實驗室hbvdna定量檢測的臨床意義北京大學(xué)

1、1,博士，北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系副教授，碩士研究生導(dǎo)師,SCI期刊《Journal of Gastroenterology and Hepatology》、《Archives of Virology》和《Immunological Investigations》和《中國病毒病雜志》、《中華微生物學(xué)和免疫學(xué)》的長期審稿人,主要研究課題 艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項“十二五”課題“乙型和丙型病毒性肝

2、炎診斷及臨床監(jiān)測的研究”子課題“新研制及優(yōu)化試劑的質(zhì)量評價”（批準(zhǔn)號：2012ZX10002005-004）； 科技部863課題“高靈敏檢測試劑及基于基因組的診療技術(shù)”（批準(zhǔn)號：2012AA022605） “艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項“十一五”課題 “丙型肝炎的臨床轉(zhuǎn)歸及難治性丙肝的機(jī)制和治療方案優(yōu)化”（批準(zhǔn)號：2008ZX10002-013）。 國家自然科學(xué)基金面上項目

3、“HCV慢性感染者和病毒自發(fā)清除者外周血單核細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答特征研究”（批準(zhǔn)號：81271826）。,沈 弢北京大學(xué) 病原生物學(xué)系taoshen@hsc.pku.edu.cn,2013-06-02,2,“十一五”重大傳染病專項計劃病毒性肝炎重大研究專項啟動(2009年),表1 、國家中長期科技發(fā)展規(guī)劃綱要（2006~2020年）確定的重大科技專項,Hepatology, 2009J Hepatol, 2012,,●201

4、2：為了避免乙肝復(fù)發(fā)，HBV DNA需控制在實時熒光PCR檢測不到的水平（＜10-15IU/ml）。HBV DNA的監(jiān)測是檢測治療失敗的關(guān)鍵。,●2009：目前，HBV DNA實時熒光定量PCR的靈敏度以達(dá)到5-10IU/ml，檢測上限以達(dá)到8-9log10，用高靈敏度的定量檢測試劑準(zhǔn)確檢測血清HBV-DNA是乙肝抗病毒治療過程中療效觀察和治療終點判定的關(guān)鍵因素。,超敏感（Hypersensitivity）—乙肝檢測靈敏度應(yīng)達(dá)到10-

5、15IU/ml，丙肝檢測靈敏度達(dá)到50IU/ml，從而幫助醫(yī)生確定治療終點，同時及時監(jiān)測耐藥的發(fā)生。寬線性范圍（ wider dynamic range ）—試劑盒線性定量范圍應(yīng)為1-9log10IU/ml，以幫助醫(yī)生準(zhǔn)確測定病毒感染的基線水平，并有效評估抗病毒治療的效果，為患者提供最優(yōu)治療方案。高特異性（ High specificity）—試劑盒應(yīng)能夠檢測肝病毒各基因亞型，有效避免假陰性及漏檢情況的發(fā)生?？芍貜?fù)性好（ Re

6、peatability）—試劑盒操作過程要簡單，以最大程度上減少操作誤差，同時檢測結(jié)果的重復(fù)性要好，以保證肝病治療過程中監(jiān)測指標(biāo)的準(zhǔn)確性和有效性。,國際指南對HBV DNA檢測的要求,我國曾是世界上HBV感染流行最高的地區(qū)之一,,WHO/CDS/CSR/LYO/2002.2:Hepatitis B,9.75%,全國13億人口，5-6億曾感染HBV, 占全國總?cè)丝诮?0%1~59歲人群血清HBsAg流行率 7.18% (2006),

7、FM Lu, et al. J. of Viral Hepatitis 2009FM Lu & H Zhuang. Chiness J. of MedicineX.Liang, et al. J.of Infectious Disease, 2009X.Liang, et al. Vaccine, 2009,,（一） 慢性乙型肝炎 （二） 乙型肝炎肝硬化 （三） 攜帶者 （四） 隱匿性慢性乙型肝炎,慢性乙型肝炎

8、臨床診斷類型,臨床診斷臨床癥狀、疾病史實驗室診斷生化學(xué)檢查HBV血清學(xué)檢測（抗原/抗體系統(tǒng)）HBV DNA（基因型、亞型和變異檢測）病理學(xué)診斷影像學(xué)診斷,診斷依據(jù),慢性HBV感染臨床診斷,HBV攜帶者(HBV DNA+),攜帶者,慢性乙肝,HBeAg-慢乙肝,乙肝肝硬化,乙肝相關(guān)肝癌,隱匿性慢性乙肝,非活動性HBsAg攜帶者(HBV DNA－),,,,,,,輕、中、重,,活動期和靜止期,代償期,失代償期,,,,,,,,,

