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文檔簡(jiǎn)介
1、沙打旺(Astragalus adsurgens)是我國特有豆科牧草,適宜于干旱、半干旱和半荒漠地區(qū),具有治理水土流失等生態(tài)作用。沙打旺黃矮根腐病是由沙打旺埃里磚格孢(Embellisia astragali)引致的沙打旺上最重要的病害之一,為系統(tǒng)性病害、氣傳病害和種傳病害。此前研究表明該病菌的形態(tài)特征及在寄主體內(nèi)的生活特性與瘋草內(nèi)生真菌(Alternaria spp.=Undifilum spp.。Embellisa spp.)相似,
2、但由于尚未見其分子生物學(xué)方面的報(bào)道,故二者相似的論斷尚缺少分子生物學(xué)的佐證。為減少種子傳播途徑和分子育種,減少病害的發(fā)生,有必要研制出種帶該病菌的快速檢測(cè)技術(shù),以及挖掘出其致病基因。
本研究主要內(nèi)容包括:⑴基于3-磷酸甘油醛脫氫酶(GPD)、RNA聚合酶II第二大亞基(RPB2)和轉(zhuǎn)錄延伸因子1-α(TEF-1)的聯(lián)合多基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,確定該病菌與鏈格孢屬波浪芽管孢組 Genus Alternaria Section U
3、ndifilum的模式種 A. bornmuelleri DAOM231361均屬于同一組;基于核糖體編碼基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和GPD多基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,顯示該病菌與6種瘋草中的4種瘋草內(nèi)生真菌不同,屬另一物種,兩個(gè)系統(tǒng)樹中上述兩個(gè)分支的MP自展支持率和貝葉斯后檢支持率都分別為100%和1.00;再加上此菌也具有鏈格孢屬波浪芽管孢組典型形態(tài)特征“波浪芽管”,鑒于種加詞“astragali”已被其他真菌占用。故將其更名為甘肅鏈格
4、孢Alternaria gansuense comb. nov.,厘清了沙打旺黃矮根腐病菌與瘋草內(nèi)生真菌之間的關(guān)系。⑵根據(jù)細(xì)胞質(zhì)膜三磷酸腺苷水解酶基因片段(ATPase)設(shè)計(jì)出此菌的特異性檢測(cè)引物AatpF(GTCGAGAGTTTTTTCTT)和AatpR(GGTGGAGCTGGGTTGTTTTA),利用此特異引物進(jìn)行普通PCR,可檢測(cè)出沙打旺種子中5 pg/μL以上的此病菌DNA,帶菌率1.5%的種子;熒光定量PCR擬合方程為Ct=-
5、3.226×(log[DNA])+29.055,相關(guān)系數(shù)為0.9987,最低可以檢測(cè)0.5 pg/μL沙打旺黃矮根腐病菌DNA。運(yùn)用本方法可以準(zhǔn)確快速檢驗(yàn)檢疫沙打旺種帶黃矮根腐病菌,預(yù)防該病在新建植人工栽培沙打旺草地致病成災(zāi)。⑶根據(jù)線粒體內(nèi)核糖體小亞基編碼基因(mtSSU)基因設(shè)計(jì)出瘋草內(nèi)生真菌特異性檢測(cè)引物OmtssuF(CATAGAAAAAAAAATAAACAAACTG)和OmtssuR (TGTCTGCCCAGGTTACGG),利
6、用此特異引物進(jìn)行普通 PCR檢測(cè),最低檢測(cè)瘋草樣品中含5 pg/μL內(nèi)生真菌DNA,熒光定量 PCR擬合方程為 Ct=-2.9105*(log[DNA])+31.213,相關(guān)系數(shù)為0.9973,最低檢測(cè)限為5 fg/μL瘋草內(nèi)生真菌 DNA。該方法可以應(yīng)用于揭示瘋草中內(nèi)生真菌含量與有毒物質(zhì)苦馬豆素含量之間的關(guān)系研究中。⑷以基因組DNA為模板,采用真菌鈣調(diào)素保守區(qū)兼并引物 CAL-228F和CAL-737R擴(kuò)增得539 bp的同源片段;采
7、用 Hi-TAIL PCR分別獲得344 bp的5’側(cè)翼序列和729 bp的3’側(cè)翼序列,拼接獲得基因的1290 bp的全長(zhǎng) DNA序列;利用全長(zhǎng)引物CaMF和CaMR,得到840 bp的DNA全長(zhǎng)序列和450 bp的cDNA全長(zhǎng)序列,DNA全長(zhǎng)序列中有4個(gè)內(nèi)含子,均具有典型的AT-AG特征,cDNA全長(zhǎng)序列翻譯出149氨基酸多肽,與其他真菌的鈣調(diào)素高度同源。再次采用Hi-TAIL PCR技術(shù)克隆鈣調(diào)素基因5′端992bp和3′端109
8、6 bp的側(cè)翼序列,在此基礎(chǔ)上,用Split-Marker技術(shù),構(gòu)建了沙打旺黃矮根腐病菌鈣調(diào)素基因的敲除載體,為后續(xù)闡明其調(diào)控該菌生物學(xué)功能、致病性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。⑸將液體搖瓶培養(yǎng)15天的沙打旺黃矮根腐病菌菌絲為材料,以0.6M MgSO4為穩(wěn)滲劑,20 mg/mL Glucanex+20mg/mL Glucanase+20 mg/mL纖維素酶+0.16 UN/mL幾丁質(zhì)酶復(fù)配,30℃,120rpm水浴振蕩酶解6h,四層擦鏡紙-漏斗法過濾
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