臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)質(zhì)量保證

1、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的質(zhì)量保證,衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心 李金明,質(zhì)量保證(Quality Assurance,QA),為一產(chǎn)品或服務(wù)滿足特定質(zhì)量要求提供充分可信性所必要的有計(jì)劃的和系統(tǒng)的措施。,室內(nèi)質(zhì)量控制（Internal Quality Control,IQC)的概念,由實(shí)驗(yàn)室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測(cè)和控制本實(shí)驗(yàn)室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗(yàn)的一致性，以確定測(cè)定結(jié)

2、果是否可靠、可否發(fā)出報(bào)告的一項(xiàng)工作。可概括為:(1)執(zhí)行者：實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員；(2)目的：監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的重復(fù)性；(3)功能：決定了當(dāng)批測(cè)定的有效性，報(bào)告可否發(fā)出。是對(duì)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的即時(shí)性評(píng)價(jià)。,室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（External Quality Assessment, EQA）,為客觀比較一實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定結(jié)果與靶值的差異，由外單位機(jī)構(gòu)，采取一定的辦法，連續(xù)、客觀地評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結(jié)果，使各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果具有可比性。這是對(duì)實(shí)驗(yàn)

3、室操作和實(shí)驗(yàn)方法的回顧性評(píng)價(jià)，而不是用來決定在實(shí)時(shí)的測(cè)定結(jié)果的可接受性。當(dāng)EQA用來為執(zhí)業(yè)許可或?qū)嶒?yàn)室認(rèn)證的目的而評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)，常描述為實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證（Proficiency testing, PT）。在以前的文獻(xiàn)中，EQA常描述室間質(zhì)量控制。,批 (Run),在相同條件下所獲得的一組測(cè)定。,定 義,正態(tài)分布(Gaussian distribution) 當(dāng)一質(zhì)控物用同一方法在不同的時(shí)間重復(fù)多次測(cè)定，當(dāng)測(cè)定數(shù)據(jù)足夠多時(shí)，如以

4、橫軸表示測(cè)定值，縱軸表示在大量測(cè)定中相應(yīng)測(cè)定值的個(gè)數(shù)，則可得到一個(gè)兩頭低，中間高，中為所有測(cè)定值的均值，左右對(duì)稱的“鐘形”曲線，亦即正態(tài)分布，又稱高斯分布。,正態(tài)分布的基本統(tǒng)計(jì)學(xué)含義可用均數(shù)（X）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和概率來說明。,臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)測(cè)定步驟,標(biāo)本收集：選擇測(cè)定項(xiàng)目、標(biāo)本收集和保存。實(shí)驗(yàn)室測(cè)定：標(biāo)本接收、貼標(biāo)簽、樣本處理、核酸擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測(cè)、測(cè)定的有效性和臨床診療價(jià)值。報(bào)告和解釋：結(jié)果發(fā)出、結(jié)果解釋和臨床管理。,

5、質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)之間的關(guān)系,臨床標(biāo)本收集、運(yùn)送、保存及其質(zhì)量控制,標(biāo)本收集 標(biāo)本保存標(biāo)本運(yùn)送,標(biāo)本收集,標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果的影響 標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備 標(biāo)本的類型和采集量 采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià) 采樣及運(yùn)輸容器 標(biāo)本采集中的防污染,標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果的影響,在疾病發(fā)展過程中，標(biāo)本采集過早或過晚都可能會(huì)給出假陰性結(jié)果。,標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備,血液標(biāo)本采集分泌物標(biāo)本:采集部位的清潔消毒可去掉污染的微生物

6、或其它雜物,但應(yīng)適度,過度清潔消毒有可能會(huì)去掉或破壞靶微生物,故標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備應(yīng)由訓(xùn)練有素的人員進(jìn)行。,標(biāo)本的類型和采集量,標(biāo)本的類型: 血清(漿)、分泌物、痰、糞便、尿和腦脊液等。標(biāo)本的采集量:應(yīng)根據(jù)所測(cè)病原體而定。一般來說，如果標(biāo)本的量對(duì)病原體培養(yǎng)夠用的話，則其量亦足以用于核酸提取及其后的擴(kuò)增檢測(cè)。對(duì)于定量測(cè)定來說，對(duì)標(biāo)本的收集要求更為精確。,采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià),血清(漿)標(biāo)本:溶血、脂血等；分泌物、痰：評(píng)價(jià)內(nèi)容包括細(xì)胞組成