9、HBeAg+慢乙肝,,,醫(yī)藥科技的進(jìn)步已經(jīng)使慢性乙型肝炎已成為可以治療的慢性疾病,2005年我國制定了第一部《慢性乙型病毒性肝炎防治指南》,,規(guī)范的抗病毒治療可以有效地阻斷或減緩疾病進(jìn)展、減少終末期肝病的發(fā)生,,,免疫耐受期,,,,HBeAg+ HBeAg-/anti-HBe+ (preC/core promoter mutants),,,HBV DNA,<

10、 2000 IU/mL,> 2000 IU/mL,> 2 x 107 IU/mL,> 2 x 104 IU/mL,(HBeAg+ CHB),(Inactive-carrier state),(HBeAg- CHB),,,ALT,,,Normal/minimal change/mild CH,Moderate/severe CH,Moderate/severe CH,Normal/mild CH moderate fib

11、rosis,Cirrhosis,,Cirrhosis,,Inactive cirrhosis,,,2-6%/yr,8-10 %/yr,,20-30%,Modified from Lok et al. Hepatology 2007;45:507-539Pungpapong et al. Mayo Clin Proc 2007;82:967-975.,免疫清除期（免疫活動期）,免疫控制期(低病毒復(fù)制期),再活動期,侯金林教授惠許,,

12、臨床治療的進(jìn)步對實驗室檢測提出了新的要求,慢性HBV感染分期及相關(guān)實驗室檢測指標(biāo),魯鳳民，莊輝，乙型肝炎實驗室診斷研究進(jìn)展 2009,,慢性乙型肝炎的診斷開展抗病毒治療的重要指標(biāo)：　　　 HBeAg陽性慢乙肝患者：HBV DNA ≥20 000 IU/mL，伴有肝臟損傷者 (ALT升高，或肝活檢發(fā)現(xiàn)肝臟炎癥)；HBeAg陰性慢乙肝患者：HBV DNA ≥2 000 IU/mL伴有肝臟損傷指標(biāo)，即應(yīng)開始抗病毒治療。代償期肝硬化

13、患者：HBV DNA +,HBV DNA的定量檢測已經(jīng)成為臨床治療的關(guān)鍵指標(biāo),HBV DNA的定量檢測已經(jīng)成為臨床治療的關(guān)鍵指標(biāo),判斷抗病毒治療療效（RGT）　以治療24周時血清HBV DNA絕對水平判斷：完全病毒學(xué)應(yīng)答：低于60 IU/mL 部分應(yīng)答：低于2 000 IU/mL應(yīng)答不充分： 60 IU/mL～ 2 000 IU/mL,例如：HBV DNA載量檢測在治療優(yōu)化路線圖中的作用,例如：HBV DNA載量檢測在治

14、療優(yōu)化路線圖中的作用,HBV DNA的定量檢測已經(jīng)成為臨床治療的關(guān)鍵指標(biāo),在多個國家和地區(qū)的慢乙肝防治指南，均把用靈敏的PCR檢測方法檢測不到HBV DNA作為停藥的重要指證。,,,Domestic A,Ampllcor Monltor,Cobas TaqMan,RealArt HBV LC PCR(ArtusBiotech),Abbot Real-timeHBV (Abbott),Versant HBV DNA 1.0(

15、kPCR,Siemens),,,,,,,10,102,103,104,105,106,107,108,109,,,,,,(IU/mL),,,,,,,HBV DNA定量檢測試劑及其檢測靈敏度和線性范圍,Domestic B,以上數(shù)據(jù)來源：各企業(yè)試劑說明書,國產(chǎn)乙肝病毒DNA定量試劑在檢測方法上與進(jìn)口試劑存在明顯差別,原因分析,一步法煮沸釋放HBV DNA +定量擴(kuò)增,自動化提取制備HBV DNA +擴(kuò)增檢測,VS,1ul,國產(chǎn)試劑

