克服了膠束流動相的缺點

1、,天津市藥品檢驗所 黃志東,微乳液相色譜法在藥物分析中的應用,,主要討論的內(nèi)容:1.微乳液的定義、結構與特征及其制法2.微乳液相色譜的特點、分離機制和影響因素 3.微乳液相色譜的應用4.展望,,1.微乳液的定義、結構與特征及其制法1.1 定義 由表面活性劑、助表面活性劑(通常為醇類)、油(通常為碳氫化合物)和水(或鹽水)在合適的比例下自發(fā)形成的熱力學穩(wěn)定、各向同性、 低黏度、外觀透明或半透明、粒

2、徑在10～100nm的分散體系。,,1.微乳液的定義、結構與特征及其制法1.2 結構與特征 結構： 根據(jù)連續(xù)相和分散相的成分，均一單分散的微乳液又可分為水包油(O/W)即正相微乳液(也就是正相微乳液與過量的水相共存)和油包水(W/O)即反相微乳液(也即反相微乳液與過量油共存)。 微乳液具有及其多變的微觀結構，而且隨著客觀條件的改變，不同類型的微乳液之間可以相互轉(zhuǎn)變。,,1.微乳液的定義、結構與特征及

3、其制法1.2 結構與特征 特征： 微乳液的粒徑介于膠束和宏觀乳液之間,乳液一般大于100nm，膠束則小于10nm；用電子顯微鏡觀察微乳液時，發(fā)現(xiàn)顆粒越細,分散度越窄,而一般的乳液的粒徑分布較寬，既顆粒大小非常懸殊；微乳液一般為澄清、透明或者半透明的分散體系，有的有乳光，而一般的乳液通常為不透明的乳白色；微乳液穩(wěn)定性好，長時間放置也不會分層和破乳,若將其放在100個重力加速度的超速離心機中旋轉(zhuǎn)幾分鐘也不會分

4、層，而乳液則會分層；微乳液具有超低界面張力的性質(zhì)。,,1.微乳液的定義、結構與特征及其制法1.3 制法 首先要通過三元相圖找出微乳區(qū)域，從而確定各成分的用量范圍。確定各組分比例后，再行制備。 微乳液的制法有兩種:一種是把烴、水、乳化劑混合均勻，然后向該乳液中滴加醇，在某一時刻體系會突然間變得透明，這樣獲得了微乳液，即Schulman法；另一種是把烴、醇、乳化劑混合為乳液體系，向該乳液中加入水，體系也會在瞬間

5、變成透明，即Shah法。還有文獻報道另一種方法是不加醇，而是加入某種強極性單體，如丙烯酰胺、三甲基氯化銨等，在選擇適當乳化劑的情況下，也能得到微乳液。文獻報道將混合后的微乳體系超聲30 min，有助于促進各成分的分散，制得的微乳更加穩(wěn)定。實驗發(fā)現(xiàn)，除超聲外，有的微乳體系需要靜置足夠的時間才能形成（與溫度有關）。為了防止油相的揮發(fā)，混合應該在密閉容器中進行。,,2.微乳液相色譜的特點、分離機制和影響因素2.1 特點

6、 微乳液相色譜通常分為O/W(正相微乳液相色譜)和W/O (反相微乳液相色譜)兩種模式。 以微乳作為流動相的HPLC 的特點是：微乳能對疏水性組分增溶,有利于復雜樣品(溶解度、酸堿性和極性差別很大的藥物)的分離分析，應用范圍寬； 用常用流動相通常需要進行梯度洗脫的樣品，用微乳流動相等梯度洗脫即可完成分析， 降低了分析成本，縮短了分析時間 ；以微乳為流動相，可控操作參數(shù)較多，容易改善溶質(zhì)的保留行為，提高了分離度

