然生成和存在的。,甾類激素藥物的分類：1、腎上腺皮質(zhì)激素2、性激素與促性腺激素3、蛋白同化激素,一、腎上腺皮質(zhì)激素,腎上腺皮質(zhì)分泌多種激素。 根據(jù)生理功能，腎上腺皮質(zhì)激素 (簡稱

2、為皮質(zhì)激素)被分為三類: 1、糖皮質(zhì)激素類 2、鹽皮質(zhì)激素類 3、氮皮質(zhì)素類,1、糖皮質(zhì)激素類。 為腎上腺皮質(zhì)的束狀帶細(xì)胞合成、分泌。（1）在生理水平對糖代謝的作用強(qiáng)，對鈉、鉀等礦物質(zhì)代謝的作用較弱。（2）在藥理治療劑量下，表現(xiàn)出良好的抗炎、抗過敏、抗毒素、抗休克等作用。,2、鹽皮質(zhì)素類。 為腎上腺皮質(zhì)的球狀帶細(xì)胞分泌。 在生理水平對礦

3、物質(zhì)代謝，特別是對鈉潴留和鉀排泄的作用很強(qiáng)。 在藥理治療劑量下，僅用作腎上腺皮質(zhì)功能不全的替代療法，在獸醫(yī)臨床上實(shí)用價(jià)值不大。3、氮皮質(zhì)素類。 由腎上腺皮質(zhì)的網(wǎng)狀帶分泌，包括雄激素和雌激素。,二、性激素,性激素重要生理功能： 刺激副性器官的發(fā)育和成熟，激發(fā)副性特征的出現(xiàn)，增進(jìn)兩性生殖細(xì)胞的結(jié)合和孕育能力，還有調(diào)節(jié)代謝的作用。分類：（按其生理功能可分為） 雄性激素

4、 雌性激素,雄性激素：雄性激素屬于C19類固醇，主要由睪丸和腎上腺皮質(zhì)所產(chǎn)生，卵巢也有少量合成。睪丸分泌的雄激素主要有3種：睪酮、脫氫異雄酮和雄烯二酮。,雌性激素：包括雌激素和孕激素兩類，主要由卵巢合成和分泌，腎上腺皮質(zhì)和睪丸也能少量合成。雌激素，真正由腺體分泌，有活性的只有3種：17β-雌二醇、雌酮和雌三醇。三種激素生理活性相差很大，其相對比活為100 : 10 : 3。孕激素屬于C21類固醇，體內(nèi)真正存在的是孕酮

5、。,三、蛋白同化激素,蛋白同化激素是一類從睪丸酮衍生物中分化出來的藥物。特點(diǎn)是性激素的作用大為減弱，蛋白質(zhì)同化作用仍然保留甚至增強(qiáng)，臨床使用比較安全，較少引起男性化癥狀等不良反應(yīng)。如17α-甲基去氫睪丸素（17-methyldehydro-testosterone，商品名為大力補(bǔ)）。,蛋白同化激素主要作用：① 促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和抑制蛋白質(zhì)異化；② 加速骨組織鈣化和生長；③ 刺激骨髓造血功能，增加紅血球量；④ 促進(jìn)組織新生和肉芽形

6、成；⑤ 降低血膽甾醇。,三、甾體藥物的來源,1、化學(xué)合成（早期）：成本高，收率低2、微生物轉(zhuǎn)：收率提高，省去這多步化學(xué)反應(yīng)3、天然提取,微生物轉(zhuǎn)化工藝的特點(diǎn),① 可減少化學(xué)合成步驟，簡化生產(chǎn)流程，縮短生產(chǎn)路線。 如由黃體酮生產(chǎn)炔諾酮，利用微生物轉(zhuǎn)化，可以減少6步工序。,② 能提高產(chǎn)物的收率和產(chǎn)品質(zhì)量，降低成本。不同的菌種都會(huì)影響到產(chǎn)品的收率和成本，菌種越優(yōu)良，反應(yīng)越向有利的方向進(jìn)行。采用生物轉(zhuǎn)化，減少了生產(chǎn)