16、的實際用于檢測的血清量僅為1 ul,200ul,,,國內(nèi)現(xiàn)有核酸檢測技術(shù)流程,PCR體系配置,核酸提取,熒光PCR儀器操作,PCR體系配置，核酸提取，熒光PCR檢測。一站式全自動檢測！,國外的全自動核酸檢測儀器,國產(chǎn)乙肝病毒DNA定量試劑質(zhì)量的提高需向系統(tǒng)（試劑+體系）轉(zhuǎn)換,對策1：技術(shù)進(jìn)步，全自動的核酸提取設(shè) 備+基于開放設(shè)備的定量試劑 √對策2：通過行政手段淘汰劣質(zhì)試劑； √

17、 對策3：由維價格論→綜合考慮質(zhì)量與價格√,我們已經(jīng)完成配合自動化儀器的磁珠核酸提取試劑，達(dá)到國外先進(jìn)水平。,圣湘公司磁珠法提取效果,國外著名C公司提取效果,圣湘公司自主研發(fā)的核酸提取試劑（磁珠法），實現(xiàn)了DNA/RNA共提取。效果等效于國外著名同類試劑。HBV靈敏度可達(dá)10IU/ml，HCV靈敏度達(dá)20IU/ml。,10IU/ml,,磁珠核酸提取試劑可在各種不同儀器上進(jìn)行下游檢測,30,定量檢測

18、HBV感染者血漿 (清) HBV DNA是了解肝內(nèi)HBV復(fù)制水平的可靠指標(biāo)，也是HBV感染診斷、療效監(jiān)控和指導(dǎo)用藥的重要指標(biāo)。近年，國產(chǎn)試劑的質(zhì)量得到很大改進(jìn)，但多數(shù)試劑的靈敏度、準(zhǔn)確性及重復(fù)性等與進(jìn)口優(yōu)質(zhì)試劑相比，仍存在較大差距。尤其對低病毒載量或存在干擾物質(zhì)的臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測時，差距更為明顯。目前我國市場上主流的國產(chǎn)HBV DNA定量試劑盒多是基于即將廢除的煮沸法核酸提取方法，檢測下限一般為500~1000 IU/ml，不能滿足

19、臨床診斷的需求。在國家“十二.五”傳染病防治重大專項“乙型病毒性肝炎臨床診斷及監(jiān)測技術(shù)的研究”的支持下，基于磁珠法核酸提取的國產(chǎn)HBV DNA定量試劑盒已成為主流研發(fā)方向。,31,,對國產(chǎn)湖南圣湘乙型肝炎病毒核酸定量檢測（PCR-熒光探針法）試劑盒的可溯源性、準(zhǔn)確度、精密度和臨床應(yīng)用進(jìn)行質(zhì)量考評。,32,,用基于磁珠法自動化核酸提取平臺的該國產(chǎn)HBV DNA定量試劑盒和羅氏HBV DNA定量試劑盒對WHO的 HBV DNA系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)

20、品 (50、200、2000、20 000 IU/ml) 進(jìn)行溯源性分析，確定試劑盒檢測的可靠性。用這2種試劑盒對HBV B和C基因型標(biāo)準(zhǔn)血漿 (分別稀釋為25、50、200、2 000、20 000、200 000 IU/ml) 分別在三個不同檢測中心共進(jìn)行216次平行檢測，比較其準(zhǔn)確度和精密度。用2種方法平行檢測5份HBV DNA陰性血漿樣本和37份不同病毒載量的HBV DNA陽性臨床血漿標(biāo)本，并評價其相關(guān)性和符合率。,33,,

21、34,35,Roche COBAS,Roche COBAS 2.0,湖南圣湘,ABBOTT kit,36,,37,購買獲得WHO HBV-DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于評價不同公司HBV-DNA定量檢測方法的可溯源性（traceability）。HBV標(biāo)準(zhǔn)品將用HBV陰性EDTA抗凝血漿進(jìn)行稀釋。稀釋濃度初步設(shè)定為50、200、2,000/20,000 IU/mL四個臨床治療關(guān)鍵的節(jié)點濃度值。每天每種儀器檢測上述稀釋濃度樣本一個反應(yīng)（含對照

22、管）。共檢測三天（即每種濃度檢測3次）。以上檢測均在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部微生物系進(jìn)行。,38,WHO genotype A2 Panel,Roche COBAS 2.0,Sansure,Rep 1,Rep 2,Rep 3,Rep 1,Rep 2,Rep 3,,,,Day 1:,Day 2: repeat the above testing pattern,Day 3: repeat the above testing pattern,NI