7、，所需類型細(xì)胞的數(shù)量和核酸總量。 評(píng)價(jià)方法：包括肉眼觀察,顯微鏡下觀察和化學(xué)分析等。,采樣及運(yùn)輸容器,標(biāo)本的采集材料如棉簽應(yīng)為一次性使用；采樣及運(yùn)輸容器應(yīng)為密閉的一次性無菌裝置；采樣所用的防腐劑、抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對(duì)核酸擴(kuò)增及檢測(cè)過程造成干擾。,標(biāo)本采集中的防污染,采集中要特別注意污染，防止混入操作者的頭發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液等； 如使用玻璃器皿，必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的RNase失活。,標(biāo)本保存,靶核酸(尤其是RNA

8、)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此標(biāo)本的保存對(duì)于核酸擴(kuò)增測(cè)定的有效性極為重要。 使用GITC作為穩(wěn)定劑保存標(biāo)本，標(biāo)本可在室溫下穩(wěn)定約7天。,標(biāo)本保存,臨床體液標(biāo)本長(zhǎng)期保存應(yīng)在-70℃下。 如為提取核酸后用于DNA擴(kuò)增分析的樣本，可于10 mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.5～8.0)緩沖液中4 ℃下保存。 用于RNA擴(kuò)增分析的樣本，則應(yīng)于上述緩沖液中-80℃或液氮下保存。 核酸的乙醇沉淀物則可于-20℃下

9、保存。,標(biāo)本運(yùn)送,樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。樣本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑,如用于RNA測(cè)定加入GITC的血清(漿)樣本和用于DNA測(cè)定的EDTA抗凝血等,則可在室溫下運(yùn)送或郵寄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)待測(cè)靶核酸的特性，對(duì)各種臨床樣本的運(yùn)送條件作出相應(yīng)的規(guī)定。,臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)量控制,測(cè)定前的質(zhì)量控制核酸樣本的制備及其質(zhì)量控制 統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制質(zhì)量控制的評(píng)價(jià),測(cè)定前質(zhì)量控制,實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理理想的試劑和

10、操作方法 人員培訓(xùn),實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理,臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有充分合理的空間、良好的照明和空調(diào)設(shè)備 ；實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備應(yīng)保養(yǎng)良好，實(shí)驗(yàn)用品要達(dá)到相應(yīng)的要求。加樣器的校準(zhǔn)？帶濾塞吸頭的使用及質(zhì)檢？離心機(jī)？熱循環(huán)儀？水浴箱和/或恒溫干浴儀？酶標(biāo)儀和洗板機(jī)？,理想的核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)A,,理想的核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)B,核酸擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的一般原則,各區(qū)獨(dú)立注意風(fēng)向因地制宜方便工作,“十六字口訣”,A,B,傳遞窗,

11、傳遞窗,傳遞窗,,“無基因”或“無核酸”概念的重要性,基因擴(kuò)增儀器設(shè)備的質(zhì)控,帶濾芯吸頭的使用及質(zhì)檢,首先制備一個(gè)含1～2%甘油及色素（如甲基橙）的水溶液，如果吸頭的最大體積為100μl，則將加樣器吸取體積調(diào)至110～120μl，再套上吸頭后吸取上述有色液體。如果吸頭質(zhì)量好，則有色液體不應(yīng)出現(xiàn)在濾芯之上，否則說明濾芯不嚴(yán)。,核酸提取用離心管質(zhì)檢,離心管PCR抑制物質(zhì)檢其他,擴(kuò)增儀孔間溫度的重復(fù)性和均一性的檢測(cè)方法,一是使用一種熱電偶

12、探針、微伏轉(zhuǎn)換器和自動(dòng)圖示記錄儀組成擴(kuò)增加熱模塊孔內(nèi)溫度監(jiān)測(cè)記錄系統(tǒng)，當(dāng)孔間溫度變異超出1℃時(shí)，其可測(cè)出來。具體做法是將裝有TE緩沖液并上加石蠟油的擴(kuò)增反應(yīng)管放置于擴(kuò)增儀各孔中，熱電偶探針透過擴(kuò)增反應(yīng)管蓋插至緩沖液中，然后按程序進(jìn)行一個(gè)常規(guī)的PCR擴(kuò)增，加熱模塊如為96孔，則至少要測(cè)定12孔不同位置孔內(nèi)的溫度，在整個(gè)擴(kuò)增過程中，可移動(dòng)熱電偶探針至上述不同孔中監(jiān)測(cè)溫度，但每一孔內(nèi)溫度監(jiān)測(cè)至少要有一個(gè)擴(kuò)增周期。,擴(kuò)增儀孔間溫度的重復(fù)性和