7、步驟，從而也降低了過程損失。 如19-羥基-4-雄烯-3，17-二酮轉(zhuǎn)化為雌酮采用化學(xué)法合成需要3步才能完成，產(chǎn)品得率只有15%~20%，采用微生物轉(zhuǎn)化法，得率可達(dá)到80%以上。,化學(xué)合成過程中的化學(xué)物質(zhì)常對產(chǎn)品質(zhì)量也有影響如：生產(chǎn)去氫可的松和去氫化可的松，過程中要加入SeO2，在產(chǎn)品中常含有少量的Se有毒物質(zhì)③ 可進(jìn)行化學(xué)法難以實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)。如甾類化合物C-11上的加氧（即羥化）等反應(yīng)，化學(xué)法難以實(shí)現(xiàn)，常采用微生物法處理。

8、,微生物轉(zhuǎn)化可供選擇的酶的種類較多，為生產(chǎn)過程提供了可能。微生物轉(zhuǎn)化避免和減少了強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或化學(xué)有毒物質(zhì)，改善了生產(chǎn)環(huán)境。目前一般采用化學(xué)合成和微生物轉(zhuǎn)化兩種方法相結(jié)合的生產(chǎn)工藝。,任務(wù)二 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)原理,微生物對甾體所轉(zhuǎn)化部位：幾乎每個(gè)位置都能進(jìn)行轉(zhuǎn)化。甾體激素藥物合成比較重要的轉(zhuǎn)化反應(yīng)： 一、氧化反應(yīng) 二、還原反應(yīng) 三、水解反應(yīng)等,一、羥化反應(yīng),甾體上羥化對化學(xué)合成而言是非常困難的，除了C17位上通過化學(xué)方

9、法能導(dǎo)入羥基外，其它位置很難導(dǎo)入。通過微生物羥化酶能非常專一地選擇某個(gè)碳位置上將某空間位置上的氫取代氧化成原來空間構(gòu)型的羥基。,1．C9α羥化C9α羥化在甾體藥物合成中是一個(gè)關(guān)鍵中間步驟，涉及到甾體邊鏈的選擇性降解，并且是皮質(zhì)激素合成中一個(gè)關(guān)鍵中間體。由于C9位上導(dǎo)入羥基后，容易在C9—C10之間引入雙鍵，然后進(jìn)一步形成C11β羥基或?qū)敕印?甾體合成中重要中間體9α-羥基-4-雄甾烯-3，17雙酮。,9α-羥基-3氧化娠烷-

10、4，17雙烯-20羧酸的制取,C11α羥化,微生物轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)甾體C11α羥化，不僅解決藥物合成，更重要意義是增加皮質(zhì)激素類化合物活力，使其具有高度抑制炎癥效應(yīng)。C11α位羥化為通過微生物轉(zhuǎn)化來尋找更有效新藥開創(chuàng)了新途徑。,如孕酮的轉(zhuǎn)化中，利用黑根霉在溫度不超過320C時(shí)成功地實(shí)現(xiàn)了C11α羥基化反應(yīng)。,新月彎孢霉（Curvularoa lunata）能將Reichstein S化合物（簡稱化合物S，Compound S）一步轉(zhuǎn)化成氫化可

11、的松,二、環(huán)氧化反應(yīng),用微生物轉(zhuǎn)化法在甾體母核上引入環(huán)氧基團(tuán)的反應(yīng)與微生物羥基化有關(guān)。能產(chǎn)生11β-羥基化的新月彎孢霉或布氏小克漢銀霉都可將17α，21-二羥基-4，9（11）-孕甾二烯-3，20-二酮轉(zhuǎn)化成9β，11β環(huán)氧化合物。,三、脫氫反應(yīng),當(dāng)抗炎甾體激素等藥物的母核C1，C2位置導(dǎo)入雙鍵后，其抗炎作用會(huì)成倍增加。醋酸可的松C1，C2位上導(dǎo)入雙鍵成醋酸脫氫可的松后抗炎作用增強(qiáng)3～4倍。,R1 = 9αF或H；