23、BSC：英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)與檢定所,39,40,由第三方提供高濃度的HBV B&C亞型標(biāo)準(zhǔn)血漿。血漿HBV病毒載量須大于1,000,000。以上血漿用HBV陰性EDTA抗凝血漿進(jìn)行稀釋。稀釋濃度設(shè)定6個評價節(jié)點：25、 50、200、2,000、20,000 、200,000 IU/mL。每天每種儀器檢測上述稀釋濃度樣本一個反應(yīng)（含對照管）。共檢測三天（即每種濃度檢測3次）。準(zhǔn)確度判斷標(biāo)準(zhǔn)為所有檢測節(jié)點上的的相對偏差 均在

24、±0.3 lg IU/ml之內(nèi)為可接受范圍。精確度判定依據(jù)對同一檢測節(jié)點平行檢測9次后的變異系數(shù)，變異系數(shù)越小意味精確度越高。以上檢測將在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部微生物系、首都醫(yī)科大學(xué)附屬佑安醫(yī)院、湖南湘雅醫(yī)院傳染病科三地多中心同時進(jìn)行。,HBV B基因型標(biāo)準(zhǔn)血漿：衛(wèi)生部國家臨檢中心惠贈，編號GBW09150，濃度為1.2×106 IU/ml。HBV C基因型標(biāo)準(zhǔn)血漿：中國藥品生物制品檢定所惠贈。濃度為2×108

25、 IU/ml。,,41,Day 1:,Day 2: repeat the above testing pattern,Rep 1,Rep 2,Rep 3,,Rep 1,Rep 2,Rep 3,,Sansure,Genotype BPanel,Roche,,Rep 1,Rep 2,Rep 3,,Rep 1,Rep 2,Rep 3,,Sansure,Genotype CPanel,Roche,Day 3: repeat the abov

26、e testing pattern,42,43,國產(chǎn)新型試劑盒的檢測結(jié)果較穩(wěn)定，相對偏差均在±0.1lg IU/mL范圍內(nèi)。羅氏試劑盒的檢測結(jié)果盡管均在可接受范圍內(nèi)，但針對B基因型標(biāo)準(zhǔn)血清，相對偏差基本位于0.2～0.3 lg IU/ml。,44,2種試劑盒之間精密度的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。,45,2種試劑盒對HBV DNA低載量血漿樣本檢測的變異系數(shù)均顯著高于高載量血漿(B基因型：P=0.0031；C基因型：P=0.0005)

27、。,46,臨床血清盤： 共42份, 含5份HBV DNA陰性 (HBsAg和抗-HBc陰性) 和37份HBV DNA陽性 (Abbott RealTime HBV Test試劑盒檢測判定) 不同滴度水平的血漿樣本。分別用Roche、圣湘HBV核酸定量試劑盒檢測，比較三者之間的符合率和特異性。,湖南圣湘和羅氏HBV DNA定量試劑盒對42份臨床血清盤測定結(jié)果的比較分析,總符合率：97.62%,47,對37份陽性樣本兩種檢測試劑的檢測結(jié)果為

28、顯著相關(guān),48,臨床血清盤中有2個樣本（編號236和283）Roche HBV試劑反復(fù)檢測為陽性，但是低于20 IU/ml。用圣湘磁珠法試劑反復(fù)檢測結(jié)果均在10 IU/ml左右。 我們在圣湘公司試劑檢測靶基因區(qū)域之外，設(shè)計了套巢式引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和克隆測序，同時嚴(yán)格設(shè)置陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控，把擴(kuò)增產(chǎn)物送往測序公司進(jìn)行克隆測序。結(jié)果證實編號236和283兩個樣本的測序結(jié)果為HBV基因組序列，測序長度為258bp，與理論序列長

29、度一致?？寺y序結(jié)果與HBV A～H基因型標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，證明均為C基因型，但分屬于2個不同的亞簇。,,,49,湖南圣湘研發(fā)的國產(chǎn)新型試劑盒與羅氏試劑盒在溯源性、準(zhǔn)確度、精密度等指標(biāo)上無明顯差異。由于未能收集足夠數(shù)量超高病毒載量的臨床標(biāo)本 (>2.0×108 IU/ml)，本研究未能對該2種試劑盒的線性范圍進(jìn)行嚴(yán)格的評價。新型國產(chǎn)試劑盒在保存溫度及時間方面尚有待改進(jìn) [羅氏試劑盒為2~8℃，25個月；國產(chǎn)試劑