7、。 此外，微乳的光學透明性可以使用紫外末端吸收波長(最低可達190nm)分析無生色團的樣品。 微乳流動相對溫度變化不敏感，色譜峰重現(xiàn)性好。,,2.微乳液相色譜的特點、分離機制和影響因素2.2 分離機制 使用微乳做流動相時,表面活性劑分子單體可以吸附在固定相表面。溶質(zhì)在修飾后的固定相、水相和微乳液滴三相間轉(zhuǎn)移,類似于膠束液相色譜(MLC)中的三相平衡。但由于微乳中的助表面活性劑和油相分子可以置換吸附在固定相表面的

8、表面活性劑,所以，兩種色譜的三相平衡基礎是不同的。 以膠束為流動相的HPLC，表面活性劑在固定相表面上形成吸附層，因此，傳質(zhì)速率低，柱效較低。微乳HPLC的分離機制與膠束色譜相同，但由于加入的助表面活性劑從固定相表面上釋放表面活性劑，加速傳質(zhì)，克服了膠束流動相的缺點，溶質(zhì)或從水相或從固定相分配進入含油液滴，更有利于提高色譜的分離能力。,,2.微乳液相色譜的特點、分離機制和影響因素2.3 影響因素2.3.1 對

9、于O/W 型微乳液相色譜 2.3.1.1 表面活性劑的濃度和類型 在微乳形成的濃度范圍內(nèi), 隨著表面活性劑濃度的增加, 微乳液滴的體積增加。但吸附有表面活性劑單體的固定相性質(zhì)不受其濃度影響，因此不影響溶質(zhì)與固定相的相互作用，只影響那些與微乳液滴有相互作用的溶質(zhì),即親脂化合物的保留降低,而不分配進入油滴的親水性成分不受影響。改變表面活性劑類型，會使固定相吸附層的性質(zhì)和微乳液滴的大小及表面電荷均發(fā)生變化，從而改

10、變?nèi)苜|(zhì)和微乳及溶質(zhì)和固定相之間的分配，影響分離的選擇性；離子型表面活性劑的電荷性質(zhì)還影響溶質(zhì)與液滴、溶質(zhì)與固定相吸附層之間的靜電相互作用,而且?guī)д?、負電荷的表面活性劑與固定相的結合作用有可能不同，對離子型化合物的分離影響較大。與本清源SDS相比,當使用非離子型的吐溫類做表面活性劑時，含羧基類化合物的保留增加。使用DTAB等陽離子表面活性劑時中性化合物峰型變差，洗脫順序也與用SDS時不同。,,2.微乳液相色譜的特點、分離機制

11、和影響因素2.3 影響因素2.3.1 對于O/W 型微乳液相色譜 2.3.1.2 助表面活性劑的濃度和類型  助表面活性劑一般為短鏈醇，常用的有丙醇、丁醇、戊醇和丙二醇等。助表面活性劑含量增加對組分保留的影響不及表面活性劑，但其類型不同對分離的選擇性影響較大。丁醇可以在微乳油滴與外層水相的界面上進行分布，使微乳體積增加，但可能存在容量的限制,低于最大量時,對組分保留影響不大；超過此限量時，由于丁

12、醇不能再與液滴結合而進入水相，增加了流動相中有機相的比例，使疏水性物質(zhì)的洗脫加快。在3.3%SDS、0.8%辛烷和丁醇組成的微乳里,丁醇的最大容量可能是9%;而在2.85%SDS膠束溶液中，丁醇的最佳含量是5%(w/w)。,,2.微乳液相色譜的特點、分離機制和影響因素2.3 影響因素2.3.1 對于O/W 型微乳液相色譜 2.3.1.3 油相的濃度和類型  油相對中性疏水物質(zhì)的影響較大。一方面，油相

13、的加入可以增加流動相中有機相的比例，使保留時間縮短；另一方面，油相分子也可以部分分配到固定相上,使固定相的極性也變小,因而使得化合物保留和選擇性的變化更復雜。由于油相在水包油型微乳中所占比例較小(＜1%)，油相在色譜分離中的作用還有待深入考察。無疑，油相的加入對增加疏水性化合物的溶解性是有顯著作用的，因而對強疏水性的化合物的洗脫有利。,,2.微乳液相色譜的特點、分離機制和影響因素2.3 影響因素2.3.1 對于O/W