12、R2 = H，6αCH3，6αF；R3 = H，16αCH3，16βOH，16αOH,化學(xué)法脫C1，C2氫是采用二氧化硒法，由于硒在生產(chǎn)中難以除盡會(huì)使產(chǎn)品中帶有少量對人體有害的物質(zhì)采用微生物轉(zhuǎn)化脫氫是甾體抗炎激素藥物合成中不可缺少的一步微生物對甾體羥化與脫氫能力是相反的，細(xì)菌的脫氫能力比真菌大，特別是棒狀桿菌和分枝桿菌活力最大。,四、甾核及邊鏈的選擇性降解機(jī)理,具有生理活性甾體類藥物的基本母核目前都是從高等動(dòng)植

13、物中獲得首先必須有選擇性地對其邊鏈進(jìn)行降解。化學(xué)法選擇性差，產(chǎn)率低。目前，多采用微生物轉(zhuǎn)化法。,甾體藥物的天然資源,薯蕷皂苷元（約占60%）是豆甾醇（約占15%）膽甾醇β-谷甾醇,甾核邊鏈的選擇性降解的應(yīng)用,工業(yè)上通過生物技術(shù)來控制微生物選擇性地降解甾體邊鏈以獲得：雄甾-4-烯-3，17-雙酮，簡稱4AD；1，4-二烯-雄甾-3，17雙酮，簡稱ADD；3-氧聯(lián)降膽甾-1，4-二烯-22-酸，簡稱BDA等。,生物技術(shù)控制途

14、徑,① 通過底物-甾體結(jié)構(gòu)的修飾；② 在微生物降解過程中加酶抑制劑；③ 通過誘變技術(shù)獲得生化阻斷突變菌株。,任務(wù)三 甾體激素的生產(chǎn)工藝過程,甾體的微生物轉(zhuǎn)化和一般的氨基酸、抗生素的生產(chǎn)不同發(fā)酵的產(chǎn)物不是目的產(chǎn)物，而只是利用微生物的酶對甾體底物的某一部位進(jìn)行特定的化學(xué)反應(yīng)來獲得一定的產(chǎn)物。,生產(chǎn)過程,微生物生長和甾體的轉(zhuǎn)化完全可以分開：一般先進(jìn)行菌的培養(yǎng)，在菌生長過程中累積甾體轉(zhuǎn)化所需要的酶 然后利用這些酶來改造分子

15、的某一部位。,一、甾體的微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)流程,甾體微生物轉(zhuǎn)化的兩個(gè)階段,第一階段：微生物生長階段第二階段：底物轉(zhuǎn)化階段,第一階段：微生物生長階段,它是將菌種接入斜面培養(yǎng)基或小米培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5d→將成熟的菌種細(xì)胞或孢子接入搖瓶或種子罐，給予合適的溫度、溶氧濃度、pH值等條件培養(yǎng)，使其充分繁殖與生長。培養(yǎng)時(shí)間的長短隨菌種和環(huán)境而異，細(xì)菌的生長期12～24h，真菌為24～72h。,第二階段：底物轉(zhuǎn)化階段,一般是在微生物生長的終點(diǎn)，逐漸將甾

16、體的粉末或適當(dāng)?shù)模ㄓ袡C(jī)）溶液加到培養(yǎng)物中，或把成熟細(xì)胞分離洗滌，然后懸浮于水或緩沖液中，再將底物加入。,說明：大多數(shù)甾體化合物難溶于水，所以常用的方法是先把底物溶于有機(jī)溶劑，如丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺（飽和溶解度達(dá)10%～20%），濃度在2%對微生物無毒性。,微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)甾體藥物的工藝,一般采用二級培養(yǎng)工藝流程如下：,二、甾體微生物轉(zhuǎn)化方式,1、由生長菌體培養(yǎng)物進(jìn)行的反應(yīng)是在培養(yǎng)菌體的適當(dāng)時(shí)間（中期或后期），添加基質(zhì)，一邊