13、均一性的檢測(cè)方法,第二種方法并非直接測(cè)定孔內(nèi)溫度，而是通過擴(kuò)增功能來間接獲知孔間的均一性，即將加有一已知的含一定濃度的陽性質(zhì)控樣本的擴(kuò)增反應(yīng)管置于擴(kuò)增儀各孔中按常規(guī)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，觀察結(jié)果的一致性程度，如果有某一個(gè)或幾個(gè)孔結(jié)果有問題，則應(yīng)確定這一個(gè)或幾個(gè)孔是否會(huì)重復(fù)性地得到假陰性結(jié)果，如果是，則表明相應(yīng)孔的熱傳導(dǎo)有損壞。,理想的試劑和操作方法,試劑盒的質(zhì)檢定量測(cè)定的精密度是測(cè)定組成步驟的變異和的平方根(SD)= 上式中SDa、SDb

14、、SDc是步驟a、b、c等（例如試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本采集、核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)等）的標(biāo)準(zhǔn)差,,理想的試劑和操作方法,改善測(cè)定精密度的措施必須首先著重在最不精密的步驟上，應(yīng)對(duì)試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本收集、核酸提取、測(cè)定方法和儀器操作寫出“標(biāo)準(zhǔn)操作程序”(SOP),實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系的建立,質(zhì)量手冊(cè)質(zhì)量體系程序文件標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP) (相關(guān)記錄表格、報(bào)告),存在問題,SOP：形式，缺乏可操作性記錄：檢查型。多而雜。質(zhì)控：形式或沒有

15、分析：缺乏。,實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理的內(nèi)涵,寫你所應(yīng)做的做你所寫的記錄你已做的分析你已做的,看得見的看不見的,好習(xí)慣是生產(chǎn)力習(xí)慣即命運(yùn)思維習(xí)慣與行為習(xí)慣羅馬不是一天建成的(Rome was not built in a day ),質(zhì)量體系文件的三大特性,法規(guī)性、唯一性和適用性。法規(guī)性:是指文件一旦制定完成并批準(zhǔn)實(shí)施，就必須認(rèn)真執(zhí)行，按照相應(yīng)的文件去完成日常檢驗(yàn)工作，也就是前面所說的做你所寫的。并且文件的修改不能隨意，只能按

16、規(guī)定的程序進(jìn)行。唯一性:則是指（1）一個(gè)實(shí)驗(yàn)室只能有一個(gè)質(zhì)量體系文件系統(tǒng)；（2）一項(xiàng)檢驗(yàn)活動(dòng)只能有唯一的操作程序；（3）一項(xiàng)規(guī)定只能有唯一的理解，不產(chǎn)生歧義；（4）只能使用文件的有效版本，無效版本在實(shí)驗(yàn)室的任何地方都不能使用。適用性:是指質(zhì)量體系文件無統(tǒng)一格式；無標(biāo)準(zhǔn)文本；怎么做怎么寫，切合實(shí)際，具有可操作性，不拘一格。所有文件的規(guī)定均應(yīng)保證在臨床實(shí)際檢測(cè)工作中能完全做到。當(dāng)發(fā)現(xiàn)文件有不適合情況時(shí)，則應(yīng)立即按規(guī)定程序?qū)ξ募M(jìn)行修改。

17、,SOP等于試劑盒說明書嗎？,怎樣編寫SOP？,SOP （5W和1H）,誰來做(Who)： 責(zé)任人做什么(What)：適用范圍何時(shí)（When）：適用范圍何地（Where）：適用范圍為什么做（Why）：目的如何做（How）：操作步驟,實(shí)驗(yàn)記錄表格的設(shè)計(jì),存在問題,表格種類繁多重復(fù)記錄表格無實(shí)用性，用于檢查的痕跡很重,記錄表格設(shè)計(jì)的基本原則,信息充分簡(jiǎn)單明了臨床標(biāo)本的檢測(cè)信息能有機(jī)聯(lián)系起來融入LIS系統(tǒng)？,臨床PC

18、R檢驗(yàn)流程記錄表 檢驗(yàn)日期 檢驗(yàn)項(xiàng)目： 擴(kuò)增儀中保存文件名： 使用說明：1．本記錄表須嚴(yán)格遵循試劑準(zhǔn)備區(qū)?標(biāo)本制備區(qū)?擴(kuò)增區(qū)（產(chǎn)物分析區(qū)）單一流向移動(dòng)，嚴(yán)禁逆向移動(dòng)。2．各項(xiàng)工作執(zhí)行后，在相應(yīng)敘述前的“?”內(nèi)打“?”。3．本記錄表最后與相應(yīng)的標(biāo)本接收記錄等歸檔保存于擴(kuò)增區(qū)的專用文件柜內(nèi)，以備查找。,實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備? 試劑在有效期內(nèi) ? 擴(kuò)增