14、 型微乳液相色譜 2.3.1.4 水相pH值和離子強度  對于弱酸弱堿性化合物，pH 值影響其解離型和游離型的平衡關系，因而影響其在固定相和流動相的分配。 對酸類來說，pH 降低時游離型比例增大，保留時間延長，這與常規(guī)液相結果是類似的，而中性化合物如萘則不受pH變化的影響。 水相中離子強度大有利于較高水含量的微乳的形成。有人用SDS-丁醇-辛烷-0.01 mol/L 硼酸鈉微乳體系做流動相, 在梯

15、度洗脫方式下分離一系列堿性藥物。在水含量較高的起點，產(chǎn)生很強的紫外吸收信號, 表明兩相混合時引起了微乳結構的破壞。用0.5 mol/L NaCl溶液代替水后,噪音信號降低,表明微乳保持穩(wěn)定。,,2.微乳液相色譜的特點、分離機制和影響因素2.3 影響因素2.3.1 對于O/W 型微乳液相色譜 2.3.1.5 固定相的影響  固定相的填料類型、孔徑大小、柱子長短都會對分離產(chǎn)生影響。據(jù)報道，由于膠束的直

16、徑與普通液相填料的孔徑相當，膠束溶液做流動相時,在填料的孔隙內(nèi)部停留的溶質(zhì)不易洗脫;使用大孔徑的色譜柱填料可增加膠束溶液的洗脫能力,使用短柱或滲透性更好的整體柱能增加洗脫速度而不影響柱效。微乳液滴的直徑比膠束大10倍左右(這與油相的加入量有關),固定相的孔徑對分離效率的影響可能更為明顯。Altria等 聯(lián)合應用微乳流動相和整體柱對藥物進行分離，表明整體柱可以減少柱后壓,增加流速以縮短分離時間。但整體柱應用于MELC，其在柱效

17、方面的變化尚需進行深入研究。,,2.微乳液相色譜的特點、分離機制和影響因素2.3 影響因素2.3.1 對于O/W 型微乳液相色譜 2.3.1.6 其它因素  MELC 對于樣品溶劑和柱溫變化不太敏感，但柱溫升高一般可加快溶質(zhì)的質(zhì)量轉(zhuǎn)移，提高分離效率。加入離子對試劑或環(huán)糊精等,可改變分離的選擇性。采用梯度洗脫方式，能使被測物涵蓋更大的極性和溶解性范圍,分析速度也加快,適于復雜樣品的分離。而且因為增加微

18、乳液滴的濃度不會改變固定相的結構和組成，使用微乳做流動相進行梯度洗脫時,兩次進樣之間不需要再平衡，比有機溶劑/水系統(tǒng)的梯度分離節(jié)省時間。 有報道研究了在辛伐他汀的雜質(zhì)色譜分離過程中,微乳流動相的結構和界面性質(zhì)對其所產(chǎn)生的影響:色譜分離優(yōu)化過程中使用具有最小粒徑和薄膜厚度,最低表面張力的微乳,結果發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)和固定相之間的疏水性相互作用、微乳流動相的微觀結構特性對分離辛伐他汀和雜質(zhì)的色譜行為產(chǎn)生顯著影響。,,2.微乳液相色

19、譜的特點、分離機制和影響因素2.3 影響因素2.3.2 W/O微乳液相色譜 盡管MELC的第一篇文獻報道采用的是W/O型微乳做流動相,到目前為止，W/O MELC的研究很少，可能與其粘度大，柱壓過高有關。Berthod等研究50種不同組成比例的AOT-水-庚烷微乳體系對4-硝基苯甲酸和4-硝基苯酚的保留行為的影響時，發(fā)現(xiàn)兩者的保留因子與微乳的理化結構參數(shù)MW/AOT(水與AOT的摩爾比)緊密相關。最近;Altr