17、繼續(xù)培養(yǎng)，一邊進(jìn)行反應(yīng)。2、由靜態(tài)菌體懸液進(jìn)行的反應(yīng)是在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，使菌體充分生長發(fā)育后，用過濾或離心法進(jìn)行分離，將收集到的菌體懸浮在水或適當(dāng)?shù)木彌_液中，再將甾類化合物加入進(jìn)去，使其反應(yīng)。,3、混合培養(yǎng)進(jìn)行反應(yīng)是將具有1，2脫氫能力和11β-羥化能力的微生物并用進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。（如果兩種微生物單獨(dú)培養(yǎng)，則必須將各過程中的抽提產(chǎn)物轉(zhuǎn)送到下面的工序，人力物力消耗較大。如采用混合培養(yǎng)法，則可省略抽提操作。）,三、影響轉(zhuǎn)化的一般因素,

18、生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵：選擇專屬性高的微生物控制適宜的發(fā)酵條件,適宜的發(fā)酵條件主要包括,（1）攪拌 攪拌可增加傳質(zhì)和傳熱，可以增加培養(yǎng)基的氧氣供給，使氧氣均勻分散而提高轉(zhuǎn)化率。（2）通氣 可直接增加氧氣的供給。有研究表明，溶解氧量對誘導(dǎo)酶產(chǎn)生非常重要。（3）前體半連續(xù)的加入 可以降低由于一次大量加入所引起的毒性，也可減少由于發(fā)泡所引起前體的損失。,（4）培養(yǎng)基組成 ①氮源規(guī)格影響不太大，水解蛋白比蛋白胨好；②糖類和脂肪對11β羥

19、化有影響；③有些酶反應(yīng)需要金屬離子，例如缺鋅不能進(jìn)行6β-羥化，而有些金屬離子使酶失活。,（5）溫度：微生物的培養(yǎng)都有適宜的溫度，若溫度太低，微生物生長不良，不能產(chǎn)生足夠的酶；若溫度過高，又會(huì)因酶蛋白變性而使轉(zhuǎn)化反應(yīng)受阻。,四、產(chǎn)物的分析與分離方法,產(chǎn)物的分析與分離均需要用適當(dāng)?shù)呐c水不混溶的溶劑將甾體從培養(yǎng)基中提取出來，最常用的如：氯仿、二氯乙烷、醋酸乙酯和甲基異丁基酮等。溶劑的用量需根據(jù)產(chǎn)物在培養(yǎng)基和溶劑中的分配系數(shù)而定，提取時(shí)要防

20、止乳化。產(chǎn)物的提取液經(jīng)適當(dāng)?shù)臐饪s，用柱層析或直接用分步結(jié)晶的辦法可以得到產(chǎn)物。,五、氫化可的松的制備,氫化可的松（Hydrocortisone）又稱為皮質(zhì)醇，化學(xué)名稱為11β，17α，21-三羥基孕甾-4-烯-1，20-二酮。其結(jié)構(gòu)式為,氫化可的松的性狀,為白色或幾乎白色的結(jié)晶性粉末，無臭，初無味，隨后有持續(xù)的苦味，遇光逐漸變質(zhì)，略溶于乙醇或丙酮，微溶于氯仿，在乙醚中幾乎不溶，不溶于水。熔點(diǎn)為212～222℃比旋光度為+162～1690

21、（1%乙醇）。,氫化可的松的工業(yè)生產(chǎn),甾體藥物的合成基本上是用半合成方法合成的，僅有及少數(shù)用全合成制備（如甲基炔諾酮），原因是全合成的工藝路線過長（如可的松需三十余步反應(yīng)），反應(yīng)特殊，工藝過程過于繁雜；總收率低，無工業(yè)生產(chǎn)的價(jià)值。,目前國內(nèi)外大都采用半合成的工藝路線，即從天然藥物中取得含有甾體基本骨架的化合物為原料通過化學(xué)合成來制取甾體藥物。氫化可的松采用半合成法生產(chǎn)。七步合成制得醋酸化合物S，然后經(jīng)生物轉(zhuǎn)化制得氫化可的松。,1