19、儀、加樣器和溫度計(jì)在校準(zhǔn)的有效期內(nèi)? 生物安全柜的濾膜在使用有效期內(nèi) ? 消毒溶液在有效期內(nèi)? 洗眼器內(nèi)無菌生理鹽水在有效期內(nèi) ? 離心管、帶濾芯吸頭已經(jīng)過質(zhì)檢合格 操作者：,試劑準(zhǔn)備區(qū)（1區(qū)）實(shí)驗(yàn)前

20、： ? 打開通風(fēng)設(shè)備 ? 實(shí)驗(yàn)臺(tái)面清潔（水或70%酒精擦拭）? 冰箱溫度：冷藏室（2~8℃） ℃； 冷凍室（?18℃?2℃） ℃? 實(shí)驗(yàn)室溫度： ℃（允許范圍：10~30℃）；相對(duì)濕度： （允許范圍：30%~80%）PCR試劑來源： （可直接列出有關(guān)廠家名稱） 批號(hào)：XXXXXXX 檢驗(yàn)項(xiàng)目：

21、 本次實(shí)驗(yàn)用量： 人份，剩余量： 人份。其他有關(guān)試劑配制：? 按XXX（將有關(guān)SOP編號(hào)列出）SOP配制1%含氯消毒液 毫升；? 按XXX（將有關(guān)SOP編號(hào)列出）SOP配制4％NaOH溶液 毫升；? 按XXX（將有關(guān)SOP編號(hào)列出）SOP配制0.1%焦磷酸二乙酯 毫升；? 按XXX（將有關(guān)SOP

22、編號(hào)列出）SOP配制 毫升；? 其他： 儀器設(shè)備使用：離心機(jī)：? 正常 ? 不正常 振蕩器：? 正常 ? 不正常 超凈臺(tái)：? 正常 ? 不正常實(shí)驗(yàn)后：? 按XXX（將有關(guān)SOP編號(hào)列出）SOP清潔實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面、地面、加樣器和離心機(jī)，并進(jìn)行紫外照射30分鐘以上。? 按XXX（將有關(guān)SOP編號(hào)列出）SOP處理實(shí)驗(yàn)廢棄物。

23、 操作者：,標(biāo)本制備區(qū)（2區(qū)）實(shí)驗(yàn)前： ? 打開通風(fēng)設(shè)備 ? 實(shí)驗(yàn)臺(tái)面清潔（水或70%酒精擦拭）? 冰箱（柜）溫度：冷藏室（2~8℃） ℃； 冷凍室（?18℃?2℃） ℃? 實(shí)驗(yàn)室溫度： ℃（允許范圍：10~30℃）；相對(duì)濕度： （允許范圍：30

24、%~70%）陽性室內(nèi)質(zhì)控物來源： 濃度及批號(hào)： 擴(kuò)增位置： 陰性室內(nèi)質(zhì)控物來源： 批號(hào)： 擴(kuò)增位置： 所取理的標(biāo)本（對(duì)應(yīng)標(biāo)本接收的唯一編號(hào)）及擬擴(kuò)增位置：191725 334149 … …2101826 3442503

25、111927 3543514122028 3644525132129 3745536142230 3846 5471523313947 5581624324048 56核酸提取及加樣過程：按XXX（列出編號(hào)）SOP進(jìn)行。儀器設(shè)備使用： 生物安

26、全柜：? 正常 ? 不正常 恒溫儀溫度校準(zhǔn)： ℃離心機(jī)：? 正常 ? 不正常 振蕩器：? 正常 ? 不正常實(shí)驗(yàn)后：? 按XXX（將有關(guān)SOP編號(hào)列出）SOP清潔實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面、地面及儀器設(shè)備。? 按XXX（將有關(guān)SOP編號(hào)列出）SOP處理實(shí)驗(yàn)廢棄物。 操作者：

27、,另外兩個(gè)存在較多問題的檔案記錄,人員的技術(shù)檔案：一人一個(gè)檔案（包括個(gè)人基本情況；學(xué)歷、學(xué)位、任職資格、培訓(xùn)證、上崗證、榮譽(yù)證書等的復(fù)印件；論文、著作、成果等的目錄和必要的證明文件復(fù)印件；培訓(xùn)考核的記錄等。）儀器設(shè)備的技術(shù)檔案：一臺(tái)儀器一個(gè)檔案（包括儀器基本情況，如儀器設(shè)備名稱、型號(hào)、序列號(hào)、生產(chǎn)廠家、購置日期、啟用日期、目前放置地點(diǎn)、責(zé)任人等；儀器校準(zhǔn)的記錄（本次校準(zhǔn)日期和下次應(yīng)校準(zhǔn)的日期、校準(zhǔn)證書或數(shù)據(jù)）；維修維護(hù)的歷史記錄；儀