20、ia等以SDS-庚烷-戊醇-醋酸鈉緩沖液組成的W/O型微乳體系為對象，較為系統(tǒng)的研究了微乳的組成和柱溫、流速等操作參數(shù)對萘、4-羥基乙酰基苯酮、對乙酰氨基酚和煙酰胺分離的影響.結果發(fā)現(xiàn)庚烷相對于己烷和十二烷，可在相對短的時間給出最好的分離;助表面活性劑(醇類)碳鏈長度增加，保留時間和分離度都增加;表面活性劑種類影響分離選擇性,中性表面活性劑和離子型表面活性劑混合使用可降低前者極性頭部基團的排斥作用,產(chǎn)生更大的液滴,使水溶性溶

21、質(zhì)更容易進入水核，保留時間降低；在形成穩(wěn)定微乳的條件下,水含量變化對保留因子和分離度影響不大，但水含量高時微乳體積大,粘度大，柱壓增加；低流速和高柱溫可改善分離。,,3.微乳液相色譜的應用3.1 復雜混合物的分離 由于微乳體系對親脂性和親水性化合物均有較強的溶解能力，溶質(zhì)與微乳液滴及固定相吸附層之間存在著疏水、氫鍵、靜電等多種作用力，MELC適用于復雜混合物的分離。有人用2%SDS-10%丁醇-1%辛醇-含0.3

22、%三氟乙酸的0.02 mol/L磷酸溶液體系，10 min內(nèi)分離了9種化合物，包括4種堿性的抗高血壓藥物（阿替洛爾、醋丁洛爾、納多洛爾、噻嗎洛爾）、4種酸性的非甾體抗炎藥物（呋塞米、布美他尼、布洛芬、奈普生）和1種中性化合物萘。Marsh等使用3.3%SDS-6.6%丁醇-0.8%辛醇-0.05%三氟乙酸微乳體系，用等度洗脫方式成功分離了4個中性（倍氯米松、氟地松、氫氯噻嗪、芘）、3個堿性（地喹氯銨、阿替洛爾、布比卡因）、

23、2個酸性（頭孢氨芐、亞葉酸鈣）和 1個兩性化合物（灰黃霉素）。分析時間為14min。以上混合物均為標準混合物，實際樣品的分析尚未見報道。,,3.微乳液相色譜的應用3.2 制劑分析 　　 穩(wěn)定性考察是制劑分析中的一個重要內(nèi)容，所建方法要能夠?qū)⒑铣傻幕蚪到獾碾s質(zhì)從主成分峰和輔料峰中分開。MELC在穩(wěn)定性研究中的潛力已被多種化合物的測定所證實。Marsh等使用質(zhì)量分數(shù)在0.0211～0.0775g/L內(nèi)的5種樣品溶液進行

24、線性試驗，線性良好。兩種 500 mg 萘普生片的分析結果是527.89和502.84mg。此外，他們用梯度方法分離了過期變質(zhì)的雷尼替丁、強烈破壞的甲氧萘丙酸以及沙美特羅和氟地松混合樣品, 所有雜質(zhì)與主藥峰和輔料峰分離良好。ElSherbiny等用0.15 mol/L SDS- 10%丙醇- 1% 辛醇-0.02%磷酸(0.3%三乙胺, pH 7.0)微乳分離了氟桂利嗪和它的4個降解產(chǎn)物。Malenovic等采用全因素設計，

25、得到優(yōu)化的微乳體系2.2%SDS- 7%丁醇- 1%辛醇-89.9% Na2HPO4(0.025 mol/L, pH 7.0),用其分離了辛伐他汀和它的６個相關雜質(zhì)，所用色譜柱為X Terra(4.6mm×50mm，3.5μm)。,,3.微乳液相色譜的應用3.3 分析水不溶性化合物的能力 　　 疏水性強的化合物由于在水中溶解度低,當采用反相HPLC分析時，會受到許多限制。微乳流動相雖然含有高比例的水

26、,但微乳液滴的疏水性環(huán)境能夠溶解不溶于水的組分。以SDS-正丁醇-辛醇為微乳流動相,1.5ml/min的流速，采用Phenomenex Luna C18(4.6mm×100mm，3μm)柱,對數(shù)種疏水性化合物進行分析。其中疏水性較強的蒽、萘、芘和硫酸氯喹可在13min洗脫。對含有BDP、對羥基苯甲酸丁酯、FP、芘和羥萘沙美特羅等不溶性化合物的混合物也成功地進行了分離，分析時間僅為10min。增加表面活性劑和助表面活