22、、反應(yīng)原理,,,生物氧化與水解,這一步反應(yīng)是利用梨頭霉菌，引入11β-羥基。在產(chǎn)物中，除了氫化可的松（簡稱β體）（Ⅱ）外，還產(chǎn)生11α-羥基化合物即表氫可的松（又稱為α體）（Ⅲ）、少量的其它位置的羥基化合物和未轉(zhuǎn)化的化合物S（Ⅰ）。所以在產(chǎn)品的分離純化時(shí)，以上各種物質(zhì)必須分離出去。,工藝流程圖,2、工藝過程,種子培養(yǎng)：將梨頭霉菌接種到土豆斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7～9d，成熟孢子用無菌生理鹽水制成孢子懸液后。種子培養(yǎng)的條件：培養(yǎng)基為葡萄

23、糖、玉米漿、硫酸銨等配制，pH為5.8～6.3，接入孢子懸液后，在通氣攪拌下28℃培養(yǎng)28~32h。待培養(yǎng)液菌濃度達(dá)到35%以上，無雜菌污染，即可轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐。,發(fā)酵：將玉米漿、酵母膏、硫酸銨、葡萄糖及水投入發(fā)酵罐中攪拌，用氫氧化鈉溶液調(diào)整物料pH值到5.7～6.3，加入0.03%豆油，滅菌溫度120℃，通入無菌空氣，降溫至27～28℃，接入犁頭霉孢子懸浮液，維持罐壓0.6kg/cm2，控制排氣量，通氣攪拌發(fā)酵28～32小時(shí)。用氫氧化鈉溶

24、液調(diào)pH值到5.5～6.0,,投入底物氧化：發(fā)酵液體積0.15%的萊氏化合物S，氧化48小時(shí)后，取樣作比色試驗(yàn)檢查反應(yīng)終點(diǎn)。提?。旱竭_(dá)終點(diǎn)后濾除菌絲，濾液用樹脂吸附，然后用乙醇洗脫，洗脫液經(jīng)減壓濃縮至適量，冷卻到0～10℃，過濾、干燥得到粗品，熔點(diǎn)195℃，收率46%左右或用醋酸丁酯多次提取，合并提取液，減壓濃縮之適量，冷至0～10℃，過濾、干燥得粗品，熔點(diǎn)為195℃，收率為46%左右,由于生物氧化所用的菌種梨頭酶菌的專屬性不夠理想

25、，成品中除氫化可的松（簡稱β體）外，還生產(chǎn)11α-羥基化合物及表氫可的松（簡稱α體），以及少量其它位置的羥基化合物和未轉(zhuǎn)化的化合物S所以在霉菌氧化反應(yīng)后，用醋酸丁酯提取到它的粗品中，就有以上各種副產(chǎn)物，必須分離提純。,分離原理：采用混合溶劑法進(jìn)行分離，利用它們在甲醇-氯乙烷混和溶劑中溶解度的不同（α體溶解度較大，β體較?。┒_(dá)到分離目的。分離方法：粗品中主要為β體，并混有部分α體，必須要分離精制，可以將粗品加入16～18倍含8%甲醇

26、的二氯乙烷溶液中，加熱回流使全溶，趁熱過濾，濾液冷卻至0～50C，冷凍、結(jié)晶、過濾、干燥得氫化可的松,精制：用有機(jī)溶劑重結(jié)晶法進(jìn)行精制用16倍左右的甲醇或乙醇重結(jié)晶，即可以得到精制的氫化可的松，熔點(diǎn)212℃以上,存在的問題,生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率較低，投料濃度亦低，氧化的專屬性不夠理想，是氫化可的松生產(chǎn)中存在的問題，有待于進(jìn)一步研究。國外在氫化可的松的生產(chǎn)中，用新月彎孢霉在玉米漿培養(yǎng)基中將化合物S直接轉(zhuǎn)化成氫化可的松，11β-OH轉(zhuǎn)化