28、器使用說明書、注冊(cè)證等的復(fù)印件；合格證書；配備的小配件如保險(xiǎn)絲、燈泡等）,人員培訓(xùn),方法原理核酸擴(kuò)增檢測(cè)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)儀器設(shè)備使用、維護(hù)和校準(zhǔn)結(jié)果的分析、報(bào)告及進(jìn)一步處理質(zhì)控的分析知其然又知其所以然。,實(shí)驗(yàn)室人員內(nèi)部培訓(xùn)的重要性,外部培訓(xùn)提供的是“理念”，是被動(dòng)的，更多的是“學(xué)習(xí)”內(nèi)部培訓(xùn)是主動(dòng)的，源于實(shí)踐，高于實(shí)踐，更多的是“思考”,人員培訓(xùn),如何培訓(xùn)的舉例：新購儀器設(shè)備的操作培訓(xùn),在儀器購買合同中，加入培訓(xùn)的內(nèi)容：廠家提供

29、培訓(xùn)計(jì)劃培訓(xùn)計(jì)劃應(yīng)包括：培訓(xùn)教材（含具體培訓(xùn)內(nèi)容，如儀器操作及維護(hù)校準(zhǔn)的SOP、安全性）、培訓(xùn)者資質(zhì)證明、培訓(xùn)所需時(shí)間與次數(shù)、需要接受培訓(xùn)方準(zhǔn)備的條件（人員、用具和場(chǎng)地等）、培訓(xùn)合格的考核方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)等。培訓(xùn)后保存所有有關(guān)記錄。,核酸樣本的制備、擴(kuò)增檢測(cè)及其質(zhì)量控制,一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理核酸的分離純化靶核酸提取的質(zhì)量 臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì) 核酸樣本制備及擴(kuò)增檢測(cè)的質(zhì)控 產(chǎn)

30、物檢測(cè)的質(zhì)控,核酸的分離純化,核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴(kuò)增的物質(zhì)去除。 經(jīng)典方法硅吸附法對(duì)于商品核酸提取試劑盒，臨床實(shí)驗(yàn)室在使用前，必須對(duì)其核酸提取純度和效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。,臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì),臨床標(biāo)本中：血清或血漿中的血紅素及其代謝產(chǎn)物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份 、降解靶核酸的核酸酶等。核酸提取中：許多試劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢劑如十二烷基硫酸鹽(SDS)和chaotrope試

31、劑如異硫氰酸胍和鹽酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑 。,對(duì)臨床標(biāo)本中可能存在的抑制/干擾物的質(zhì)控措施,質(zhì)控措施： 采用內(nèi)質(zhì)控（internal control, IC）（通常稱為內(nèi)標(biāo)）的方法 內(nèi)標(biāo)有兩種,即競(jìng)爭(zhēng)性的和非競(jìng)爭(zhēng)性的內(nèi)標(biāo)。,核酸提取及擴(kuò)增有效性的質(zhì)控,已知弱陽性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測(cè)標(biāo)本相同）：至少帶1份，其最后的檢測(cè)結(jié)果，應(yīng)是核酸提取和擴(kuò)增檢測(cè)的有效性的綜合反映。已知陰性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測(cè)標(biāo)本相同）：至少帶1份，擴(kuò)

32、增測(cè)定的結(jié)果可以判斷核酸提取過程中是否發(fā)生污染。,室內(nèi)質(zhì)控方法,非統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法,非統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,在檢測(cè)血液標(biāo)本的同時(shí)，檢測(cè)一定數(shù)量（與臨床樣本的數(shù)量相適應(yīng)）的已知弱陽性（與試劑宣稱的測(cè)定下限相適應(yīng)）和陰性的質(zhì)控樣本檢測(cè)有效的質(zhì)控判斷方法：陽性檢測(cè)為陽性（反應(yīng)性），陰性檢測(cè)為陰性（非反應(yīng)性）。,統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制,理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本的條件測(cè)定中質(zhì)控樣本的設(shè)置、數(shù)量及排列順序 統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的特點(diǎn) 統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法,理想的室內(nèi)質(zhì)控

33、樣本的條件,基質(zhì)與待測(cè)樣本一致；所含待測(cè)物濃度接近試驗(yàn)的決定性水平；穩(wěn)定；靶值或預(yù)期結(jié)果已定；無已知的生物傳染危險(xiǎn)性；單批可大量獲得；價(jià)廉,測(cè)定中質(zhì)控樣本的設(shè)置、數(shù)量及排列順序,標(biāo)本量不大，如少于30份，定性測(cè)定有1份接近c(diǎn)ut-off的弱陽性和1份陰性質(zhì)控樣本應(yīng)可以滿足要求。樣本量大，則可按比例增加。定量測(cè)定則要根據(jù)試驗(yàn)的測(cè)定范圍，采用高、中、低三種濃度的質(zhì)控樣本。核酸提取時(shí)，質(zhì)控樣本要隨機(jī)放在臨床標(biāo)本中間。至于在測(cè)