27、性劑的含量，使油的含量從0.8% 增加到2%，微乳流動相的疏水性則更強，能夠較快地洗脫水不溶性化合物。使用這種組成的微乳，BDP可在3min內(nèi)洗脫，而油的含量為0.8% 時，BDP在6.2min才能被洗脫。,,3.微乳液相色譜的應用3.4 生物樣品分析 盡量簡化樣品的前處理步驟一直是生物樣品分析工作者們努力的方向之一，而直接進樣分析的方法無疑是最簡單最受歡迎的。直接進樣不但可以節(jié)省大量分析時間和樣品及溶劑的用量，也可

28、減少實驗誤差，提高測定結果的準確度。由于微乳可溶解蛋白，用微乳做流動相時可以實現(xiàn)直接進樣分析生物體液樣品的目標。Jancic等采用1.0%二異丙基醚-2.0%SDS-6.0%丙醇-91% Na2HPO4(0.025 mol/L, pH 2.8)微乳體系和Backerbond ENV (150mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱，將血漿樣品經(jīng)簡單稀釋后，直接進樣，分離測定了佛西諾普利的代謝產(chǎn)物佛西諾普利拉。所建方法滿

29、足FDA生物樣品分析方法確證的要求，測定的血漿藥物濃度范圍為0.4 ～ 27 mg/L。EISherbiny等用2%SDS-10%丁醇-1%辛醇-0.02 mol/L磷酸溶液（含0.3% 三乙胺) 微乳，將血漿和尿中的布美他尼和醋丁洛爾簡單稀釋(1∶1)并離心后，直接進樣，熒光法檢測，血漿和尿中的布美他尼和醋丁洛爾的檢出限/定量限分別是0.02和0.1 mg/L、1和5 mg/L。值得注意的是，這種直接進樣方法雖然簡單，但因

30、為沒有樣品濃縮過程，只有在樣品濃度較高時才能采用。,,4.展望 微乳體系可看做是一種修飾后的膠束溶液，即親脂性的油相溶解在膠束里。同MLC(膠束液相色譜)一樣，MELC 也具有許多優(yōu)于普通色譜的特點，如有機溶劑用量較少，低成本，低污染；對親水性和親脂性化合物都具有較強的溶解能力，在一種色譜條件下能夠同時分離酸性、堿性和中性化合物；梯度洗脫不需要柱的再平衡過程；血漿樣品可直接進樣分析等。此外，與 MLC相比，MELC中

31、可調(diào)節(jié)的操作參數(shù)更多，分離機制更加復雜，可為復雜混合物的分離提供多種選擇方案；在O/W 微乳體系中，油相的加入使微乳的結構較剛性的膠束松散，液滴尺寸增加，親脂性物質(zhì)更容易進入微乳內(nèi)核，因而洗脫更快；微乳中的助表面活性劑也可以置換吸附在固定相上的表面活性劑，由表面活性劑的吸附所引起的膠束液相色譜的柱效降低可能在微乳體系下得到改善。作為常規(guī)色譜的補充，它的優(yōu)勢在于對于復雜組分的分離分析，特別是對于疏水性物質(zhì)的增溶作用，使其在多組

32、分分離分析中具有廣闊的應用前景。但對其分離機制的研究還只是初步的探討，未能從分子作用機制的基礎上加以解釋。因此，MELC在分離機制、微乳組成及其理化結構對分離的影響、組分的定量保留與結構關系以及中藥分離等方面都存在很大的研究空間.此外，由于微乳的類生物膜結構，預計其在藥物膜通透性和活性預測方面也能發(fā)揮重要的作用。由于微乳只在特定的相圖區(qū)域內(nèi)形成，確定微乳的處方組成是制備微乳流動相的難點，而大量表面活性劑造成的微乳液相色譜與質(zhì)