34、定中的排列順序，可排于標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)品之后，臨床樣本之前。,臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控的獨(dú)特性,即監(jiān)測(cè)污染發(fā)生的陰性質(zhì)控的設(shè)置。 可包括1份陰性原血清樣本、1份在標(biāo)本核酸提取過程中帶入的一個(gè)空管和僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管。,陰性原血清質(zhì)控樣本的功能,監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室的以前擴(kuò)增產(chǎn)物的污染； 由實(shí)驗(yàn)操作所致的標(biāo)本間的交叉污染；擴(kuò)增反應(yīng)試劑的污染。,在標(biāo)本核酸提取過程中帶入的一個(gè)空管的功能,監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)操作過程中的實(shí)驗(yàn)室污染和標(biāo)本間交叉污染.不能取

35、代原血清陰性樣本。,僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管的功能,監(jiān)測(cè)擴(kuò)增試劑是否發(fā)生污染，具有較強(qiáng)的污染鑒別性。,實(shí)驗(yàn)室是否發(fā)生污染的鑒別,可將一個(gè)或多個(gè)空管打開靜置于標(biāo)本制備區(qū)30～60分鐘，然后加入擴(kuò)增反應(yīng)混合液同時(shí)以水替代核酸樣本擴(kuò)增，如為陽性，而上述僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管為陰性，則說明實(shí)驗(yàn)室以前擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。,統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的特點(diǎn),檢驗(yàn)誤差有兩類，一是系統(tǒng)誤差，一是隨機(jī)誤差。系統(tǒng)誤差通常表現(xiàn)為質(zhì)控物測(cè)定均值的漂移，是由操作者所使用的儀器設(shè)備、

36、試劑、標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)物出現(xiàn)問題而造成的，這種誤差可以通過前述的措施方法加以控制，是可以排除的。隨機(jī)誤差則表現(xiàn)為測(cè)定SD的增大，主要是由實(shí)驗(yàn)操作人員的操作等隨機(jī)因素所致，其出現(xiàn)難以完全避免和控制。,統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的功能,統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的功能就是發(fā)現(xiàn)誤差的產(chǎn)生及分析誤差產(chǎn)生的原因，采取措施予以避免。開展統(tǒng)計(jì)質(zhì)量控制前，應(yīng)將可以控制的誤差產(chǎn)生因素盡可能地加以控制，這不但是做好室內(nèi)質(zhì)控的前提，也是保證常規(guī)檢驗(yàn)工作質(zhì)量的先決條件。,統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法,基線測(cè)

37、定質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式及定義 Levey-Jennings質(zhì)控圖方法 Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法 累積和 (CUSUM) 質(zhì)控方法 “即刻法”質(zhì)控方法,基線測(cè)定,最佳條件下的變異（Optimal conditions variance, OCV）和常規(guī)條件下的變異（Routine conditions variance, RCV）； 當(dāng)RCV與OCV接近，或小于2 OCV時(shí)，則RCV是

38、可以接受的。以上為批間變異。批內(nèi)變異的測(cè)定；室內(nèi)質(zhì)控物的測(cè)定準(zhǔn)確度的評(píng)價(jià)。,臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)IQC統(tǒng)計(jì)計(jì)算問題,可使用質(zhì)控樣本擴(kuò)增后的IU/ml來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，也可用其對(duì)數(shù)值進(jìn)行。由于基因擴(kuò)增結(jié)果的原始數(shù)據(jù)通常很大，故使用其對(duì)數(shù)值來進(jìn)行質(zhì)控統(tǒng)計(jì)分析可能要更為方便一些。,質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式及定義,質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式 質(zhì)控規(guī)則的功能 常用質(zhì)控規(guī)則的符號(hào)及定義,質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式,通常質(zhì)控規(guī)則以符號(hào)AL來表示，其中A為質(zhì)控測(cè)定

39、中超出質(zhì)量控制限的測(cè)定值的個(gè)數(shù)，L為控制限，通常用均值或均值±1～3SD來表示。 當(dāng)質(zhì)控測(cè)定值超出控制限L時(shí)，即可將該批測(cè)定判為失控。 常用的13S質(zhì)控規(guī)則，其中1為原式中的A，3s為原式中的L，表示均值±3s，其確切的含義為：在質(zhì)控測(cè)定值中，如果有一個(gè)測(cè)定值超出均值±3s范圍，即可將該批測(cè)定判為失控。,質(zhì)控規(guī)則的功能,簡(jiǎn)單地說就是用于判斷測(cè)定批的失控還是在控 。,常用質(zhì)控規(guī)則的符號(hào)及定義,符 號(hào)

40、 定 義12S 一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出±2s控制限。13S 一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出±3s控制限。22S 兩個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+2s或－2s控制限。R4S 同一批測(cè)定中，兩個(gè)不同濃度質(zhì)控物的測(cè)定值之間的 差值超出4s控制限。41S 四個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+1s或

41、－1s控制限。7T 七個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值呈現(xiàn)一個(gè)向上或向下的趨勢(shì)變 化。10X 十個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)處于均值（X）的同一側(cè)。,Levey-Jennings質(zhì)控圖方法,也稱Shewhart質(zhì)控圖，是由美國(guó)的Shewhart 于1924年首先提出，并用于工業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。二十世紀(jì)五十年代初，Levey-Jennings將其引入臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量控制 。經(jīng)Henry和Segalo

42、ve的改良，即為目前常用的Levey-Jennings質(zhì)控圖。,Levey-Jennings質(zhì)控圖,,Levey-Jennings質(zhì)控圖基本的統(tǒng)計(jì)學(xué)含義,穩(wěn)定條件下，在20個(gè)IQC結(jié)果中不應(yīng)有多于1個(gè)結(jié)果超過2SD（95.5%可信限）限度；在1000個(gè)測(cè)定結(jié)果中超過3SD（99.7%可信限）的結(jié)果不多于3個(gè)。如以±3s為失控限，假失控的概率為0.3%。,“假陽性”的統(tǒng)計(jì)學(xué)室內(nèi)質(zhì)控方法,基于日常檢驗(yàn)的陽性率比值(呈正態(tài)分布

43、)直接概率計(jì)算方法（不呈正態(tài)分布）,“即刻”質(zhì)控方法,“即刻法” 的實(shí)質(zhì)是一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,即Grubs異常值取舍法 只要有3個(gè)以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在。,室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)的評(píng)價(jià),IQC為一集體活動(dòng)，除實(shí)際測(cè)定者外，還應(yīng)有另外一人對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)檢。不能將IQC作為一個(gè)監(jiān)察方法，當(dāng)發(fā)現(xiàn)一次測(cè)定未達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)以建設(shè)性的而非批評(píng)的方式去探查失控的原因。除了將IQC數(shù)據(jù)作為日常質(zhì)控外，還應(yīng)定期評(píng)價(jià)累積數(shù)據(jù)以監(jiān)測(cè)在測(cè)定操

44、作中的長(zhǎng)期變化趨勢(shì)。評(píng)價(jià)應(yīng)定期進(jìn)行。,分析你已做的,每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析 表象與真象多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合分析 趨勢(shì)的內(nèi)在含義儀器設(shè)備的使用情況分析 維護(hù)與校準(zhǔn)周期的有效性,弱陽性質(zhì)控樣本常見的失控原因,核酸提取中的隨機(jī)誤差。如核酸提取中的丟失、有機(jī)溶劑的去除不徹底、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物的殘留等。 儀器的問題。如擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。 試劑的問題。如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活、

45、探針的純度及標(biāo)記效率和核酸提取試劑的效率等。,陰性質(zhì)控樣本的失控原因,主要為擴(kuò)增產(chǎn)物的“污染”和/或臨床標(biāo)本的核酸提取過程中發(fā)生的標(biāo)本間的交叉 “污染”,一個(gè)臨床PCR實(shí)驗(yàn)室對(duì)全年室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果的分析舉例,IQC的局限性,IQC可能測(cè)不出的誤差 測(cè)定前 　 測(cè)定中　 　測(cè)定后　 樣本鑒定不對(duì)　 樣本吸取不對(duì) 結(jié)果記錄錯(cuò)誤 樣本貯存中變質(zhì)　　 試劑加入不對(duì)此類誤差的發(fā)生率在

46、不同的實(shí)驗(yàn)室有所不同，一般要求小于 0.1%，且應(yīng)均衡地分布于測(cè)定前、測(cè)定中和測(cè)定后的不同階段。,影響臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)結(jié)果的最關(guān)鍵因素,產(chǎn)物“污染”（Carry-over)測(cè)定人員的操作：標(biāo)本混淆；貼錯(cuò)標(biāo)簽、核酸提取等試劑,避免基因擴(kuò)增檢驗(yàn)假陽性結(jié)果的措施,嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)；使用帶“濾芯”的吸頭；設(shè)立“陰性”質(zhì)控（與標(biāo)本同時(shí)處理）；使用防“污染”（含UNG）的PCR試劑；臨床“假陽性”問題：病原微生物如結(jié)核桿菌

47、經(jīng)藥物治療后已死亡，但PCR仍可為陽性，故治療結(jié)束后至少兩周內(nèi)不宜做PCR檢測(cè)。,避免基因擴(kuò)增檢驗(yàn)假陰性結(jié)果的措施,避免由于來自于標(biāo)本的血紅蛋白、肝素、某些激素或來自標(biāo)本處理中的去垢劑、有機(jī)溶劑的抑制作用的措施：（1）純化核酸；（2）標(biāo)本重復(fù)雙份測(cè)定；（3）稀釋標(biāo)本。使用“內(nèi)質(zhì)控”（Internal Control,IC)以避免由于試劑、擴(kuò)增儀或標(biāo)本處理不當(dāng)所致的假陰性；須注意的是，如果靶濃度很高，可致在靶核酸和IC之間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，而

48、使IC受抑制，此時(shí)IC可為陰性。,室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（EQA）,EQAProficiency testing (PT),EQA 的程序設(shè)計(jì),確定質(zhì)評(píng)方案,定期發(fā)放質(zhì)評(píng)樣本；要求參加質(zhì)評(píng)實(shí)驗(yàn)室報(bào)告結(jié)果的單位要一致，以便于統(tǒng)計(jì)；報(bào)告要清楚、簡(jiǎn)潔； 要求參評(píng)實(shí)驗(yàn)室在測(cè)定EQA樣本時(shí)，要以與常規(guī)樣本完全相同的方式測(cè)定； 對(duì)測(cè)定方法、試劑及儀器等歸納總結(jié)；對(duì)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定要有評(píng)價(jià)； EQA報(bào)告要迅速及時(shí)。,EQA質(zhì)評(píng)樣本,樣本特征與患

49、者樣本應(yīng)盡量一致樣本濃度與試驗(yàn)的臨床應(yīng)用相適應(yīng)在樣本發(fā)放的條件下穩(wěn)定不存在不可避免的傳染危險(xiǎn)性,EQA靶值,定性測(cè)定，應(yīng)為明確的陰性或陽性定量測(cè)定，則提供參考方法值或參加實(shí)驗(yàn)室的修正均值或參考實(shí)驗(yàn)室均值或方法或歸組的方法均值,評(píng)價(jià)方法,特定參評(píng)實(shí)驗(yàn)室的評(píng)分根據(jù)其與其它實(shí)驗(yàn)室得分之間的關(guān)系，可分為絕對(duì)評(píng)分和相對(duì)評(píng)分兩種模式。 絕對(duì)評(píng)分就是根據(jù)已定的靶值對(duì)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的每份質(zhì)評(píng)樣本計(jì)分，然后再計(jì)算該次質(zhì)評(píng)的總分，以得分的高低評(píng)

50、價(jià)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室的水平。 相對(duì)評(píng)分則是將參評(píng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)評(píng)得分與所有參評(píng)實(shí)驗(yàn)室的平均分進(jìn)行比較，觀察其得分在全部參評(píng)實(shí)驗(yàn)室中所處的位置。,相對(duì)評(píng)分和絕對(duì)評(píng)分的例子,相對(duì)評(píng)分：英國(guó)NEQAs絕對(duì)評(píng)分：美國(guó)CAP,采用何種評(píng)分方法較好？,建立一個(gè)質(zhì)評(píng)體系，上述絕對(duì)評(píng)分和相對(duì)評(píng)分的方法均可以采用，其實(shí)質(zhì)內(nèi)容并無太大的差別，只不過是表現(xiàn)形式的不同，尤其是在定量測(cè)定。從室間質(zhì)量評(píng)價(jià)對(duì)改善實(shí)驗(yàn)室測(cè)定質(zhì)量的作用來看，究竟是采用上述哪一種或另外制定的評(píng)價(jià)

51、方法其實(shí)并不重要，關(guān)鍵是要有一個(gè)評(píng)價(jià)方法，從而以其為標(biāo)準(zhǔn)去評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定。,EQA對(duì)測(cè)定技術(shù)的評(píng)價(jià),使用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法全面地對(duì)方法、試劑和單個(gè)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定技術(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)指明嚴(yán)重誤差適當(dāng)時(shí)評(píng)價(jià)測(cè)定的其它方面（如測(cè)定干擾）。,EQA的局限性,參評(píng)實(shí)驗(yàn)室沒有同等的對(duì)待EQA樣本和患者樣本可能會(huì)妨礙給出不同結(jié)果的改良方法的發(fā)展在不同的EQA程序中，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的評(píng)價(jià)可能不同,染色體差異1.23%(Fujiyama A,et al.